RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 212872 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 21.0.08 0874881.1 (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 1.09. Europejski Biuletyn Patentowy /37 EP 212872 B1 (13) (1) T3 Int.Cl. C12N 1/ (06.01) C12N / (06.01) C07K 16/00 (06.01) (4) Tytuł wynalazku: Sposób wytwarzania rekombinowanego białka poliklonalnego () Pierwszeństwo: 11.09.07 US 070960002P 2.0.07 DK 070000764 29.0.07 US 070924708P 07.09.07 DK 070001292 (43) Zgłoszenie ogłoszono: 17.02. w Europejskim Biuletynie Patentowym nr /07 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: 31.03.11 Wiadomości Urzędu Patentowego 11/03 (73) Uprawniony z patentu: Symphogen A/S, Lyngby, DK PL/EP 212872 T3 (72) Twórca(y) wynalazku: LARS SOEGAARD NIELSEN, Nivaa, DK DIETMAR WEILGUNY, Virum, DK ANNE BONDGAARD TOLSTRUP, Hilleröd, DK FINN WIBERG, Farum, DK CHRISTIAN MÜLLER, Vaerloese, DK (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Marta Kawczyńska POLSERVICE KANCELARIA RZECZNIKÓW PATENTOWYCH SP. Z O.O. ul. Bluszczańska 73 00-712 Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).
2 Opis DZIEDZINA WYNALAZKU 1 2 [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy wytwarzania rekombinowanych białek poliklonalnych, takich jak białka z nadrodziny immunoglobulin, np. rozpuszczalnych lub związanych z błoną form receptorów komórek B lub T, za pomocą układów produkcyjnych niezależnych od integracji specyficznej wobec miejsca. TŁO WYNALAZKU [0002] W przypadku wielu chorób, takich jak choroby zakaźne i nowotwory, nie istnieją skuteczne terapie. Ogólnie zastosowanie przeciwciał monoklonalnych nie okazało się udane w przypadku wszystkich tych obiektów docelowych, po części wskutek zmienności złożonych obiektów docelowych i mutacji adaptacyjnych białek docelowych powodujących ucieczkę immunologiczną przed rozpoznawaniem przez przeciwciało monoklonalne. Z drugiej strony przeciwciała poliklonalne są zdolne do oddziaływania z większą liczbą dynamicznych obiektów docelowych, np. wirusów, bakterii i komórek nowotworowych. Ponadto przeciwciała poliklonalne charakteryzują się największym prawdopodobieństwem zachowania aktywności w razie mutacji antygenu. [0003] W sprzedaży dostępne są różne środki lecznicze zawierające przeciwciała poliklonalne, w tym: 1) normalne immunoglobuliny ludzkie wyodrębnione z krwi zdrowych dawców (ludzi); 2) ludzkie hiperaktywne immunologicznie immunoglobuliny pochodzące z krwi
3 1 2 pojedynczych dawców (ludzi) i zawierające przeciwciała przeciwko konkretnemu chorobowemu obiektowi docelowemu, np. wirusowi, który wcześniej napotkały w związku z infekcją lub szczepieniem oraz 3) zwierzęce hiperaktywne immunologicznie immunoglobuliny pochodzące z krwi immunizowanych zwierząt. [0004] Immunoglobuliny oczyszczone z krwi człowieka okazały się skuteczne przeciwko infekcjom wirusem zapalenia wątroby typu B, wirusem syncytium nabłonka oddechowego, cytomegalowirusem i innymi wirusami opryszczki, wirusem wścieklizny, toksynie botulinowej itd., a także w profilaktyce choroby hemolitycznej u noworodków. Immunoglobulina oczyszczona z krwi królików immunizowanych ludzkimi komórkami T jest wykorzystywana do immunosupresji komórek T w leczeniu lub profilaktyce odrzutu przeszczepu (np. tymoglobulina). Normalną immunoglobulinę ludzką wykorzystuje się do wzmacniania układu odpornościowego pacjentów, których układ odpornościowy jest osłabiony, a także w terapii różnych zaburzeń autoimmunologicznych. [000] Mimo tego, jednak, powszechne wykorzystanie immunoglobulin jest ograniczone wskutek niewystarczających zasobów krwi dawców, problemów ze zmiennością między seriami i różnym bezpieczeństwem stosowania. W szczególności immunoglobuliny pochodzenia zwierzęcego charakteryzują te same problemy związane z immunogennością, które obserwowano w przypadku przeciwciał monoklonalnych pochodzenia zwierzęcego w latach 80. i 90. XX wieku. Wreszcie, podobnie jak w przypadku innych produktów krwiopochodnych, pozostaje ryzyko przeniesienia czynników zakaźnych, takich jak
4 1 2 HIV, opryszczka lub wirusy zapalenia wątroby bądź priony. W związku z tym jakkolwiek wielu klinicystów przyznaje, że przeciwciała poliklonalne są w niektórych sytuacjach preferowanymi czynnikami terapeutycznymi, ich zastosowanie było w dużym stopniu ograniczone. [0006] Dzięki zastosowaniu metod wykorzystujących zwierzęta transgeniczne powstały nowe strategie wytwarzania immunoglobulin ludzkich. Otrzymano myszy transgeniczne mające loci ludzkich immunoglobulin (Patent USA nr 6,111,166). Myszy te wytwarzają w pełni ludzkie immunoglobuliny i za pomocą typowych metod immunizacji można wytworzyć przeciwciała przeciwko określonemu obiektowi docelowemu. Jednak możliwość uzyskania znacznej ilości przeciwciał jest ograniczona wskutek stosunkowo niewielkich rozmiarów myszy. Uzyskano również większe zwierzęta transgeniczne pod względem genów immunoglobulin ludzkich, np. krowy (Kurolwa, Y. i wsp. Nature Biotechnology; 02; : 889-893). Jednak wytworzenie przeciwciał poliklonalnych do terapii z krwi takich zwierząt nie odbywa się bez komplikacji. Po pierwsze immunofizjologia zwierząt i ludzi może wykazywać znaczne różnice, co powoduje odmienność otrzymywanych czynników immunologicznych, rearanżacje funkcjonalne i różnice w odpowiedzi humoralnej. Po drugie niestabilność mitotyczna wprowadzonych loci immunoglobulin może wpływać na wytwarzanie przeciwciał przez dłuższy czas. Po trzecie ze względów technicznych trudno jest usunąć własne loci immunoglobulin zwierzęcia, tak by np. wytwarzanie przeciwciał przez zwierzę nie przewyższyło wytwarzania przeciwciała ludzkiego. Po czwarte, podawaniu
1 2 przeciwciał ludzkich wytwarzanych przez zwierzęta towarzyszy ryzyko przeniesienia czynników zakaźnych, takich jak wirusy, priony lub inne patogeny. [0007] Opracowano niedawno nowy rodzaj przeciwciał poliklonalnych niezależnych od dostępności dawcy w momencie wytwarzania. Takie przeciwciała poliklonalne wytwarza się wyodrębniając sekwencje kwasu nukleinowego kodujące przeciwciała od dawców wytwarzających odpowiedź odpornościową przeciwko odpowiedniemu obiektowi docelowemu, a następnie poszukując przeciwciał wiążących się z odpowiednim obiektem docelowym w sposób swoisty. Przeciwciało poliklonalne można wytworzyć za pomocą zaadaptowanej technologii ekspresji u ssaków, w oparciu o wstawienie specyficzne względem miejsca jednego plazmidu do ekspresji przeciwciała w to samo miejsce genomu każdej komórki, zgodnie z opisem w WO 04/0614. Jednym przykładem tego nowego rodzaju przeciwciał poliklonalnych jest rekombinowane przeciwciało poliklonalne przeciwko czynnikowi Rh (Rhesus D) (WO 06/00780). Zastosowanie integracji specyficznej wobec miejsca powoduje powstanie populacji komórek, w której każda komórka zawiera pojedynczą kopię i gdzie poziom ekspresji i szybkość wzrostu powinna być stosunkowo jednorodna. [0008] WO 04/029284 ujawnia specyficzny wobec miejsca układ do ekspresji w komórkach zdolny do wymiany co najmniej jednego genu docelowego, przy czym układ zawiera pierwszą kasetę integracyjną, pierwszą kasetę docelową i co najmniej jeden element rec kodujący co najmniej jedną aktywność rekombinazy rozpoznającą miejsca rozpoznawania rekombinazy w kasetach.
