RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 27808 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 27..08 08843849.4 (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 08.05.13 Europejski Biuletyn Patentowy 13/19 EP 27808 B1 (13) (51) T3 Int.Cl. C07K 16/22 (06.01) A61P 11/06 (06.01) A61K 39/395 (06.01) A61P /00 (06.01) A61P /28 (06.01) A61P /16 (06.01) (54) Tytuł wynalazku: Ulepszone cząsteczki wiążące się z Nogo-A i ich zastosowania farmaceutyczne () Pierwszeństwo: 02.11.07 EP 07119847 02.11.07 US 1741 (43) Zgłoszenie ogłoszono: 21.07. w Europejskim Biuletynie Patentowym nr /29 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: 29.11.13 Wiadomości Urzędu Patentowego 13/11 (73) Uprawniony z patentu: Novartis AG, Basel, CH University of Zürich, Zürich, CH (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP 27808 T3 CARMEN BARSKE, Loerrach, DE STEFAN FRENTZEL, Lörrach, DE ANIS KHURSO MIR, Bartenheim, FR MARTIN E. SCHWAB, Zürich, CH ALESSANDRA VITALITI, Oberwil, CH (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Marek Łazewski LDS ŁAZEWSKI DEPO I WSPÓLNICY SP. K. ul. Okopowa 58/72 01-042 Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).
1 Z-973 EP 2 7 808 B1 5 Ulepszone cząsteczki wiążące się z Nogo-A i ich zastosowania farmaceutyczne 35 Opis Dziedzina wynalazku [0001] Wynalazek dotyczy ulepszonych cząsteczek wiążących się z NogoA, takich jak, na przykład, przeciwciała monoklonalne, ich pochodne i fragmenty Fab. Tło wynalazku [0002] Regeneracja neuronów po uszkodzeniu w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) u osób dorosłych jest ograniczona z powodu obecności środowiska hamującego mieliny, powodującego otaczanie aksonów pochewką i tworzenie blizn. W ostatnich latach starano się zrozumieć, na poziomie molekularnym, dlaczego sam OUN jest niezdolny do spontanicznej naprawy po uszkodzeniu. Cząsteczki hamujące w mielinie są główną przeszkodą dla regeneracji aksonów, w szczególności bezpośrednio po urazie. Dotychczas scharakteryzowano NogoA, glikoproteinę związaną z mieliną (MAG) i glikoproteinę mielinowo-oligodendrocytową (OMgp) jako silne inhibitory odrostu aksonów. Ponadto, mielina zawiera również inne składniki hamujące, takie jak proteoglikany zawierające siarczan chondroityny. Nogo-A jest członkiem rodziny białek retikulonowych i ma co najmniej dwie aktywne biologicznie i farmakologicznie różne domeny nazywane Amino-Nogo i Nogo-66. Podczas gdy miejsce receptora dla tej pierwszej nie zostało dotychczas poznane, Nogo-66 hamuje wzrost neuronów in vitro i in vivo poprzez receptor neuronów NGR. Oprócz Nogo-66, MAG i OMgp również wiążą się z wysokim powinowactwem z NgR i hamują odrost aksonów. [0003] Nowe podejścia badawcze obecnie realizowane w celu zwiększenia naprawy nerwów, obejmują trawienie blizny z użyciem enzymu chondroitynazy ABC, techniki mostkowania wykorzystującej glejowe komórki węchowe i komórki macierzyste oraz białkowe czynniki wzrostu, aby zwiększyć wzrost neuronów. Blokowanie działania inhibitorów odrostu aksonów można uzyskać poprzez modulowanie wewnątrzkomórkowych mediatorów sygnalizacyjnych, takich jak Rho, związana z błoną trifosfataza guanozyny (GTPaza), uważana za kluczowy związek w hamowania wzrostu aksonów. Cykliczny monofosforan adenozyny (camp) może znieść hamowanie związane z mieliną in vitro i indukować regenerację in vivo. Peptydowy inhibitor receptora NgR
