Polimorfizm. sekwencji mitochondrialnego DNA gatunku Canis familiaris - aspekty filogenetyczne i identyfikacyjne. Anna Czarnecka

Transkrypt

1 Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy Polimorfizm sekwencji mitochondrialnego DNA gatunku Canis familiaris - aspekty filogenetyczne i identyfikacyjne Anna Czarnecka Praca wykonana pod kierunkiem: dr hab. Tomasza Grzybowskiego Katedra Medycyny SądowejS Zakład ad Genetyki Molekularnej i SądowejS

2 Nie ulega wątpliwości, Ŝe pies jest pierwszym udomowionym zwierzęciem i od wieków towarzyszy człowiekowi. Analizy znalezisk archeologicznych dowodzą, Ŝe wszędzie tam gdzie odnajdywano ślady pierwotnego człowieka, istnieją równieŝ ślady obecności psa. Czy my aby na pewno jesteśmy spokrewnieni?!? Nie ma całkowitej zgodności, co do pochodzenia gatunku Canis familiaris, a takŝe miejsca i czasu jego udomowienia. Pierwsze próby określenia filogenetycznego przodka psa wskazywały na wilka, szakala lub kojota Jednak badania porównawcze ogólnej budowy anatomicznej, behawioru oraz terytorialnego zasięgu występowania dowodzą, Ŝe pies jest duŝo bardziej spokrewniony z wilkiem niŝ z jakimkolwiek innym przedstawicielem rodziny Canidae.

3 Analizy mtdna pozwoliły na odtworzenie drzewa filogenetycznego obu gatunków i ustalono, Ŝe wyjściowym haplotypem jest haplotyp wilka szarego, od którego w wyniku mutacji oddzielił się gatunek psa domowego. Potwierdzono to takŝe w badaniach róŝnych fragmentów DNA jądrowego, które okazały się pomocne w całościowym odtworzeniu filogenezy rodziny Canidae. Lindblad-Toh K., Wade C.M. Mikkelsen T.S., Karlsson E.K., Jaffe D.B., Kamal M., Clamp M., Chang J.L., Kulbokas E.J. 3rd, Zody M.C., Mauceli E., Xie X., Breen M., Wayne R.K., Ostrander E.A., Ponting C.P., Galibert F., Smith D.R., DeJong P.J., Kirkness E. i wsp. (2005) Genome sequence, comparative analysis and haplotype structure of the domestic dog. Nature 438,

4 Najnowsze wyniki analiz mtdna wskazują Ŝe e pierwsze etapy prowadzące do udomowienia wilka miały y miejsce w południowo udniowo- wschodniej Azji skąd d gatunek psa domowego rozprzestrzenił się na cały świat. Według archeologów w miało o to miejsce lat temu, co potwierdzają wyniki analiz mtdna większo kszości badaczy. Część uczonych twierdzi jednak, Ŝe e przyjaźń psa z człowiekiem ma dłuŝszd szą historię niŝ wynikałoby to z zapisów w archeologicznych i sugerują lat.

5 Mitochondrialny DNA Do ustalenia powyŝszych faktów w duŝej mierze przyczyniła się analiza mtdna. Szczególnie istotna z punktu widzenia filogenetyki ale takŝe analizy identyfikacyjnej jest zmienność regionu kontrolnego

6 Cel pracy PoniewaŜ dotychczasowe sugestie dotyczące ce pochodzenia gatunku C. familiaris były y oparte na stosunkowo niewielkiej liczbie osobników w z populacji europejskiej, poznawczym celem niniejszej pracy było o wzbogacenie europejskiej bazy danych regionu kontrolnego mtdna,, a następnie zweryfikowanie hipotezy dotyczącej cej wschodnio azjatyckiego rodowodu psa

7 Cele cząstkowe Ustalenie sekwencji regionu kontrolnego mtdna dla badanych osobników w gatunku tj. identyfikacja Canis familiaris haplotypów z terenu Polski. wywodzących się ze Odtworzenie obrazu wschodniej zróŝnicowania Azji, które dały mtdna psów w występuj pujących w populacji polskiej początek na tle głównym g wyników w uzyskanych dla innych populacji haplogrupom występuj pującym u psów w z Próba rekonstrukcji filogenezy Europy. mtdna u psów w z Europy i Azji wschodniej z wykorzystaniem sieci haplotypów regionu kontrolnego (ang. median networks). Analiza załoŝyciela (ang. founder analysis). Analiza ta została połą łączona z datowaniem głównych g kladów i podkladów mitochondrialnych w populacjach psów w europejskich i azjatyckich za pomocą zegara molekularnego regionu kontrolnego. Próba określenia horyzontu czasowego oraz sposobu dywergencji (liczba centrów w udomowienia) wilka i psa domowego we wschodniej Azji na podstawie wyników w analizy załoŝyciela Celem pracy o charakterze aplikacyjnym było o utworzenie pierwszej sądowej s bazy danych z zakresu zróŝnicowania CR mtdna krajowej populacji psów.