6 1 2 [0009] WO 06/00783 ujawnia sposoby charakteryzowania strukturalnego rekombinowanego przeciwciała poliklonalnego lub innego rekombinowanego białka poliklonalnego lub linii komórek poliklonalnych wytwarzającej takie białko w celu weryfikacji spójności między seriami produktów gotowych, a także stabilności kompozycji w ramach pojedynczej serii produkcyjnej. [00] Wiberg i wsp. (Biotechn. Bioeng. (06) 94(2):396-40) opisują ekspresję i produkcję rekombinowanego przeciwciała poliklonalnego anty-rh zawierającego 2 ludzkich przeciwciał IgG1 przy zastosowaniu specyficznej wobec miejsca integracji genów przeciwciał w komórkach CHO. [0011] Huang i wsp. (J. Immunol. Methods (kwiecień 07) 322(1-2):28-39) opisują układ do włączenia genu do komórki docelowej z użyciem wektora w celu ekspresji przeciwciał na wysokim poziomie za pomocą strategii FRT/FLP, aby przezwyciężyć efekty pozycyjne. [0012] Haurum i wsp. (IDrugs (0) 8():404-9) przedstawiają przegląd opracowywania czynników terapeutycznych zawierających przeciwciała, od ludzkich immunoglobulin pierwszej generacji przez rekombinowane przeciwciała monoklonalne do rekombinowanych przeciwciał poliklonalnych. STRESZCZENIE WYNALAZKU [0013] Niniejszy wynalazek dostarcza alternatywnych sposobów wytwarzania rekombinowanego białka poliklonalnego, niezależnych od integracji specyficznej wobec miejsca, a więc zapewnia zwiększoną elastyczność w odniesieniu do doboru wytwarzającej linii komórkowej przy zachowaniu poliklonalności białka. Ponadto poziom
7 1 2 ekspresji może być wyższy niż możliwy do uzyskania przy zastosowaniu integracji specyficznej wobec miejsca. [0014] Strategia wykorzystywana w niniejszym wynalazku opiera się na losowej integracji pojedynczych odpowiednich genów w komórkach gospodarza, po czym korzystnie następuje klonowanie pojedynczych komórek o pożądanych właściwościach. Pojedyncze klony komórkowe, z których każdy wytwarza pojedynczy składnik białka poliklonalnego, miesza się następnie w celu wytworzenia poliklonalnej wytwarzającej linii komórkowej do produkcji białka poliklonalnego. [001] Przeciwciała poliklonalne stanowią ogólnie najlepiej znane białka poliklonalne. Odnosi się to także do receptorów komórek T (TcR), które w przypadku wytwarzania w rekombinowanym układzie ekspresyjnym można otrzymywać w postaci rozpuszczalnej, co umożliwia ich traktowanie jako przeciwciał poliklonalnych. Dzięki rekombinowanym układom ekspresyjnym według niniejszego wynalazku możliwe jest jednak także łączenie białek, które nie są koniecznie homologiczne, np. różnych białek o znanej roli w danym zaburzeniu lub chorobie. Niniejszy wynalazek zostanie opisany na przykładzie przeciwciał poliklonalnych, ma on jednak obejmować poliklonalne TcR i inne białka poliklonalne, co do których pożądane może być jednoczesne wytwarzanie. W razie potrzeby takie białka mogą także stanowić białka fuzyjne. [0016] Niniejszy wynalazek umożliwia przemysłowe wytwarzanie rekombinowanego białka poliklonalnego w jednym naczyniu, np. do zastosowania w kompozycjach farmaceutycznych. Jedną istotną cechą wynalazku jest
8 1 2 to, że podczas procesu wytwarzania niezrównoważona ekspresja pojedynczych cząsteczek stanowiących białko poliklonalne jest utrzymywana na niskim poziomie, co zmniejsza do minimum zmienność między seriami i pozwala uniknąć eliminacji składników przeciwciała poliklonalnego podczas wytwarzania. [0017] Jeden z aspektów niniejszego wynalazku dotyczy sposobu wytwarzania poliklonalnej linii komórkowej zdolnej do ekspresji białka poliklonalnego zawierającego od 2 do n odrębnych składników, gdzie ten sposób obejmuje: a) dostarczanie zestawu wektorów ekspresyjnych, gdzie każdy z tych wektorów zawiera co najmniej jedną kopię odrębnego kwasu nukleinowego kodującego odrębny składnik tego białka poliklonalnego, b) oddzielną transfekcję komórek gospodarza każdym z tych wektorów ekspresyjnych w warunkach pozwalających na uniknięcie specyficznego wobec miejsca włączania się wektorów ekspresyjnych do genomu komórek, dzięki czemu otrzymuje się od 2 do n kompozycji komórek, gdzie każda kompozycja wyraża jeden odrębny składnik białka poliklonalnego, c) mieszanie tych od 2 do n kompozycji komórek w celu uzyskania poliklonalnej linii komórkowej. [0018] W korzystnych wykonaniach poliklonalną linię komórkową wykorzystuje się jako poliklonalną wytwarzającą linię komórkową i zamraża, przechowuje i wykorzystuje jako poliklonalny macierzysty bank komórek (pmcb, ang. polyclonal Master Cell Bank), z którego pobiera się próbki (np. ampułki) i rozmraża i wykorzystuje bezpośrednio do wytwarzania
9 1 2 rekombinowanego białka poliklonalnego lub poliklonalnego roboczego banku komórek (pwcb, ang. polyclonal Working Cell Bank). [0019] W jednym z wykonań wektorami ekspresyjnymi są wektory episomowe. W innym korzystnym wykonaniu wektory ekspresyjne są w sposób stabilny losowo włączone do genomu komórek gospodarza. Wektory ekspresyjne mogą być w sposób stabilny włączone w losowych pozycjach do jednego lub większej liczby chromosomów komórki gospodarza. [00] Korzystnie transfekowane komórki uzyskane w etapie b) klonuje się. W jednym z wykonań klonowanie prowadzi się przy zastosowaniu metody FACS jak tu opisano. [0021] Klony można wybierać ze względu na co najmniej jedno kryterium wybrane z grupy składającej się z: szybkości wzrostu, czasu podwajania, poziomu ekspresji, poziomu wytwarzania, stabilności wytwarzania w czasie, żywotności, wytrzymałości, stabilności, morfologii i liczby kopii. Korzystnie klony wybiera się mając na celu jednorodność ze względu na co najmniej jedno kryterium. Korzystniej klony wybiera się mając na celu jednorodność ze względu na czas podwajania i poziom ekspresji. [0022] W przypadku każdego odrębnego składnika białka poliklonalnego można wybrać jeden lub więcej klonów. A zatem można wybrać 2 klony w przypadku każdego odrębnego składnika białka poliklonalnego lub można wybrać 3, 4,, 6, 7, 8, 9,, 11, 12, 13, 14, 1, 16, 17, 18, 19,, 2,, 3, 40, 4, 0, 60, 70, 80, 90 lub 0 klonów.