5 35 2 (NEP 1-40) może być stosowany do indukowania odrastania neuronów i odzyskiwania funkcji u szczurów po uszkodzeniu rdzenia. [0004] Oprócz podejść opisanych powyżej, wiele uwagi również skupia się na wykorzystaniu określonych przeciwciał monoklonalnych do neutralizacji cząsteczek hamujących wzrost aksonów ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego, w szczególności w celu neutralizacji aktywności hamowania wzrostu aksonów wykazywanej przez NogoA. Wykazano zatem, że przeciwciało monoklonalne IN-1 lub fragment Fab IN-1 indukują odrost aksonów in vitro i zwiększają bocznicowanie (wyrastanie i rozgałęzianie) i regenerację w warunkach in vivo (Schwab ME i wsp. (1996) Physiol. Rev 76, 319-370). Alternatywne przeciwciała dla IN-1 zostały również opisane w WO04/052932 (11C7-Ab) i WO05/028508 (3A6-Ab). Testowanie różnych domen NogoA pod kątem aktywności hamującej wzrost aksonów ujawniło kilka hamujących domen w cząsteczce (Chen i wsp. (00) Nature 403, 434-439; GrandPre i wsp., (00) Nature 403, 439-444; Prinjha i wsp. (00) Nature 403, 383-384). [0005] Naturalne immunoglobuliny lub przeciwciała stanowią zasadniczo multimeryczną cząsteczkę w kształcie litery Y, mającą miejsce wiązania antygenu na końcu każdego ramienia. Pozostała część struktury, zwłaszcza trzon Y, pośredniczy w funkcjach efektorowych związanych z immunoglobulinami. Przeciwciała składają się z 2 ciężkich i 2 lekkich łańcuchów. Oba łańcuchy ciężki i lekki zawierają domenę zmienną i stałą część. Miejsce wiążące antygen składa się z domeny zmiennej ciężkiego łańcucha związanego z domeną zmienną łańcucha lekkiego. Domeny zmienne łańcuchów ciężkich i lekkich mają taką samą ogólną strukturę. Dokładniej, charakterystyka wiązania antygenu przeciwciała jest zasadniczo determinowana przez 3 określone regiony w zmiennej domenie łańcuchów ciężkich i lekkich, które są nazywane regionami hiperzmiennymi lub regionami determinującymi komplementarność (CDR). Te 3 regiony hiperzmienne występują na zmianę z 4 regionami zrębowymi (FR), których sekwencje są względnie konserwatywne i które nie są bezpośrednio zaangażowane w wiązanie. CDR tworzą pętle i są utrzymywane w bliskim sąsiedztwie przez regiony zrębowe, które w dużej mierze przyjmują konformację arkuszy ß. Regiony CDR łańcucha ciężkiego wraz z CDR związanego łańcucha lekkiego zasadniczo tworzą miejsce wiązania antygenu cząsteczki przeciwciała. Ustalenie, co stanowi region FR lub region CDR zwykle polega na porównaniu sekwencji aminokwasów kilku przeciwciał wytworzonych u tych samych gatunków. Ogólne zasady identyfikacji regionów CDR i FR mieszczą się w zakresie wiedzy ogólnej osoby biegłej w dziedzinie i można je, na przykład, znaleźć na stronie internetowej (www.bioinf.org.uk /abs/).