8 Materiał Materiał do badań stanowiły y próbki krwi pobrane od 100 psów w niespokrewnionych w linii matczynej w trakcie rutynowych zabiegów diagnostyczno- leczniczych przez Klinikę Weterynaryjną CENTRUM w Bydgoszczy.

9 Metody Analizy molekularne 1. Ekstrakcja DNA 2. Amplifikacja mtdna 3. Oczyszczanie produktów PCR 4. Sekwencjonowanie 5. Strącanie produktów sekwencjonowania oraz porównywanie sekwencji Analizy filogenetyczne i populacyjne 1. Filogenetyczne sieci haplotypów oraz analiza załoŝyciela 2. Badanie struktury populacji Wyznaczenie podstawowych parametrów genetycznych Analiza wariancji molekularnej (AMOVA) Skalowanie wielowymiarowe MDS Wyznaczenie siły dyskryminacji

10 Dane wykorzystane w porównawczych analizach struktury populacji Populacja Europa Wielka Brytania Skandynawia Austria Azja południowo- zachodnia Turcja Azja Mniejsza Syberia Japonia Chiny Azja południowo- wschodnia Ameryka Północna Afryka Symbol EU UK SC AU ASW TU AM SYB JA CH ASE US AF Liczebnoś ć Przeprowadzenie analiz molekularnych pozwoliło na otrzymanie sekwencji mtdna. Do porównań międzypopulacyjnych wykorzystano 939 sekwencji z wcześniej opublikowanych badań. Dla potrzeb niniejszej pracy materiał ten podzielono według kryteriów geograficznych na 13 róŝnych grup

11 Haplotypy mtdna w polskiej populacji psów Uzyskane sekwencje, obejmujące fragment regionu kontrolnego pomiędzy nukleotydami a 16103, porównywano z sekwencją referencyjną, co pozwoliło na lokalizację miejsc mutacyjnych. Zaobserwowano 32 miejsca polimorficzne. W pozycjach i zaobserwowano transwersję. Delecje znaleziono w dwóch pozycjach: oraz w Najbardziej polimorficzne okazały się pozycje i W badanej próbce wyodrębniono 27 róŝnych haplotypów. Sekwencje 4 osobników nie róŝniły się od sekwencji referencyjnej. Ich haplotyp oznaczono jako KRS (Kim Reference Sequence). Pozostałym 26 haplotypom nadano oznaczenie literowe PL oraz kolejne numery porządkowe: PL1 PL26. Na podstawie nomenklatury zaproponowanej przez Savolainena zidentyfikowane haplotypy zaliczano do poszczególnych kladów. 4 haplotypy PL12,14,15 i 21 okazały się unikalne dla populacji polskiej.

12 Dla zobrazowania wewnętrznego zróŝnicowania poszczególnych kladów mtdna zidentyfikowanych w populacji polskiej sporządzono sieć haplotypów. Na jej podstawie moŝna określić, jakie są * powiązania pomiędzy poszczególnymi haplotypami i jakie mutacje doprowadziły do wyodrębnienia kolejnych haplotypów. Dzięki zastosowaniu metody mid-point rooting, która zlokalizowała korzeń w połowie najdłuŝszego odgałęzienia (pomiędzy PL17 a PL21), wskazano minimalne motywy mutacyjne, które definiują poszczególne klady (zaznaczone na Ŝółto dla kladu A, na zielono dla B i na niebiesko dla C). Haplotypy zidentyfikowane do tej pory wyłącznie w populacji psów z Polski zaliczono odpowiednio do kladu A (PL12), B (PL15, PL21) oraz C (PL14)

13 PoniewaŜ na podstawie wcześniejszych badań moŝna wnioskować, Ŝe populacje C. familiaris wywodzą się z populacji wilka szarego, a do dywergencji doszło na obszarze wschodniej Azji, w ramach niniejszej pracy podjęto próbę zidentyfikowania załoŝycieli wewnątrz kladów A, B i C oraz oceny czasu, jaki był potrzebny na zróŝnicowanie haplotypów od kaŝdego z załoŝycieli w Europie i Azji wschodniej. W tym celu skonstruowano sieć haplotypów z wykorzystaniem wszystkich dostępnych danych na temat haplotypów regionu kontrolnego mtdna naleŝących do kladów A, B i C w populacjach psów z Azji wschodniej i Europy Z sieci wynika, Ŝe w obrębie kladu A moŝna wskazać przynajmniej czterech załoŝycieli (A1-A4), podczas gdy klady B i C wywodzą się z pojedynczych węzłów. Podklady A2, A3 i A4 mają wyraźnie promienistą topologię, podczas gdy czwarty prawdopodobny podklad A1 charakteryzuje się nieco bardziej skomplikowaną strukturą.