1 2 [0023] Kompozycje komórek wyrażających różne odrębne składniki można mieszać w stosunku 1:1 lub w stosunku innym niż 1:1. [0024] Korzystnie wektory ekspresyjne są identyczne z wyjątkiem zmienności sekwencji kodującej białka poliklonalnego. [002] Sposób można zastosować w odniesieniu do monomerycznych i multimerycznych białek poliklonalnych. [0026] W przypadku białek multimerycznych jeden wektor ekspresyjny może kodować wszystkie podjednostki jednego odrębnego składnika białka poliklonalnego. Alternatywnie, zbiór wektorów ekspresyjnych w etapie a) składa się z dwóch lub więcej podzbiorów wektorów ekspresyjnych, przy czym pierwszy podzbiór zawiera wariantowe sekwencje kwasu nukleinowego kodujące jedną podjednostkę białka, zaś drugi podzbiór zawiera wariantowe sekwencje kwasu nukleinowego kodujące inną podjednostkę białka, tak że każdą transfekcję prowadzi się z zastosowaniem składnika pierwszego podzbioru i składnika drugiego podzbioru wektorów ekspresyjnych. Transfekcja może być jednoczesna lub sekwencyjna. W szczególności zbiór wektorów ekspresyjnych w etapie a) może składać się z dwóch podzbiorów wektorów ekspresyjnych, przy czym pierwszy podzbiór zawiera wariantowe sekwencje kwasu nukleinowego kodujące łańcuch ciężki przeciwciała, zaś drugi podzbiór zawiera wariantowe sekwencje kwasu nukleinowego kodujące łańcuch lekki przeciwciała, tak że każdą transfekcję prowadzi się z zastosowaniem składnika pierwszego podzbioru i składnika drugiego podzbioru wektorów ekspresyjnych.
11 1 2 [0027] Wektor ekspresyjny lub kolejny wektor ekspresyjny korzystnie koduje marker selekcyjny. Ponadto komórki są w sposób ciągły hodowane w warunkach sprzyjających wzrostowi komórek wyrażających marker selekcyjny. Prowadzi się to najlepiej wykorzystując marker selekcyjny zawierający produkt genu, którego pozbawiona jest komórka gospodarza. W jednym z wykonań marker selekcyjny jest kodowany przez transkrypt, który także koduje składnik polipeptydu lub podjednostkę wspomnianego składnika polipeptydu, korzystnie tak, że marker selekcyjny jest kodowany przez transkrypt kodujący największą podjednostkę. [0028] Jeden z aspektów niniejszego wynalazku dotyczy sposobu wytwarzania białka poliklonalnego, gdzie to białko poliklonalne zawiera od 2 do n odrębnych składników, gdzie ten sposób obejmuje: a) dostarczanie poliklonalnej linii komórkowej otrzymanej przy zastosowaniu sposobu według wynalazku; b) hodowlę poliklonalnej linii komórkowej w warunkach pozwalających na ekspresję białka poliklonalnego; c) odzyskiwanie i ewentualnie oczyszczenie białka poliklonalnego od komórek lub pożywki; i ewentualnie d) weryfikację obecności każdego z odrębnych składników w odzyskanym i ewentualnie oczyszczonym białku poliklonalnym. [0029] Twórcy niniejszego wynalazku nieoczekiwanie stwierdzili, że rozkład pojedynczych klonów zostaje utrzymany podczas symulacji cyklu produkcyjnego, który odpowiada warunkom przemysłowego wytwarzania rekombinowanego produktu leczniczego. Jest to bardzo
12 1 2 zaskakujące, ponieważ wektory ekspresyjne dla poszczególnych składników przeciwciała poliklonalnego włączają się w różnych miejscach i ponieważ liczba kopii jest różna. Mogłoby to prowadzić do różnic zarówno w poziomie ekspresji jak i szybkości wzrostu. [00] Przeciwnie do oczekiwań, wytwarzanie nie doprowadziło do całkowitej lub częściowej utraty jednego lub większej liczby składników przeciwciała poliklonalnego. Nawet niewielkie różnice szybkości wzrostu różnych linii komórkowych powinny wraz z upływem czasu doprowadzić do całkowitej lub częściowej utraty przez kompozycję poliklonalną co najmniej jednego składnika kompozycji poliklonalnej. A zatem w wykonaniach wynalazku stabilność kompozycji jest zachowywana podczas więcej niż podziałów komórkowych po rozmrożeniu roboczego banku komórek, korzystnie więcej niż 1 podziałów komórkowych, na przykład więcej niż podziałów komórkowych, na przykład więcej niż 2 podziałów komórkowych, na przykład więcej niż podziałów komórkowych, na przykład więcej niż 40 podziałów komórkowych, na przykład więcej niż 0 podziałów komórkowych, na przykład więcej niż 7 podziałów komórkowych, na przykład więcej niż 0 podziałów komórkowych. [0031] W załączonych przykładach pokazano, że stabilność kompozycji jest zachowywana w dopuszczalnych granicach podczas więcej niż 2 podziałów komórkowych. [0032] Jakkolwiek oddzielna transfekcja jest korzystna w znacznej większości przypadków, łączenie wektorów ekspresyjnych w pulę przed transfekcją jest w niektórych warunkach możliwe. Jeśli białko poliklonalne
13 1 2 jest monomerem, wtedy istotnie jest to możliwe, ponieważ ekspresja przez jedną komórkę kilku różnych składników białka poliklonalnego nie stanowi problemu. Jeśli białko poliklonalne jest multimerem, łączenie wektorów ekspresyjnych w pulę przed transfekcją jest możliwe jedynie, jeśli zastosuje się sposoby zapewniające wprowadzenie tylko jednej kopii do każdej komórki. W innym wypadku może nastąpić niepożądane pomieszanie podjednostek. [0033] Jakkolwiek łączenie wektorów ekspresyjnych w pulę jest niewątpliwie możliwe, jest mniej korzystne od oddzielnej transfekcji, ponieważ oczekuje się, że doprowadzi do zmniejszenia stabilności układu produkcyjnego w odniesieniu do utrzymania stabilności kompozycji. [0034] W obu sposobach według wynalazku należy rozumieć, że białko poliklonalne to typowo białko, które nie jest w sposób naturalny związane z komórkami, w których odbywa się ekspresja. [003] Niniejszy wynalazek opisuje szereg sposobów, dzięki którym do linii komórek gospodarza można wprowadzić bibliotekę sekwencji kwasu nukleinowego w celu wytworzenia kolekcji komórek odpowiednich jako poliklonalna wytwarzająca linia komórkowa. Do tych sposobów należą masowa transfekcja kolekcji komórek przy zastosowaniubiblioteki, półmasowa transfekcja porcji komórek przy zastosowaniufrakcji biblioteki lub korzystnie pojedyncza transfekcja, w przypadku której komórki gospodarza są transfekowane pojedynczymi składnikami biblioteki, po czym następuje połączenie klonów wytworzonych poprzez selekcję. Korzystniew
