Uniwersytet Warszawski Wydział Biologii Sylwia Czarnomska Wpływ struktury krajobrazu na przestrzenną zmienność genetyczną populacji myszy leśnej Apodemus flavicollis w północno wschodniej Polsce Autoreferat rozprawy doktorskiej wykonanej w Instytucie Biologii Ssaków Polskiej Akademii Nauk w Białowieży Przewód doktorski przeprowadzony na Wydziale Biologii Uniwersytetu Warszawskiego Promotor: prof. dr hab. Bogumiła Jędrzejewska Recenzenci: prof. dr hab. Michał Kozakiewicz prof. dr hab. Mirosław Ratkiewicz Białowieża Warszawa 2015
Wstęp Większość populacji, nawet gatunków pospolitych i równomiernie rozmieszczonych, wykazuje pewien przestrzenny wzorzec struktury genetycznej. Wzorzec ten może być konsekwencją wydarzeń historycznych, wpływu czynników środowiskowych oraz uwarunkowań biologicznych, takich jak wielkość populacji i struktura socjalna. Mysz wielkooka leśna Apodemus flavicollis jest gatunkiem powszechnie występującym w lasach umiarkowanych Europy Środkowej. Ma większe, niż inne gatunki drobnych ssaków, zdolności do pokonywania barier migracyjnych. Głównym celem pracy było poznanie struktury genetycznej populacji myszy leśnej w lasach północno-wschodniej Polski oraz określenie roli czynników ekologicznych w jej ukształtowaniu. Szczegółowe cele pracy obejmowały: określenie poziomu zmienności genetycznej oraz przestrzennej struktury genetycznej wykorzystując sekwencje mitochondrialnego DNA oraz markery mikrosatelitarne, analizę zależności filogenetycznych pomiędzy wykrytymi haplotypami mtdna, identyfikację czynników odgrywających największą rolę w kształtowaniu wykrytego wzorca zmienności przestrzennej. Teren badań, materiał i metody W latach 2004-2008 badaniami objęto obszar siedmiu puszcz północno-wschodniej Polski (Augustowska, Białowieska, Borecka, Knyszyńska, Mielnicka, Piska, Romincka) oraz małych kompleksów leśnych wzdłuż trzech transektów pomiędzy czterema puszczami (Augustowska- Knyszyńska, Knyszyńska-Białowieska, Białowieska-Mielnicka). Łącznie pobrano próby genetyczne od 820 odłowionych osobników, a do analiz statystycznych użyto 768 genotypów (ustalonych w 13 loci mikrosatelitarnych) oraz 353 sekwencji fragmentu (247 pz) mitochondrialnego genu cytochromu b. W celu identyfikacji czynników mających wpływ na obserwowaną strukturę genetyczną populacji dla każdego punktu odłownego określono szereg zmiennych środowiskowych (powierzchnia leśna, udział lasów liściastych, mieszanych, iglastych, dane klimatyczne) wykorzystując zbiory danych (Corine Land Cover 2006, MODIS) i narzędzia GIS (Systemu Informacji Geograficznej). Wskaźnik zagęszczenia populacji myszy oszacowano, przeliczając liczbę odłowionych osobników na 100 pułapkonocy. 2
Wyniki Mitochondrialne DNA Na podstawie analizy 353 sekwencji wykryto 24 haplotypy mtdna ustalone na podstawie 22 miejsc polimorficznych. Większość haplotypów (75%) nie była wcześniej stwierdzona przez innych badaczy, natomiast 4 najliczniejsze haplotypy były znane wcześniej i szeroko rozpowszechnione w Europie. Zaledwie 6 haplotypów miało frekwencję wyższą niż 5% w badanej populacji. Analizy zależności między haplotypami wykazały obecność wyraźnych 2 kladów ze słabiej zaznaczonym trzecim kladem. Uzyskana sieć filogenetyczna haplotypów skonstruowana przy użyciu algorytmu median joining (Ryc.1) charakteryzowała się podziałem na dwa główne kłady o topologii gwiazdy. Większość haplotypów (z wyjątkiem haplotypów H5, H8, H12, H18, H23 należących do kladu trzeciego oraz H16 i H19 z kladu drugiego) różniła się od haplotypów centralnych jedynie o kilka substytucji (Ryc.1). Klad 1 był liczniejszy, a haplotyp centralny H7 cechowała jedna z najwyższych frekwencji w północno-wschodniej Polsce oraz duże rozpowszechnienie w Europie. Analiza struktury przestrzennej w oparciu o frekwencję haplotypów mtdna wykazała obecność 5 grup i wyodrębniła myszy z Puszczy Piskiej jako najbardziej odizolowaną genetycznie subpopulację. Myszy z Puszcz Boreckiej, Rominckiej i Białowieskiej stanowiły trzy odrębne grupy