14 Wyniki datowania Wyniki wskazują, Ŝe e wszystkie wschodnioazjatyckie podklady sąs starsze niŝ ich europejskie odpowiedniki. W przypadku niektórych załoŝycieli wiarygodne datowanie ich europejskich pochodnych nie jest moŝliwe z uwagi na zbyt małą liczbę haplotypów specyficznych tylko dla Europy (A1*, A4*, C*). MoŜna wnioskować, Ŝe e czas jaki upłyn ynął od pojawienia się tych załoŝycieli na Starym Kontynencie jest stosunkowo niewielki. Datowanie e wschodnio- azjatyckich podkladów w dostarcza wartości od lat (A1*) do lat (A4*), podczas gdy najbardziej zaawansowany wiekowo podklad w Europie (A2*) liczy tylko lat.

15 Wykres skalowania wielowymiarowego MDS Wykres MDS, wykonany na podstawie macierzy dystansów genetycznych FST, obrazuje niskie zróŝnicowanie pomiędzy wszystkimi populacjami.

16 Analiza wariancji molekularnej AMOVA Sposób grupowania A B Pomiędzy grupami ± Rozkład wariancji genetycznej (%) Pomiędzy populacjami w obrębie grup ± ± Wewnątrz populacji ± A- Wszystkie populacje świata traktowane jako jedna grupa B- Grupowanie według kryteriów geograficznych populacje europejskie (EU, PL, UK, SC, AU) populacje Azji południowo- zachodniej (ASW, TU, AM) populacje Azji środkowo- północnej (CH, SYB) populacje Azji południowo- wschodniej (ASE, JA) populacje Ameryki Północnej (US) populacje Afryki (AF) Wyniki AMOVA równieŝ potwierdzają niewielkie rozwarstwienie światowej populacji psów. AMOVA dla wszystkich populacji zebranych w jedną grupę wykazała, Ŝe 2.34% zmienności znajduje się pomiędzy populacjami a 97.66% wewnątrz populacji. Kiedy populacje pogrupowano w oparciu o geograficzne pochodzenie psów, AMOVA wskazała, Ŝe nie istnieje zmienność pomiędzy grupami oraz Ŝe 97.19% zmienności występuje wewnątrz populacji, a 3.49% pomiędzy populacjami w obrębie grup

17 Siła dyskryminacji Populacja Polska Europa Wielka Brytania Skandynawia Austria Azja południowo- zachodnia Turcja Azja Mniejsza Syberia Japonia Chiny Azja południowo- wschodnia Ameryka Północna Afryka PD Wysokie wartości PD wskazują na duŝą uŝyteczność mtdna jako markera w genetyce sądowej.

18 Wnioski W ramach niniejszej pracy wykonano pierwszy krok w kierunku syntetycznego sposobu klasyfikacji mtdna C. familiaris poprzez próbę wskazania motywów mutacyjnych definiujących główne g haplogrupy A, B i C. Konieczne jest dalsze usystematyzowanie oraz ujednolicenie nomenklatury haplogup mtdna u psów. Hierarchiczny system klasyfikacji filogenetycznej mógłby się opierać na analogicznych zasadach, jak u ludzi. Zaadoptowanie tego systemu do klasyfikacji mtdna C. familiaris wymagałoby jednak pozyskania dodatkowych danych populacyjnych o większej rozdzielczości, ci, najlepiej sekwencji pełnych genomów mitochondrialnych.

19 Wnioski Światowa populacja C. familiaris charakteryzuje się niewielkim rozwarstwieniem (strukturą). Większe zróŝnicowanie podkladów mitochondrialnych w populacji psów w z Azji wschodniej niŝ w próbkach europejskich, znajdujące odzwierciedlenie w wynikach datowania molekularnego potwierdza wcześniejsze przypuszczenia co do wschodnio-azjatyckiego pochodzenia gatunku C. familiaris. Wschodnio-azjatycki rodowód d gatunku C. familiaris,, jest znacznie późniejszy, niŝ sugerowano w najwcześniejszych niejszych pracach dotyczących cych filogenezy mtdna u psów. Główne G klady mtdna (A, B i C) mogły y powstać w Azji wschodniej mniej więcej w tym samym czasie ( lat temu), lecz w przypadku haplogrupy A nie z jednego, lecz z kilku haplotypów załoŝycielskich. Wysoka wartość siły y dyskryminacji (PD) dla populacji polskiej (99.2%) wskazuje na duŝą uŝyteczność badanego fragmentu mtdna jako markera w genetyce sądowej. s