14 1 2 niniejszym wynalazku wykorzystuje się komórki ssaków (linie komórkowe lub rodzaje komórek) jako linię komórek gospodarza. [0036] W jednym aspekcie wynalazku poszczególne składniki białka poliklonalnego są kodowane przez parę niezależnych segmentów genowych. Białka poliklonalne, w których pojedyncze składniki składają się z dwóch lub więcej łańcuchów polipeptydowych, obejmują rozpuszczalne lub związane z błoną formy przeciwciał i receptorów komórek T. W kolejnych wykonaniach niniejszego wynalazku para segmentów genowych koduje łańcuch ciężki przeciwciała i łańcuch lekki przeciwciała lub region zmienny łańcucha alfa i łańcucha beta receptora komórek T lub region zmienny łańcucha gamma i łańcucha delta receptora komórek T. [0037] Niniejszy wynalazek dostarcza ponadto poliklonalnej linii komórkowej zawierającej 2 do n populacji komórek, tak że każda populacja wyraża odrębny składnik rekombinowanego białka poliklonalnego, gdzie rekombinowane białko poliklonalne zawiera różne, ale homologiczne cząsteczki białek, zaś komórki zawierają co najmniej jeden konstrukt ekspresyjny włączony w sposób przypadkowy do genomu, tak że miejsca włączenia różnią się między składnikami poliklonalnej linii komórkowej. W jednym z wykonań co najmniej jeden konstrukt ekspresyjny jest zintegrowany w sposób przypadkowy z elementem pozachromosomowym. W innym wykonaniu co najmniej jeden konstrukt ekspresyjny jest włączony w losowych miejscach do jednego lub większej liczby chromosomów komórki gospodarza. [0038] Linia komórkowa korzystnie pochodzi od ssaczej
1 1 2 linii komórkowej, takiej jak komórki jajnika chomika chińskiego (CHO), komórki COS, komórki BHK, komórki szpiczaka (np. komórki Sp2/0, NS0, YB2/0), NIH 3T3, fibroblasty lub unieśmiertelnione komórki ludzkie, takie jak komórki HeLa, komórki HEK 293 lub PER.C6. Można jednak także zastosować komórki eukariotyczne inne niż ssacze lub prokariotyczne, na przykład komórki roślinne, komórki owadzie, komórki drożdży, bakterie, grzyby itd. [0039] Ujawnione są tu także komórki CHO DHFR-ujemne, zawierające włączony w sposób stabilny kwas nukleinowy kodujący transaktywator E1A adenowirusa typu połączony w sposób umożliwiający działanie z promotorem konstytutywnym. [0040] Taką zmodyfikowaną linię komórek CHO skonstruowano do celów opisanych tu doświadczeń. Okazało się, że linia komórkowa była wyjątkowo stabilna w odniesieniu do jednorodności szybkości wzrostu, poziomu ekspresji i stabilności w czasie, co przedstawiono w dołączonych przykładach, dlatego szczególnie nadaje się ona do stosowania w sposobach według wynalazku. Późniejsze doświadczenia wykazały, że mrna E1A nie był wykrywalny w komórkach subklonowanych dwukrotnie. Oznacza to, że wyników wykazujących wyjątkową stabilność kompozycji nie można przypisać jedynie ekspresji E1A. Należy jednak nadal oczekiwać, że linia komórek CHO DHFR-ujemnych wyrażających E1A w sposób stabilny da bardzo stabilną linię komórkową o wysokiej ekspresji. [0041] W korzystnym wykonaniu linia komórkowa pochodzi od linii komórek DG44, stanowiącej homozygotyczne
16 1 2 komórki znokautowane pod względem DHFR. Ta linia komórkowa może przeżyć jedynie w pożywce niezawierającej tymidyny, jeśli komórki zawierają rekombinowany konstrukt wyrażający DHFR. [0042] W korzystnych wykonaniach wykonania linia komórkowa według wynalazku zawiera ponadto co najmniej jedną kopię konstruktu ekspresyjnego zintegrowanego w sposób stabilny, kodującego odpowiedni polipeptyd. Taki polipeptyd może stanowić białko multimeryczne; korzystnie białkiem multimerycznym jest przeciwciało. [0043] Aby umożliwić selekcję w pożywce niezawierającej tymidyny, konstrukt ekspresyjny kodujący polipeptyd będący przedmiotem zainteresowania koduje ponadto dhfr. [0044] Korzystnie, jeśli dhfr i co najmniej jedna podjednostka polipeptydu będącego przedmiotem zainteresowania są kodowane przez ten sam transkrypt, a korzystniej dhfr jest kodowany przez transkrypt kodujący największą podjednostkę. Prowadzi to do silnego związku między pożądanym produktem, odpowiednim polipeptydem i markerem selekcyjnym, dhfr, oraz zapewnia że przeżywające komórki wyrażają polipeptyd będący przedmiotem zainteresowania. [004] Aby jeszcze bardziej zwiększyć ekspresję polipeptydu będącego przedmiotem zainteresowania, ekspresję polipeptydu będącego przedmiotem zainteresowania można kontrolować przy zastosowaniu jednego lub większej liczby promotorów aktywowanych w układzie trans przez aktywator transkrypcji E1A, korzystnie promotorem jest promotor CMV lub pochodzący od promotora CMV.