3 [0006] Zasadniczo, wciąż istnieje wyraźne zapotrzebowanie na nowe i ulepszone sposoby indukcji regeneracji tkanki nerwowej po urazie w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) u osób dorosłych. 5 Streszczenie wynalazku [0007] Wynalazek dotyczy nowego ludzkiego monoklonalnego przeciwciała o ulepszonych właściwościach modulowania aktywności NogoA w doświadczeniach in vitro oraz in vivo, z pozytywnym wpływem na regenerację neuronów po urazie w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) u osób dorosłych. Tak więc, wynalazek dostarcza nowych cząsteczek wiążących się z białkiem NogoA lub jego fragmentami. [0008] W jednym wykonaniu, wynalazek dostarcza zatem izolowanej cząsteczki zawierającej co najmniej jedno miejsce wiążące antygen, która wiąże się specyficznie z ludzkim polipeptydem NogoA (SEQ ID NO: 2) lub ludzkim NiG (SEQ ID NO: 3), przy czym wymienione miejsce wiążące antygen zawiera: * kolejno regiony hiperzmienne CDR-H1-6A3 (SEQ ID NO: 8), CDR-H2-6A3 (SEQ ID NO: 9) i CDR-H3-6A3 (SEQ ID NO: ); oraz * kolejno regiony hiperzmienne CDR-L1-6A3 (SEQ ID NO: 11), CDR-L2-6A3 (SEQ ID NO: 12) i CDR-L3-6A3 (SEQ ID NO: 13). [0009] W jeszcze innym wykonaniu, wynalazek dostarcza cząsteczki wiążącej zawierającej: * co najmniej jeden łańcuch ciężki immunoglobuliny lub jego fragment zawierające (i) domenę zmienną zawierającą kolejno regiony hiperzmienne CDR-H1-6A3 (SEQ ID NO: 8), CDR-H2-6A3 (SEQ ID NO: 9) i CDR-H3-6A3 (SEQ ID NO: ) i (ii) część stałą lub jej fragment ludzkiego łańcucha ciężkiego; oraz * co najmniej jeden łańcuch lekki immunoglobuliny lub jego fragment zawierające (i) domenę zmienną zawierającą kolejno regiony hiperzmienne CDR-L1-6A3 (SEQ ID NO: 11), CDR-L2-6A3 (SEQ ID NO: 12) i CDR-L3-6A3 (SEQ ID NO: 13) i (ii) część stałą lub jej fragment ludzkiego łańcucha lekkiego. [00] W innym wykonaniu, cząsteczka wiążąca według niniejszego wynalazku ma stałą dysocjacji < 00 nm. [0011] W alternatywnym wykonaniu cząsteczki wiążącej według wynalazku, część stała lub jej fragment ludzkiego łańcucha ciężkiego są typu y4 i część stała lub jej fragment ludzkiego łańcucha lekkiego są typu к.
5 35 4 [0012] W kolejnym wykonaniu, cząsteczka wiążąca według niniejszego wynalazku jest ludzkim lub chimerycznym, albo humanizowanym przeciwciałem monoklonalnym. [0013] W jeszcze innym wykonaniu, cząsteczka wiążąca według niniejszego wynalazku zawiera jedną lub większą liczbę sekwencji polipeptydu wybranych z grupy składającej się z SEQ ID NO: 4 (IgG1, ciężki), SEQ ID NO: 5 (IgG1, lekki), SEQ ID NO: 24 (IgG4, ciężki) i SEQ ID NO: (IgG4, lekki). [0014] Dodatkowo, wynalazek dostarcza także izolowanego polinukleotydu zawierającego sekwencję kwasu nukleinowego kodującą cząsteczkę wiążącą według niniejszego wynalazku. [00] W pewnych wykonaniach, wymieniony izolowany polinukleotyd według wynalazku zawiera albo: * co najmniej jedną z sekwencji polinukleotydowych wybranych z grupy składającej się z SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: i SEQ ID NO: 16; albo * co najmniej jedną z sekwencji polinukleotydowych wybranych z grupy składającej się z SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 i SEQ ID NO: 19. [0016] W korzystnych wykonaniach, wymieniony polinukleotyd według wynalazku zawiera: * sekwencję polinukleotydową zawierającą kolejno SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: i SEQ ID NO: 16; oraz * sekwencję polinukleotydową zawierającą kolejno SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 i SEQ ID NO: 19. [0017] W jeszcze innym korzystnym wykonaniu, wymieniony polinukleotyd według wynalazku zawiera: * sekwencję polinukleotydową SEQ ID NO: 6 i/lub sekwencję polinukleotydową SEQ ID NO: 7, lub, * sekwencję polinukleotydową SEQ ID NO: 26 i/lub sekwencję polinukleotydową SEQ ID NO: 28. [0018] Dodatkowo, niniejszy wynalazek dostarcza także wektora ekspresyjnego zawierającego polinukleotyd według niniejszego wynalazku określony powyżej. [0019] Ponadto, wynalazek dostarcza systemu ekspresyjnego zawierającego wektor ekspresyjny określony powyżej, gdzie wymieniony system ekspresyjny lub jego część są zdolne do wytwarzania polipeptydu według wynalazku określonego powyżej, gdy wymieniony system ekspresyjny lub jego część są obecne w kompatybilnej komórce gospodarza.