genetyczne, natomiast pozostałe osobniki z Puszczy Augustowskiej, Knyszyńskiej i Mielnickiej oraz trzech transektów stanowiły jedną subpopulację (Ryc. 2). Intensywny przepływ genów został wykryty pomiędzy lokalnymi populacjami w obrębie każdej z wyodrębnionych grup przestrzennych. Rozmieszczenie większości haplotypów nie było specyficzne dla poszczególnych lokalizacji, jednak wykryto znaczące różnice w ich frekwencji pomiędzy puszczami. Haplotypy znalezione w północnej części badanego regionu (Puszcze Romincka, Borecka, Piska) miały ograniczone występowanie, a H21, H20, H19 wykryto tylko w Puszczy Rominckiej. W przeciwieństwie do pojedynczych haplotypów klady mtdna posiadały wyraźny wzorzec przestrzenny (Ryc.2). Klad 1 dominował w południowej części badanego regionu (stanowił 84% haplotypów w Puszczy Białowieskiej (S5)). Klad 2 był najliczniejszy w północno-zachodniej części (78% w Puszczy Piskiej (S1) natomiast klad 3 miał najwyższą frekwencję w grupie S4 34%. Subpopulacje znacząco różniły się obserwowanym poziomem różnorodności genetycznej, z najwyższym obserwowanym w S3 (Puszczy Romincka) oraz S4, grupie zawierającej najwięcej osobników. 3
Ryc.1. Sieć filogenetyczna haplotypów skonstruowana z wykorzystaniem algorytmu median-joining w programie NETWORK i haplotypów wykrytych w tych badaniach. Kolory czerwony i niebieski oznaczają odpowiednio klad 1 i klad 2. Zielona linia otacza klad 3. Poprzeczne linie oznaczają liczbę mutacji pomiędzy haplotypami. 4
Ryc. 2. Subpopulacje (S1 S5) myszy leśnej w północno-wschodniej Polsce ustalone na podstawie frekwencji haplotypów mtdna w programie SAMOVA (lewy panel). Proporcja kladów mtdna w każdej subpopulacji. Klad 3 zaznaczony kolorem zielonym jako część kladu 1 (prawy panel). Czerwone punkty oznaczają lokalizacje punktów odłownych. Markery mikrosatelitarne Polimorfizm jądrowego DNA był bardzo wysoki we wszystkich badanych kompleksach leśnych z liczbą alleli wynoszącą od 15 do 32 na locus. Oczekiwana heterozygotyczność wyniosła od 0,841 do 0,869. Analiza struktury genetycznej wykazała podstawowy podział na 2 zróżnicowane genetycznie subpopulacje: północną (Puszcze Piska, Borecka, Romincka oraz północna część Puszczy Augustowskiej) oraz południową (Puszcze Augustowska, Knyszyńska, Białowieska, Mielnicka oraz trzy transekty pomiędzy nimi), która miała charakter genetycznego gradientu, a nie odrębnych genetycznie grup (Ryc. 3). Pomimo wyraźnej struktury, poziom zróżnicowania genetycznego, wyrażony współczynnikiem FST, był bardzo niski, a najwyższe wartości przyjął między Puszczą Piską i pozostałymi regionami (0,036-0,049). 5
Ryc. 3. Analiza głównych składowych (PCA) populacji myszy leśnej. Numery oznaczają region geograficzny. Wpływ czynników ekologicznych na obserwowany wzorzec zmienność genetycznej Zależność dystansu genetycznego od odległości geograficznej (ang. isolation by distance), wyliczona pomiędzy 10 badanymi regionami, była wysoce statystycznie istotna (r = 0,78, p = 0.001), natomiast na poziomie osobników zależność ta była znacznie słabsza i zachowywała liniowy charakter tylko na krótkim dystansie (~1,5 km). Miary odrębności genetycznej (współczynnik pokrewieństwa Quellera i Goodnighta, indywidualny dystans genetyczny Rousseta) wykazywały silny związek z zagęszczeniem populacji myszy, a największa zmiana w wartości tych parametrów następowała między pierwszą a drugą klasą odległości (0 i 1 km w puszczach, 0 i 5 km na transektach). Średni poziom spokrewnienia przyjął wartości od 0,027 do 0,173, najwyższe w Puszczy Augustowskiej, a najniższe w Puszczy Białowieskiej i Mielnickiej. Konsekwentnie, dystans genetyczny był najniższy dla osobników z Puszczy Augustowskiej (ar = -0,064) a najwyższy w Białowieskiej (0,078) oraz Mielnickiej (0,089). Zależność poziomu spokrewnienia od wskaźnika zagęszczenia populacji myszy była istotna statystycznie w pierwszej i drugiej klasie odległości, a w przypadku dystansu genetycznego tylko w pierwszej klasie (Ryc. 4). 6