17 1 2 Definicje [0046] Białko lub polipeptyd mają oznaczać dowolny łańcuch aminokwasowy, niezależnie od długości i modyfikacji potranslacyjnych. Białka mogą występować w postaci monomerów lub multimerów, zawierających dwa lub więcej złożonych łańcuchów polipeptydowych, fragmentów białek, polipeptydów, oligopeptydów lub peptydów. [0047] W znaczeniu tu przyjętym określenie białko poliklonalne lub poliklonalność dotyczy kompozycji białkowej zawierającej różne, ale homologiczne cząsteczki białek, korzystnie wybrane z nadrodziny immunoglobulin. W ten sposób każda cząsteczka białka jest homologiczna wobec innych cząsteczek kompozycji, ale zawiera także jeden lub więcej odcinków zmiennej sekwencji polipeptydowej, która lub które charakteryzują się różnicami w sekwencji aminokwasowej między poszczególnymi składnikami białka poliklonalnego. Do znanych przykładów takich białek poliklonalnych należą cząsteczki przeciwciał lub immunoglobulin bądź ich pochodne (na przykład Fab Fab 2, jednołańcuchowe Fv itd.), receptory komórek T i receptory komórek B. Białko poliklonalne może składać się z określonego podzbioru cząsteczek białkowych, które zdefiniowano za pomocą wspólnej cechy, takiej jak wspólna aktywność wiązania pożądanego obiektu docelowego, np. w przypadku przeciwciała poliklonalnego przeciwko pożądanemu antygenowi docelowemu. [0048] Określenie białko poliklonalne będące przedmiotem zainteresowania obejmuje określony podzbiór białek poliklonalnych, które mają wspólną cechę, taką jak aktywność wiązania pożądanego obiektu
18 1 2 docelowego, np. w przypadku przeciwciał poliklonalnych opisywaną za pomocą aktywności wiązania lub swoistości przeciwko antygenowi docelowemu, wspomniany gdzie ten antygen stanowi jedno lub więcej np. oddzielnych białek, drobnoustrojów, pasożytów, rodzajów komórek, alergenów lub cząsteczek węglowodanów lub dowolnych innych struktur, cząsteczek lub substancji, które mogą stanowić obiekty docelowe wiązania przez swoiste przeciwciała, lub mieszanin tych antygenów. [0049] Określenia jeden składnik kompozycji rekombinowanego białka poliklonalnego lub jeden składnik rekombinowanego białka poliklonalnego oznaczają cząsteczkę kompozycji białkowej zawierającej różne, ale homologiczne cząsteczki białek, gdzie każda cząsteczka białka jest homologiczna względem innych cząsteczek w kompozycji, ale zawiera także jeden lub więcej odcinków zmiennej sekwencji polipeptydowej, która lub które charakteryzują się różnicami w sekwencji aminokwasowej między poszczególnymi składnikami białka poliklonalnego. [000] Określenia zmienna sekwencja polipeptydowa i region zmienny są stosowane zamiennie. [001] Określenie odrębny składnik rekombinowanego białka poliklonalnego oznacza jedną cząsteczkę białka kompozycji białkowej zawierającej różne, ale homologiczne cząsteczki białek, gdzie każda cząsteczka białka jest homologiczna względem innych cząsteczek w kompozycji, ale zawiera także jeden lub więcej odcinków zmiennej sekwencji polipeptydowej, która lub które charakteryzują się różnicami w sekwencji aminokwasowej między poszczególnymi składnikami białka
19 1 2 poliklonalnego. [002] Określenie przeciwciało oznacza składnik funkcjonalny surowicy, który określa się często jako kolekcję cząsteczek (przeciwciał lub immunoglobulin) lub jako jedną cząsteczkę (cząsteczkę przeciwciała lub cząsteczkę immunoglobuliny). Cząsteczka przeciwciała jest zdolna do wiązania się lub reagowania z określoną determinantą antygenową (antygenem lub epitopem antygenowym), co z kolei może prowadzić do indukcji odpornościowych mechanizmów efektorowych. Pojedynczą cząsteczkę przeciwciała uznaje się zazwyczaj za jednoswoistą, zaś kompozycja cząsteczek przeciwciał może być monoklonalna (tzn. składa się z identycznych cząsteczek przeciwciał) lub poliklonalna (tzn. składa się z różnych cząsteczek przeciwciał reagujących z tym samym lub różnymi epitopami tego samego antygenu lub nawet odrębnych, różnych antygenów). Każda cząsteczka przeciwciała ma unikatową strukturę umożliwiającą mu swoiste wiązanie z odpowiednim antygenem; wszystkie naturalne cząsteczki przeciwciał mają tę samą ogólną podstawową strukturę: dwa identyczne łańcuchy lekkie i dwa identyczne łańcuchy ciężkie. Przeciwciała określa się także łącznie jako immunoglobuliny. Określenia przeciwciało lub przeciwciała stosowane w dokumencie mają także obejmować przeciwciała chimerowe i jednołańcuchowe, a także fragmenty wiążące przeciwciał, na przykład Fab, fragmenty Fv lub fragmenty scfv, a także formy multimeryczne, takie jak dimeryczne cząsteczki IgA lub pięciowartościowe IgM. [003] Określenie przeciwciało poliklonalne oznacza kompozycję różnych cząsteczek przeciwciał zdolnych do
1 2 wiązania się lub reagowania z kilkoma różnymi określonymi determinantami antygenowymi na tych samych lub różnych antygenach. Zazwyczaj uważa się, że zmienność przeciwciała poliklonalnego jest zlokalizowana w tak zwanych regionach zmiennych przeciwciała poliklonalnego. W kontekście jednak niniejszego wynalazku poliklonalność można także rozumieć jako określenie różnic między poszczególnymi cząsteczkami przeciwciał w tak zwanych regionach stałych, np. w przypadku mieszanin przeciwciał zawierających dwa lub więcej izotypów przeciwciał, na przykład ludzkich izotypów IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM, IgD i IgE lub mysich izotypów IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 i IgA. [004] Określenie rekombinowane przeciwciało poliklonalne będące przedmiotem zainteresowania oznacza zdefiniowany podzbiór rekombinowanych przeciwciał poliklonalnych, charakteryzujących się zdolnością do wiązania pożądanego obiektu docelowego lub pożądanego zbioru obiektów docelowych, np. odrębnego białka, drobnoustroju, pasożyta, komórki, alergenu lub cząsteczki węglowodanu bądź innej struktury, cząsteczki lub substancji, która może stanowić obiekt docelowy wiązania przez swoiste przeciwciała lub ich mieszaniny. [00] Określenie immunoglobulina" jest powszechnie stosowane jako zbiorcze określenie mieszaniny przeciwciał występujących we krwi lub w surowicy, ale może także oznaczać mieszaninę przeciwciał pochodzących z innych źródeł. [006] Określenie cząsteczka immunoglobuliny oznacza
