RP WPRWADZENIE M. Kamiński PG WCh Gdańsk 2013 Układy faz odwróconych RP-HPLC, RP-TLC gdy: Nisko polarna (hydrofobowa) faza stacjonarna, względnie polarny eluent, składający się z wody i dodatku organicznego; Ze wzrostem zawartości dodatku organicznego w eluencie rośnie siła elucyjna f. ruchomej!!! - Zmiana jednego składnika organicznego eluentu na inny wpływa na retencję i może wpływać na selektywność rozdzielania; - Dla przewidywania retencji i selektywności rozdzielania ma znaczenie przede wszystkim hydrofobowość substancji rozdzielanych, ale także w znacznie mniejszym stopniu -elektrodonorowość i elektroakceptorowość, polarność i polaryzowalność oraz wiązania wodorowe między cząsteczkami substancji chromatografowanych i cząsteczkami eluentu, a także częścią polarną powierzchni sorpcyjnej; Fazy stacjonarne dla RP-HPLC: typu C18, C8, PHENYL, CN (wypełnienie typu CN może być też używane w układach faz normalnych, zarówno w warunkach adsorpcyjnych, jak i HILIC) 1
Retencja w RP jest wypadkową wielu oddziaływań: - sił van der Vaalsa pomiędzy hydrofobową fazą stacjonarną, a cząsteczkami substancji rozdzielanych / organicznych składników eluentu Kolejność elucji w RP-HPLC Jony/woda, polarne substancje organiczne -o niskiej, średniej, wysokiej hydrofobowości grup funkcyjnych; - sił elektrostatycznych pomiędzy cząsteczkami substancji rozdzielanej, zawierającej polarne grupy funkcyjne i cząsteczkami fazy ruchomej - sił van der Vaalsa pomiędzy cząsteczkami substancji rozdzielanej i fazy ruchomej - oddziaływań elektrostatycznych pomiędzy cząsteczkami substancji rozdzielanej i fazy ruchomej, a powierzchniowymi grupami -H lub - tam, gdzie to możliwe ma miejsce tworzenie kompleksów z metalami, występującymi w stężeniach śladowych na powierzchni fazy stacjonarnej Różne grupy funkcyjne o różnej hydrofobowości powodują zróżnicowanie retencji, dlatego rozdzielanie grupowe nie jest możliwe. - sole i kwasy nieorganiczne, alkanoloaminy (brak sorpcji), cukry, aminy, aminokwasy, kwasy karboksylowe, aldehydy, alkohole, etery cykliczne, estry, etery di-alkilowe, tioetery, węglowodory aromatyczne, węglowodory alicykliczne, węglowodory alifatyczne, fluoroalkany 2
trzymywanie niepolarnych faz związanych typu RP Zestawienie najczęściej stosowanych rodzajów faz stacjonarnych, produkowanych na bazie żelu krzemionkowego. nitryl 3
Faza ruchoma - wymagania: 1. Ciecz obojętna chemicznie względem fazy stacjonarnej i składników rozdzielanych mieszanin. 2. Dobry rozpuszczalnik dla rozdzielanych substancji, aby nie dochodziło do ich wytrącania się w kolumnie. 3. Mała lepkość 4. Stały skład przez dostatecznie długi okres czasu 4
Szereg elucyjny w RP-LC RP - warunki izo-elucyjne woda < < < < metanol < acetonitryl < etanol < propanol < tetrahydrofuran < chlorek metylenu 5
Chromatogram 16-tu WWA waruynkielucji gradientowej WWA Wykres zależności stężenia substancji w eluacie wypływającym z kolumny w funkcji objętości elucji - dla stałego natężenia przepływu eluentu (w, u = const) w funkcji czasu 1 2 3 4 5 6 7 pis każdego chromatogramu powinien zawierać: - cel badania, dane o dozowanej / rozdzielanej mieszaninie, kolumnie, warunkach elucji (składniki i skład eluentu, albo składniki eluentu i program elucji), informacje o detektorze / detektorach, warunki detekcji, nazwy substancji odpowiadających pikom chromatograficznym, ew. inne dane Kolumna Lichrospher RP 18 125mmx4mm 5µm, CH3CN-H2 75-25 v/v, 1.5 ml/min, UV-DAD 220-400 nm; piki: 1-(?), 2-benzen, 3- naftalen, 4-acenaften, 5-fenantren, 6-piren, 7-benzo (α) piren. 6
Kolejność elucji Związki eluują od polarnych (hydrofilowych) do niepolarnych (hydrofobowych) oraz od w szeregach homologicznych od nisko- do wysokocząsteczkowych Chromatografia sorpcyjna adsorpcyjna / podziałowa / mieszana -- wprowadzenie -- Układy RP / HIC Układy NP / NP-w / HILIC Mechanizmy sorpcji i oddziaływania między-cząsteczkowe 7
o- m- p- H N + H N + H N + H H H N H NH 2 NH 2 H 3 C H 3 C etylowy propylowy 8
Si Si Si Si H H IzoH C H 3 IzoH CH3 Si NP Si Si Si H H C H 3 CH3 Si Si H H IzoH IzoH Si Si H H Si Si Si H NP Si H faza stacjonarna: Si 2 Si Si Si H H IzoH faza stacjonarna: Si 2 faza ruchoma: Heksan+IzoH Si Si Si H H faza ruchoma: C 6 H 14 : C 4 H 8 2 heksan: dioksan 8:2 v/v 9
Schemat struktury powierzchni modyfikowanego żelu krzemionkowego 10
H Si Si Si Si Si Si Si CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 H 2 H 2 C H 3 C H 3 H 2 H RP H faza stacjonarna: Si 2 /C n H 2n+1 faza ruchoma: MeH/ H 2, 1:1 Retencja substancji rośnie ze wzrostem: stopnia pokrycia powierzchni związaną fazą organiczną długości łańcucha fazy związanej hydrofobowości grupy funkcyjnej decydującej o charakterze powierzchni sorpcyjnej hydrofobowości substancji rozdzielanych zawartości wody w fazie ruchomej Spada ze wzrostem : temperatury Dla substancji kwaśnych / zasadowych zależy od ph (spadek ph zwiększa retencję substancji kwaśnych, w wzrost ph substancji zasadowych dlaczego???) 11
Przewidywanie teoretyczne retencji analitów w warunkach RP-HPLC 12
Model liniowej siły elucyjnej (linear solvent strength model - LSS) QUANTITATIVE STRUCTURE RETENTIN RELATINSHIPS (QSRRs) lg k = lg kw sφ, gdzie: k- współczynnik retencji Lg kw- wartość ekstrapolowana do 0% rozpuszczalnika organicznego w fazie ruchomej s- stała φ- objętość rozpuszczalnika organicznego w fazie ruchomej 13
MULTIPLE LINEAR REGRESSIN METHDS (METDY WIELKRTNEJ REGRESJI LINIWEJ) 1. Teoria Martin a i Synge a tr = b0 + b1c log P, gdzie: tr czas retencji analitów w warunkach izokratycznych b0, b1 współczynniki regresji clog P współczynnik podziału n-oktanol : woda 2. Teoria Kaliszana tr = b0 + b1µ + b2δmin + b3awas., gdzie b0, b1, b2, b3 współczynniki regresji µ całkowity moment dipolowy (oddziaływania typu dipol dipol) δmin nadwyżka ładunku elektrycznego atomu najbardziej elektroujemnego (oddziaływania polarne) Awas water accessible surface area (oddziaływania dyspersyjne) 14