5 35 5 [00] Dodatkowo, niniejszy wynalazek dostarcza także izolowanej komórki gospodarza zawierającej wektor określony powyżej. [0021] Dodatkowo, niniejszy wynalazek dostarcza także izolowanej kompozycji zawierającej cząsteczkę wiążącą według niniejszego wynalazku i nośnik. [0022] Dodatkowo, niniejszy wynalazek dostarcza także izolowanej kompozycji zawierającej polinukleotyd według niniejszego wynalazku i nośnik. [0023] Dodatkowo, niniejszy wynalazek dostarcza także izolowanej kompozycji zawierającej wektor ekspresyjny według niniejszego wynalazku lub komórkę gospodarza według niniejszego wynalazku. [0024] Wynalazek dostarcza ponadto sposobu podawania cząsteczki wiążącej według niniejszego wynalazku osobie wymagającej leczenia choroby obwodowego i/lub ośrodkowego (OUN) układu nerwowego. [00] Wynalazek dostarcza także kompozycji farmaceutycznej zawierającej cząsteczkę wiążącą według niniejszego wynalazku, polinukleotyd według wynalazku, odpowiednio, wektor ekspresyjny lub system ekspresyjny według niniejszego wynalazku, lub komórkę gospodarza według niniejszego wynalazku, w połączeniu z co najmniej jednym farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem lub rozcieńczalnikiem. W pewnym wykonaniu, wymieniona kompozycja farmaceutyczna jest kompozycją o spowolnionym uwalnianiu. [0026] Wynalazek dostarcza ponadto sposobu leczenia choroby obwodowego i/lub ośrodkowego (OUN) układu nerwowego obejmującego podawanie pacjentowi wymagającemu takiego leczenia skutecznej ilości cząsteczki wiążącej według niniejszego wynalazku, polinukleotydu według niniejszego wynalazku, odpowiednio, wektora ekspresyjnego lub systemu ekspresyjnego według niniejszego wynalazku, lub komórki gospodarza według niniejszego wynalazku. W korzystnym wykonaniu choroba jest chorobą neurodegeneracyjną wybraną z grupy składającej się z choroby Alzheimera, choroby Parkinsona, stwardnienia zanikowego bocznego (ALS), patologii typu Lewy ego i innych demencji ogólnie, chorób po urazie czaszki, mózgu lub rdzenia kręgowego, udaru mózgu lub chorób diemielinizacyjnych. W kolejnym korzystnym wykonaniu, chorobę demielinizacyjną wybiera się z grupy składającej się z stwardnienia rozsianego, jednofazowej demielinizacji, zapalenia mózgu i rdzenia, leukoencefalopatii wieloogniskowej, zapalenia mózgu, choroby Marchiafava-Bignamiego, rozpadu mieliny mostu, adrenoleukodystrofii, choroby Pelizaeusa-Merzbachera, zwyrodnienia gąbczastego, choroby Alexandra, choroby Canavana, metachromatycznej leukodystrofii i choroby Krabbe'go.
5 35 6 [0027] Alternatywnie, choroba jest chorobą zwyrodnieniową narządu wzroku, w której może bezpośrednio lub pośrednio zachodzić zwyrodnienie komórek siatkówki i rogówki. W korzystnym wykonaniu chorobę zwyrodnieniową narządu wzroku wybiera się z grupy składającej się z retinopatii niedokrwiennych, przedniej niedokrwiennej neuropatii wzrokowej, zapalenia nerwu wzrokowego, związanego z wiekiem zwyrodnienia plamki żółtej, retinopatii cukrzycowej, torbielowatego obrzęku plamki żółtej (CME), barwnikowego zwyrodnienia siatkówki, choroby Stargardta, żółtkowatego zwyrodnienia plamki, ślepoty wrodzonej Lebera i innych dziedzicznych chorób zwyrodnieniowych siatkówki, patologicznej krótkowzroczności, retinopatii wcześniaków oraz dziedzicznej neuropatii nerwu wzrokowego Lebera, stanów po przeszczepie rogówki lub chirurgii refrakcyjnej rogówki i opryszczkowego zapalenia rogówki. [0028] Alternatywnie, choroba jest stanem psychiatrycznym. Korzystnie, wymieniony stan psychiatryczny wybiera się z grupy składającej się ze