21 1 2 pojedynczą cząsteczkę przeciwciała, np. część immunoglobuliny lub część dowolnej kompozycji przeciwciała poliklonalnego lub monoklonalnego. [007] Jeśli mówi się, że składnik białka poliklonalnego wiąże się z antygenem, oznacza to w niniejszym dokumencie wiązanie ze stałą wiązania poniżej 1 mm, korzystnie poniżej 0 nm, nawet korzystniej poniżej nm. [008] Określenie biblioteka wariantów cząsteczek kwasu nukleinowego będących przedmiotem zainteresowania stosuje się do opisu kolekcji cząsteczek kwasu nukleinowego, które łącznie kodują rekombinowane odpowiednie białko poliklonalne będące przedmiotem zainteresowania. Jeśli bibliotekę wariantów cząsteczek kwasu nukleinowego będących przedmiotem zainteresowania stosuje się do transfekcji, znajduje się ona w bibliotece wektorów ekspresyjnych. Taka biblioteka zawiera zazwyczaj co najmniej 2, 3, 4,, 6,,, 0, 00, 4, lub 6 odrębnych składników. [009] Stosowane tu określenie odrębna sekwencja kwasu nukleinowego ma być rozumiana jako sekwencja kwasu nukleinowego, która może kodować różne łańcuchy polipeptydowe, które łącznie stanowią białko będące przedmiotem zainteresowania. Jeśli odrębna sekwencja kwasu nukleinowego składa się z więcej niż jednej sekwencji kodującej, te sekwencje mogą występować w postaci dicistronowej jednostki transkrypcyjnej lub mogą stanowić dwie oddzielne jednostki transkrypcyjne, jeśli są one połączone w sposób umożliwiający działanie z odpowiednimi promotorami. Podobnie możliwe jest
22 1 2 zastosowanie tri- lub tetracistronowych jednostek transkrypcyjnych, jeśli odpowiednie białko składa się z 3 lub 4 podjednostek lub jeśli marker selekcyjny został wprowadzony do jednostki transkrypcyjnej wraz z kwasem nukleinowym kodującym białko będące przedmiotem zainteresowania lub jego podjednostkę. Korzystnie odrębną sekwencję kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku stanowi część cząsteczki kwasu nukleinowego, takiej jak np. wektor. Do niektórych przykładów, w których wymagana jest więcej niż jedna sekwencja kodująca w celu uzyskania pełnej cząsteczki białka będącego przedmiotem zainteresowania należą receptory komórek B, przeciwciała lub fragmenty przeciwciał, takie jak Fab i domeny zmienne, lub receptory komórek T. Geny, które łącznie kodują w pełni złożone białko będące przedmiotem zainteresowania, po wprowadzeniu do komórki znajdują się w tym samym wektorze i w ten sposób są sprzężone ze sobą w jednej sekwencji kwasu nukleinowego. [0060] Stosowane tu określenie gen będący przedmiotem zainteresowania oznacza sekwencję kwasu nukleinowego składającą się z jednego lub większej liczby segmentów genowych (genomowych lub cdna) kodujących jeden składnik odpowiedniego białka. Forma liczby mnogiej geny będące przedmiotem zainteresowania oznacza bibliotekę sekwencji kwasu nukleinowego kodujących odpowiednie białko poliklonalne. Jako skrót określenia gen lub geny będące przedmiotem zainteresowania stosuje się określenie GOI (ang. gene(s) of interest). [0061] Stosowane tu określenie wektor oznacza cząsteczkę kwasu nukleinowego, do której można
23 1 2 wprowadzić sekwencję kwasu nukleinowego do transportu między różnymi środowiskami genetycznymi i/lub do ekspresji w komórce gospodarza. Jeśli wektor zawiera elementy regulatorowe do transkrypcji sekwencji kwasu nukleinowego wprowadzonej do wektora (co najmniej odpowiedni promotor), wektor jest tu określany jako wektor ekspresyjny. Jeśli sekwencja kwasu nukleinowego wprowadzona do powyższych wektorów koduje zdefiniowane tu białko będące przedmiotem zainteresowania, stosuje się także określenia wektor będący przedmiotem zainteresowania i wektor ekspresyjny będący przedmiotem zainteresowania. Określenie wektor będący przedmiotem zainteresowania kodujący izotyp oznacza wektor zawierający sekwencje kwasu nukleinowego kodujące izotyp przeciwciała. W niniejszym opisie terminy wektor fagemidowy i wektor fagowy są stosowane zamiennie. Określenia plazmid i wektor są stosowane zamiennie. Wynalazek ma obejmować inne formy wektorów, które mają równoważne funkcje, na przykład plazmidy, fagemidy i genomy wirusowe lub dowolne cząsteczki kwasu nukleinowego zdolne do kierowania produkcją pożądanego białka u odpowiedniego gospodarza. [0062] Określenie każdy składnik biblioteki wektorów będących przedmiotem zainteresowania stosuje się tu do opisu pojedynczych cząsteczek wektorów zawierających odrębną sekwencję kwasu nukleinowego pochodzącą z biblioteki wektorów będących przedmiotem zainteresowania, gdzie sekwencja kwasu nukleinowego koduje jeden składnik rekombinowanego białka poliklonalnego będącego przedmiotem zainteresowania.
24 1 2 [0063] Określenie transfer masowy jest stosowane do opisu transferu odpowiednich sekwencji kwasu nukleinowego z jednej populacji wektorów do innej populacji wektorów i przeprowadzanie tego w przypadku każdego DNA jednocześnie bez wyodrębniania pojedynczego odpowiedniego DNA. Takie populacje wektorów mogą stanowić biblioteki zawierające na przykład odpowiednie regiony zmienne, promotory, lidery lub elementy wzmacniające. Takie sekwencje można wtedy przemieścić bez wyodrębniania na przykład z wektora fagowego do ssaczego wektora ekspresyjnego. Ta metoda, w szczególności w przypadku sekwencji przeciwciał, umożliwia zachowanie związku między różnorodnością V H i V L podczas przemieszczania bibliotek na przykład z wektora selekcyjnego (np. wektora ekspresji fagowej) do ssaczego wektora ekspresyjnego. W związku z tym zachowywane jest pierwotne tworzenie par V H i V L. [0064] Określenie transfekcja oznacza w dokumencie szerokie określenie wprowadzania obcego DNA do komórki. [006] Określenie to ma także obejmować inne funkcjonalne równoważne metody wprowadzania obcego DNA do komórki, np. transformację, infekcję, transdukcję lub fuzję komórki donorowej i komórki akceptorowej. [0066] Określenie selekcja stosuje się do opisu metody, w której komórki nabyły pewnych właściwości umożliwiających oddzielenie od komórek, które tej właściwości nie nabyły. Takimi właściwościami mogą być oporność na czynnik cytotoksyczny lub wytwarzanie niezbędnej substancji odżywczej, enzymu albo kolor. [0067] Określenia gen markera do selekcji, gen markera selekcyjnego, gen selekcyjny i gen
2 1 2 markerowy stosuje się do opisu genu kodującego marker selekcyjny (np. genu nadającego oporność na niektóre leki cytotoksyczne, takie jak niektóre antybiotyki, genu zdolnego do wytwarzania niezbędnej substancji odżywczej, która może zostać usunięta z pożywki hodowlanej, genu kodującego enzym wytwarzający metabolity, które można wykrywać, lub genu kodującego białko barwne, które na przykład można sortować za pomocą FACS), który zostaje jednocześnie wprowadzony do komórek wraz z genem lub genami będącymi przedmiotem zainteresowania. [0068] Określenie białko rekombinowane stosuje się do opisu białka wyrażanego przez linię komórkową transfekowaną wektorem ekspresyjnym zawierającym sekwencję kodującą białko. [0069] W znaczeniu tu stosowanym określenie połączony w sposób umożliwiający działanie" oznacza odcinek połączony z innym odcinkiem w relacji funkcjonalnej z innym odcinkiem. Na przykład DNA kodujący sekwencję sygnałową jest połączony w sposób umożliwiający działanie z DNA kodującym polipeptyd, jeśli ulega ekspresji jako lider, który uczestniczy w przenoszeniu polipeptydu do siateczki śródplazmatycznej. Ponadto promotor lub wzmacniacz jest połączony funkcjonalnie z sekwencją kodującą, jeśli stymuluje transkrypcję tej sekwencji. [0070] Określenie większość pojedynczych komórek oznacza procent komórek, na przykład ponad 80%, korzystnie ponad 8%, korzystniej ponad 90%, 9% lub nawet 99% lub więcej. [0071] Stosowane tu określenie genom nie oznacza