Ryc. 4. Średnie wartości dystansu genetycznego Rousseta (a r ) oraz współczynnika pokrewieństwa Quellera i Goodnighta wyliczone dla wszystkich osobników z sześciu badanych puszcz w 3 klasach dystansu w odniesieniu do zagęszczenia populacji myszy leśnej. Szerokość geograficzna była czynnikiem, który samodzielnie wyjaśniał aż 64% struktury genetycznej (wyrażonej jako prawdopodobieństwa przypisania do jednej z dwóch grup genetycznych wyróżnionych przez program STRUCTURE dla k = 2), natomiast tylko 22% w przypadku frekwencji haplotypów mtdna. 7
Przy zastosowaniu uogólnionych modeli liniowych (GLMs) zbadano wpływ czynników środowiskowych (średnia temperatura stycznia i lipca, udział powierzchni leśnej, udział lasów liściastych i mieszanych) na frekwencję haplotypów mtdna należących do kladu 2. Najlepsze modele (wybrane przy pomocy kryterium informacyjnego Akaike go) wyjaśniały od 10 do 14% obserwowanej zmienności i tylko średnia temperatura stycznia była czynnikiem obecnym we wszystkich modelach. Analogiczne analizy z użyciem prawdopodobieństwa przypisania do jednej z dwóch grup genetycznych wyróżnionych przez program STRUCTURE (k = 2) pozwoliła na wyodrębnienie 2 modeli. Model zawierający wszystkie 4 badane zmienne posiadał bardzo wysokie prawdopodobieństwo bycia właściwym (ω i = 0,77), a wszystkie zmienne z wyjątkiem udziału lasów liściastych i mieszanych były wysoce istotne statystycznie (p < 0.001) Wpływ średniej temperatury stycznia na obserwowany wzorzec zmienności genetycznej został dokładniej przeanalizowany. Wykazano, że temperatura stycznia wykazywała silny związek z frekwencją kladu 2 (R 2 = 0,38, p = 0,004), jeśli analizowano osobno dane z każdego roku. Podobnie było w przypadku DNA jądrowego (R 2 = 0,39, p = 0,003, Ryc. 5). Ryc. 5. Zależność pomiędzy średnią temperaturą stycznia wyliczoną dla każdego roku odłowów w każdym geograficznym regionie oraz proporcją haplotypów mtdna z kladu 2 (lewy panel) oraz wartością przypisania do subpopulacji 2 (k = 2) na podstawie analiz wykonanych w STRUCTURE (prawy panel). 8
Wnioski (1) Analizy wykrytych 24 haplotypów mtdna wykazały, że na terenie północnowschodniej Polski sympatrycznie występują trzy europejskie klady myszy leśnej. (2) Na podstawie analizy, uwzględniającej rozmieszczenie oraz frekwencję haplotypów mtdna, ustalono obecność 5 grup genetycznych z najbardziej odrębną populacją zamieszkujacą Puszczę Piską. Intensywny przepływ genów został wykryty pomiędzy lokalnymi populacjami w obrębie każdej z wyodrębnionych grup przestrzennych. (3) Bardzo wysoka zmienność jądrowego DNA, wyrażona bogactwem alleli, była obserwowana we wszystkich badanych regionach niezależnie od wielkości kompleksu leśnego oraz udziału siedlisk optymalnych dla gatunku. (4) Podstawowy podział na 2 zróżnicowane genetycznie subpopulacje miał miejsce między północną (Puszcze Piska, Borecka, Romincka oraz północna część Puszczy Augustowskiej) oraz południową częścią badanego obszaru (Puszcze Augustowska, Knyszyńska, Białowieska, Mielnicka oraz trzy transekty pomiędzy nimi). Zmienność ta miała charakter genetycznego gradientu, jednak z wyraźnie zaznaczonymi obszarami ograniczonego przepływu genów. (5) Czynnikiem kształtującym strukturę genetyczną populacji myszy w skali północno-wschodniej Polsce był dystans geograficzny, natomiast lokalna struktura była silnie determinowana przez czynniki demograficzne (zagęszczenie populacji). (6) Wykazano brak bezpośredniego wpływu wielkości kompleksu leśnego i rodzaju siedliska na strukturę genetyczną myszy leśnej w północno-wschodniej Polsce. Stwierdzono natomiast, że różnica w jakości siedliska (udział lasów liściastych i mieszanych) miała istotny wpływ na zagęszczenie myszy, a tym samym lokalną strukturę genetyczną. (7) Średnia temperatura stycznia była czynnikiem najlepiej wyjaśniającym frekwencję kladu 2 mtdna. Może to sugerować, że osobniki z haplotypem należącym do kladu 2 cechuje większa efektywność produkcji ciepła a tym samym wyższą przeżywalność w ciężkich warunkach zimowych. 9