schizofrenii i depresji. [0029] W sposobach leczenia wskazanych powyżej, podawanie korzystnie realizuje się wewnątrzczaszkowo lub dooponowo. [00] Dodatkowo, wynalazek dostarcza także sposobu wytwarzania cząsteczki wiążącej według niniejszego wynalazku, obejmującego ekspresję polinukleotydu według niniejszego wynalazku w wektorze ekspresyjnym lub systemie ekspresyjnym według niniejszego wynalazku, za pomocą techniki rekombinacji DNA lub poprzez syntezę chemiczną. [0031] Ponadto, wynalazek dostarcza sposobu podawania kompozycji farmaceutycznej według niniejszego wynalazku lokalnie w miejscu urazu. [0032] Na koniec, wynalazek dostarcza także sposobu obejmującego podawanie jednego lub większej liczby następujących produktów wybranych z grupy składającej się z: cząsteczki wiążącej według niniejszego wynalazku, polinukleotydu według niniejszego wynalazku, wektora ekspresyjnego lub systemu ekspresyjnego według niniejszego wynalazku, komórki gospodarza według niniejszego wynalazku, jako preparatu złożonego do równoczesnego, oddzielnego lub sekwencyjnego zastosowania w leczeniu choroby obwodowego i/lub ośrodkowego (OUN) układu nerwowego. [0033] Wynalazek dostarcza ponadto sposobu wytwarzania cząsteczki wiążącej według wynalazku i polinukleotydu, wektora ekspresyjnego, za pomocą techniki rekombinacji DNA lub poprzez syntezę chemiczną, kodujących taką cząsteczkę wiążącą. [0034] Niniejszy wynalazek dostarcza także kompozycji farmaceutycznej zawierającej cząsteczkę wiążącą, polinukleotyd, wektor ekspresyjny lub system
5 7 ekspresyjny, albo komórkę gospodarza według niniejszego wynalazku w połączeniu z co najmniej jednym farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem lub rozcieńczalnikiem. Wynalazek dostarcza także produktów zawierających wymienioną cząsteczkę wiążącą, polinukleotyd, wektor ekspresyjny lub system ekspresyjny, albo wymienioną komórkę gospodarza, lub ich farmakologicznie dopuszczalną pochodną, jako preparat złożony do równoczesnego, oddzielnego lub sekwencyjnego zastosowania w leczeniu choroby obwodowego i/lub ośrodkowego (OUN) układu nerwowego. [0035] Rozważa się również sposób leczenia choroby obwodowego i/lub ośrodkowego (OUN) układu nerwowego obejmujący podawanie pacjentowi wymaganemu takiego leczenia skutecznej ilości cząsteczki wiążącej, polinukleotydu, wektora ekspresyjnego lub systemu ekspresyjnego lub komórki gospodarza według niniejszego wynalazku. [0036] W niniejszym wynalazku wskazano dalej w przykładach, że kompozycje farmakologiczne i produkty mogą być użyteczne do spowolnionego uwalniania cząsteczki wiążącej i/lub do miejscowego odkładania cząsteczki wiążącej w miejscu urazu. 35 Krótki opis figur Figura 1 [0037] Sekwencja nukleotydowa (SEQ ID NO 7) i aminokwasowa (SEQ ID NO 5) kodujące zmienne regiony łańcucha lekkiego przeciwciała 6A3-IgG1. Podkreślony fragment wskazuje peptyd liderowy (SED ID NO 22) i sekwencję nukleotydową go kodującą (SEQ ID NO 23). Figura 2 [0038] Sekwencja nukleotydowa (SEQ ID NO 6) i sekwencja aminokwasowa (SEQ ID NO 4) kodujące zmienne regiony łańcucha ciężkiego przeciwciała 6A3-IgG1. Podkreślony fragment wskazuje peptyd (SEQ ID NO ) i sekwencję nukleotydową go kodującą (SEQ ID NO 21). Figura 3 [0039] Regiony kodujące lekkiej (SEQ ID NO 28; góra) i ciężkiej (SEQ ID NO 26; dół) zmiennej części 6A3-Ig4. Figura 4 [0040] Sekwencje aminokwasowe ciężkiego (SEQ ID NO 24; dół) i lekkiego (SEQ ID NO, góra) łańcucha części zmiennej i części stałej 6A3-Ig4. Peptyd liderowy lekkiego (SEQ ID NO 31) i ciężkiego (SEQ ID NO ) łańcucha wskazano kursywą.