26 1 2 dosłownie normalnego zestawu chromosomów występujących w komórce, ale także elementy pozachromosomowe, które można wprowadzić i utrzymywać w komórce. Takie elementy pozachromosomowe mogą obejmować między innymi minichromosomy, YAC (sztuczne chromosomy drożdżowe), MAC (sztuczne chromosomy mysie) lub HAC (sztuczne chromosomy ludzkie). [0072] Określenie promotor oznacza region DNA biorący udział w wiązaniu polimerazy RNA w celu inicjacji transkrypcji. [0073] Określenie promotory przeciwbieżne (ang. headto-head oznacza parę promotorów umieszczonych w bezpośredniej bliskości, tak że transkrypcja dwóch genów kierowana przez te promotory następuje w przeciwnych kierunkach. Promotor przeciwbieżny można także skonstruować z użyciem wypełnienia złożonego z nieistotnych kwasów nukleinowych między oboma promotorami. Taki fragment wypełniający może zawierać nawet ponad 00 nukleotydów. [0074] Gen oporności na antybiotyk to gen kodujący białko, które może przezwyciężyć działanie hamujące lub toksyczne antybiotyku na komórkę zapewniając przeżycie i dalszą proliferację komórek w obecności antybiotyku. [007] Określenie wewnętrzne miejsce przyłączania rybosomu lub IRES (od ang. internal ribosome entry site) opisuje strukturę inną od normalnej struktury czapeczki na mrna. Obie struktury mogą być rozpoznawane przez rybosom w celu zapoczątkowania poszukiwania kodonu AUG do inicjacji translacji. Dzięki zastosowaniu jednej sekwencji promotorowej i dwóch inicjujących AUG pierwsza i druga sekwencja
27 1 2 polipeptydowa może ulegać translacji z pojedynczego mrna. W związku z tym, w celu umożliwienia jednoczesnej translacji drugiej sekwencji polinukleotydowej z pojedynczego dicistronowego mrna, pierwszą i drugą sekwencję polinukleotydową można transkrypcyjnie połączyć za pomocą sekwencji łączącej obejmującej sekwencję IRES, umożliwiającej translację sekwencji polinukleotydowej za sekwencją IRES. W takim wypadku dicistronowa cząsteczka RNA po transkrypcji będzie ulegać translacji od końca z czapeczką i wewnętrznej sekwencji IRES dicistronowej cząsteczki RNA i w ten sposób wytwarzać pierwszy i drugi polipeptyd. [0076] Określenie ekspresja indukowalna" stosuje się do opisu ekspresji wymagającej oddziaływania cząsteczki indukującej lub uwolnienia cząsteczki korepresora i białka regulatorowego, aby zaszła ekspresja. [0077] Określenie ekspresja konstytutywna" oznacza ekspresję, która zazwyczaj nie jest indukowalna. [0078] Określenie mieszanie oznacza sytuację, w której każdy z dwóch lub więcej składników białka poliklonalnego zawierających dwa lub więcej różnych łańcuchów polipeptydowych, np. z nadrodziny immunoglobulin, ulega ekspresji z pojedynczej komórki. Taka sytuacja może występować, jeśli do genomu pojedynczej komórki włączono więcej niż jedną parę segmentów genowych, przy czym każda para segmentów genowych koduje odrębny składnik białka poliklonalnego. W takich sytuacjach mogą powstać niepożądane kombinacje łańcuchów polipeptydowych wyrażanych z segmentów genowych. Takie niepożądane kombinacje łańcuchów polipeptydowych mogą nie mieć żadnego działania
28 1 2 leczniczego. [0079] Określenie mieszanie łańcuchów V H -V L jest przykładem mieszania zdefiniowanego powyżej. W tym przykładzie segmenty genowe kodujące V H i V L stanowią parę segmentów genowych. Mieszanie następuje, gdy w komórce są wytwarzane niepożądane kombinacje polipeptydów V H i V L, gdzie dwie różne pary segmentów genowych kodujących V H i V L są włączone do tej samej komórki. Taka mieszana cząsteczka przeciwciała prawdopodobnie nie będzie mieć pierwotnej swoistości, może więc nie mieć żadnego działania leczniczego lub nawet mieć niepożądane działanie lecznicze. [0080] Określenie rekombinowana poliklonalna wytwarzająca linia komórkowa oznacza populację komórek wyrażających białka, transfekowanych przy użyciu biblioteki wariantów sekwencji będących przedmiotem zainteresowania, tak że pojedyncze komórki, które razem stanowią rekombinowaną poliklonalną wytwarzającą linię komórkową, niosą jedną lub więcej kopii określonej sekwencji kwasu nukleinowego będącej przedmiotem zainteresowania, która koduje jeden składnik rekombinowanego białka poliklonalnego będącego przedmiotem zainteresowania, a każda kopia jest włączona do genomu każdej komórki. Komórki składające się na rekombinowaną poliklonalną wytwarzającą linię komórkową wybiera się ze względu na zdolność do utrzymywania włączonej do genomu kopii odrębnej sekwencji kwasu nukleinowego będącego przedmiotem zainteresowania, na przykład poprzez selekcję przy użyciu antybiotyku. Komórkami, które stanowią taką wytwarzającą linię komórkową, mogą być na przykład
29 1 2 komórki bakterii, grzybów, eukariotyczne, na przykład drożdży, komórki owadzie lub komórki ssacze, w szczególności unieśmiertelnione linie komórkowe, takie jak komórki CHO, komórki COS, komórki BHK, komórki szpiczaka (np. komórki Sp2/0, NSO, YB2/0), NIH 3T3 i unieśmiertelnione komórki ludzkie, takie jak komórki HeLa, komórki HEK 293 lub PER.C6. [0081] Określenie niezrównoważenie stosuje się do opisu zjawiska występującego podczas wytwarzania rekombinowanego białka poliklonalnego, kiedy kompozycja wektora poliklonalnego, poliklonalnej linii komórkowej lub białka poliklonalnego zmienia się z upływem czasu wskutek losowych mutacji genetycznych, różnic w kinetyce proliferacji między poszczególnymi komórkami, różnic poziomu ekspresji między sekwencjami różnych konstruktów ekspresyjnych lub różnic w wydajności klonowania DNA. [0082] Określenie RFLP dotyczy polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych, czyli metody, w której wzór migracji w żelu fragmentów cząsteczek kwasu nukleinowego analizuje się po trawieniu enzymami restrykcyjnymi. [0083] Określenie UTR oznacza niepodlegający translacji region po stronie mrna. [0084] Określenie warunki pozwalające na uniknięcie integracji specyficznej wobec miejsca oznaczają proces transfekcji, który nie obejmuje żadnych z możliwych środków służących do uzyskiwania integracji specyficznej wobec miejsca. Integrację specyficzną wobec miejsca można uzyskać np. za pomocą kombinacji rekombinazy i miejsca rozpoznawania przez rekombinazę
1 2 na chromosomie komórki gospodarza. Rekombinaza może także być połączona kowalencyjnie z odcinkiem nukleotydowym rozpoznającym określone miejsce na chromosomie. Integrację specyficzną wobec miejsca można także uzyskać za pomocą rekombinacji homologicznej, chociaż wydajność jest niższa. Unikanie integracji specyficznej wobec miejsca prowadzi często do integracji w losowych pozycjach w całym genomie komórki gospodarza, jeśli wykorzystuje się wektory integracyjne. [008] Określenie integracja losowa oznacza włączenie się wektora ekspresyjnego do genomu komórek gospodarza w losowych pozycjach. Słownikowe znaczenie słowa losowy jest takie, że istnieje równe prawdopodobieństwo każdego zdarzenia; w tym wypadku miejsca integracji. Jeśli dokonuje się transfekcji komórek, wszystkie miejsca integracji nie charakteryzują się bezwzględnie równym prawdopodobieństwem integracji, ponieważ niektóre części chromosomu są bardziej podatne na integrację niż inne. Jeśli nie czyni się niczego aby kierować wektor ekspresyjny do określonego miejsca integracji, będzie się on włączał się w losowych pozycjach w ramach grupy możliwych miejsc integracji. W związku z tym określenie integracja losowa w kontekście niniejszego wynalazku należy rozumieć jako procedurę transfekcji, w której nie czyni się niczego aby kierować konstrukt ekspresyjny do wcześniej określonego miejsca. Brak działania w celu kierowania wektora ekspresyjnego do wcześniej określonego miejsca wystarcza, aby uzyskać integrację losową. W związku z tym miejsce lub miejsca integracji będą zmieniały się w
31 1 2 zależności od komórki w transfekowanej populacji i należy uznać, że dokładnego miejsca lub miejsc integracji nie sposób przewidzieć. [0086] Określenie włączony w sposób stabilny oznacza włączenie wektora ekspresyjnego do genomu komórki gospodarza, tak że integracja pozostaje stabilna przez co najmniej, korzystniej, korzystniej 40, korzystniej 0, na przykład 7, na przykład 0 pokoleń lub więcej. [0087] Skróty: CMV = (ludzki) cytomegalowirus. AdMLP = główny późny promotor adenowirusowy. SV40 poli A = sekwencja sygnałowa poli A wirusa małpiego 40. GFP = zielone białka fluorescencyjne. TcR = receptor komórek T. ELISA = enzymatyczny test immunosorpcyjny. LTR = długie powtórzenie końcowe. OPIS RYSUNKÓW [0088] Figura 1. Schematyczne przedstawienie procesu wytwarzania banku komórek poliklonalnych. Na figurze przedstawiono schematycznie etapy wymagane do uzyskania banku komórek poliklonalnych, np. macierzystego banku komórek poliklonalnych: a) przedstawia różne wektory ekspresyjne N.A. 1, N.A. 2, N.A. 3 itd., z których każdy koduje inny i określony składnik białka poliklonalnego, b) przedstawia komórki gospodarza transfekowane wektorami ekspresyjnymi, c) przedstawia włączenie wektorów ekspresyjnych w różnych położeniach i w różnych liczbach kopii w pojedynczych komórkach, d) przedstawia wybór klonów komórkowych względem każdego ze składników białka poliklonalnego. W tym
32 1 2 konkretnym przypadku dla wygody pokazano tylko jeden klon dla odrębnego składnika białka poliklonalnego. Etap e) przedstawia mieszanie klonów wybranych w etapie d) w celu uzyskania poliklonalnego banku komórek. Figura 2a. Prototypowy wektor kodujący łańcuch ciężki i lekki. Jego elementy są następujące: dwa identyczne, przeciwbieżne promotory ludzkiego CMV z elementem rozdzielającym między nimi regiony kodujące łańcuch ciężki (VH + region stały gamma 1) i łańcuch lekki (kappa 02-286) bgh = sekwencja poliadenylacji bydlęcego hormonu wzrostu SV40 pa = sekwencja poliadenylacji SV40 Lidery genomowe dla łańcucha ciężkiego i lekkiego IRES + DHFR = wewnętrzne miejsce przyłączania rybosomu ECMV i cdna mysiej reduktazy dihydrofolianowej puc ori = początek replikacji puc bla, amp = gen oporności na ampicylinę Figura 2b. Wektor ekspresyjny E1A pml29. Jego elementy są następujące: Wektor opracowano w oparciu o pcdna3.1+ (Invitrogen) CMV = promotor ludzkiego CMV Ela = cdna transaktywatora 13S adenowirusa typu bgh = region poliadenylacji bydlęcego hormonu wzrostu SV40EP = wczesny promotor SV40
33 1 2 Neo = gen oporności na neo SV40 polya = region poliadenylacji SV40 AMP = gen β-laktamazy kodujący oporność na ampicylinę Figura 3. Zbadano zawartość IgG w mieszaninach 1-9 w okresie tygodni trwania doświadczenia. Informacje szczegółowe przedstawiono w Przykładzie 1. Figura 4. Chromatogramy wymiany jonowej przedstawiające skład mieszaniny 8 na początku (czarny) i na końcu (niebieski) -tygodniowego okresu hodowli. Figura. Pierwszą (szary) i ostatnią (czarny) próbkę spośród wszystkich 9 mieszanin analizowano metodą chromatografii wymiany jonowej oraz obliczono i przedstawiono graficznie zawartość poszczególnych przeciwciał. Figura 6. Próbki z 4 mieszanin (Przykład ) podczas serii wysiewania i serii w bioreaktorze analizowano metodą chromatografii wymiany jonowej oraz obliczono i przedstawiono graficznie zawartość poszczególnych przeciwciał. Mieszaniny 1 A - 3 A zawierały pojedynczy klon dla przeciwciała. Klony komórkowe wyrażające każde z 6 przeciwciał były inne w mieszaninie 1 A (figura 6a), mieszaninie 2 A (figura 6b) i mieszaninie 3 A (figura 6c). Mieszanina 4 A (figura 6d) zawierała 3 klony dla przeciwciała.
34 SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU Układ do ekspresji rekombinowanego białka poliklonalnego 1 2 [0089] Niniejszy wynalazek dotyczy sposobów powtarzalnego wytwarzania rekombinowanych białek poliklonalnych, które korzystnie wybiera się z nadrodziny immunoglobulin, rodziny białek mających domeny podobne do immunoglobulin. Większość ich przedstawicieli bierze udział w zdarzeniach rozpoznawania na powierzchni komórek. Analiza sekwencji wskazuje, że przeciwciała, receptory komórek T, cząsteczki MHC, niektóre cząsteczki adhezji komórkowej i receptory cytokin są wysoce homologiczne. W szczególności przedstawiciele tej rodziny zawierający regiony zmienne nadają się do wytwarzania rekombinowanych białek poliklonalnych według niniejszego wynalazku. Do takich przedstawicieli należą przeciwciała, przeciwciała związane z błoną (receptory limfocytów B), fragmenty Fab, fragmenty Fv, jednołańcuchowe fragmenty Fv (scfv), receptory komórek T (TcR), rozpuszczalne TcR, fragmenty domen zmiennych TcR oraz fragmenty domen zmiennych TcR połączone łącznikiem polipeptydowym lub innym przeciwciałem lub inne fragmenty pochodzące od TcR. W szczególności należy zauważyć, że niniejszy wynalazek można zastosować do wytwarzania i produkcji rekombinowanych terapeutycznych przeciwciał poliklonalnych i TcR na dużą skalę. [0090] Jedną z głównych zalet sposobu wytwarzania według niniejszego wynalazku jest to, że wszystkie