5 35 8 Figura 5 [0041] Góra: Sekwencja aminokwasowa lekkiego łańcucha przeciwciała 6A3- IgG1 (SEQ ID NO 5) z sekwencją liderową (SEQ ID NO 22) i sekwencjami CDR-L1 (SEQ ID NO 11), CDR-L2 (SEQ ID NO 12) i CDR-L3 (SEQ ID NO 13). [0042] Dół: Sekwencja aminokwasowa ciężkiego łańcucha przeciwciała 6A3- IgG1 (SEQ ID NO 4) z sekwencją liderową (SEQ ID NO ) i sekwencjami CDR-H1 (SEQ ID NO 8), CDR-H2 (SEQ ID NO 9) i CDR-H2 (SEQ ID NO ). Figura 6 [0043] W wyniku reakcji RT-PCR z użyciem MO3.13 RNA jako matrycy i specyficznych starterów Nogo-A otrzymano odrębny fragment DNA około 0 bp. Figura 7 [0044] Detekcja immunoblot Nogo-A poddanego immunoprecypitacji z lipidów komórki M03.13 z użyciem przeciwciała 6A3. [0045] Po immunoprecypitacji (IP) lizatów komórek MO3.13 i immunodetekcji za pomocą przeciwciała 6A3 przeciw Nogo-A wykryto pojedyncze silne pasmo przy oczekiwanym rozmiarze (190 kda) dla przeciwciała 6A3-IgG4 (prążek 4) i 11C7- IgG1 (prążek 6). Figura 8 [0046] Fig 8a: Wybarwianie immunofluorescencyjne komórek M03.13. Fig 8b: Wybarwianie immunofluorescencyjne komórek HOG. [0047] W wyniku wybarwiania immunofluorescencyjnego permeabilizowanych komórek M03.13 i komórek HOG za pomocą 6A3-IgG4 i znakowanego Alexa-Fluor 488 anty-ludzkiego drugorzędowego przeciwciała uzyskano bardzo jasne wybarwienie komórek (Figura 8a i 8b, lewa część), podczas gdy praktycznie żadnego sygnału nie wykryto używając samego drugorzędowego przeciwciała (prawa część). Figura 9 [0048] Stężenia w surowicy przeciwciała 6A3 mierzone u 6 pacjentów w okresie do dwóch miesięcy. Figura [0049] Stężenia w CSF przeciwciała 6A3 mierzone u 6 pacjentów w okresie do dwóch miesięcy. Figura 11 [0050] Leczenie przeciwciałem 6A3 w mysim modelu SCI poprawia szybkość i stopień odzysku funkcji niezależnie od rozmiarów uszkodzenia.
5 35 9 Szczegółowy opis wynalazku [0051] Poszukując nowych i ulepszonych sposobów zapewnienia regeneracji neuronów po uszkodzeniu w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) u osób dorosłych, obecnie nieoczekiwanie stwierdzono, że nowe ludzkie przeciwciało monoklonalne 6A3, które zostało wytworzone u myszy HUMAB z firmy Medarex Inc, myszy poddanej rekonstytucji genetycznej, gdzie ludzkie geny immunoglobuliny zastąpiły ich mysie odpowiedniki, ma lepsze właściwości w modulowaniu aktywności NogoA w warunkach in vitro oraz in vivo. 6A3 przeciwko ludzkiemu NiG, jest izotypu IgG i ma lepsze właściwości niż przeciwciało przeciw NogoA opisane w stanie techniki. Obecnie możliwe jest skonstruowanie innych cząsteczek wiążących się z NogoA, mających te same regiony hiperzmienne, jak wymienione przeciwciało 6A3 i wytworzenie nowych przeciwciał o korzystnych właściwościach 6A3. Pochodne 6A3-Ab, 6A3 i 6A3-IgG4 Fab rozpoznają ludzkie NiG z wysokim powinowactwem, odpowiednio, 0,14 nm i 1,1 nm. Ponadto, przeciwciała według niniejszego wynalazku wykazują wysoką trwałość i wydłużony okres półtrwania i retencji w warunkach in vitro i in vivo. Wreszcie cząsteczki wiążące i przeciwciała według wynalazku wykazują powolne uwalnianie z miejsca wprowadzenia, umożliwiając lokalne osadzenie cząsteczek wiążących w miejscu uszkodzenia. Wykryto wysokie stężenia przeciwciała 6A3 w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF) u zwierząt i pacjentów z urazem rdzenia kręgowego przy ciągłym wlewie. Ta nieoczekiwanie wysoka retencja i czas przebywania 6A3-Ab w, na przykład, płynie mózgowo-rdzeniowym umożliwiają stosowanie iniekcji bolusa (na przykład 1-3 razy w tygodniu, choć rozważa się jeszcze dłuższe odstępy raz na 2, 3 lub 4 tygodnie) zamiast stałego wlewu przeciwciała do płynu mózgowo-rdzeniowego. Można wykonywać powtarzane dooponowe iniekcje bolusa. W korzystnym wykonaniu, podaje się dooponowo, np. za pomocą wyprowadzonego na zewnątrz cewnika podłączonego do pompy przenośnej. W dalszym korzystnym wykonaniu, stosuje się dooponowy bolus. W części eksperymentalnej przedstawiono bardziej korzystne właściwości cząsteczek wiążących według wynalazku. [0052] Zatem, wynalazek dostarcza cząsteczek wiążących się z NogoA lub NiG (dalej w niniejszym dokumencie określanych jako cząsteczki wiążące według wynalazku lub po prostu cząsteczki wiążące ). Korzystnie, cząsteczki wiążące według wynalazku wiążą się z ludzkim białkiem NogoA (SEQ ID NO: 2, kodowane przez SEQ ID NO: 1) lub ludzkim białkiem NiG (które jest fragmentem NogoA najsilniej hamującym odrost aksonów i zaczyna się aminokwasem nr 186, a kończy aminokwasem nr 04 ludzkiego NogoA = SEQ ID NO: 3) korzystnie ze stałą dysocjacji (Kd) < 00 nm, lub z Kd do i z włączeniem 0 nm, korzystniej z Kd < 0 nm, lub z Kd do i z włączeniem 0 nm,
5 35 najkorzystniej z Kd < nm, lub z Kd do i z włączeniem nm. Reakcję wiązania można wykazać standardowymi metodami (włączając zarówno testy jakościowe, jak i ilościowe) włączając, na przykład, Western blotting, immunoprecypitację i metody oparte na powinowactwie do bioczujników (cf. przykład 4). Dodatkowo, wiązanie cząsteczek wiążących według wynalazku z ludzkim NogoA i ludzkim NiG, oraz skuteczność tych cząsteczek w testach funkcjonalnych można wykazać w badaniu odrostu aksonów, na przykład jak opisano poniżej. [0053] Zatem, w kolejnym korzystnym wykonaniu cząsteczki wiążące według niniejszego wynalazku (w stężeniu 0 µg/ml, korzystnie µg/ml, korzystniej 1,0 µg/ml, jeszcze korzystniej w stężeniu 0,1 µg/ml) zwiększają liczbę aksonów komórek ziarnistych mózgu szczura na substracie, który stanowi ekstrakt białkowy z mózgu małpy, o co najmniej %, korzystnie 50%, najkorzystniej 80%, w porównaniu z liczbą aksonów komórek ziarnistych mózgu szczura traktowanych kontrolnym przeciwciałem, które nie wiąże się z ludzkim polipeptydem NogoA ani ludzkim polipeptydem NiG (tj. ma stałą dysocjacji > 00 nm). [0054] Specyficzne rozpoznanie ludzkiego NogA lub NiG jest gwarantowane w przypadku obecności CDR-H1, CDR- H2 i CDR-H3 lub CDR-L1, CDR- L2 i CDR-L3 w cząsteczce wiążącej według niniejszego wynalazku. Jednakże, dla osób biegłych w dziedzinie oczywiste jest, że nawet obecność jednej domeny CDR w cząsteczce wiążącej może być wystarczająca dla zapewnienia specyficznego wiązania z rozpoznawaną cząsteczką. Określenie co najmniej jeden z regionów hiperzmiennych oznacza 1, lub 2 lub 3 regiony hiperzmienne. [0055] Określenie miejsce wiążące antygen zawierające kolejno regiony hiperzmienne obejmuje miejsce wiążące antygen, w którym regiony hiperzmienne nie sąsiadują ze sobą; korzystnie wymienione regiony przeciwciała występują na zmianę z regionami zrębowymi przeciwciała lub z sekwencjami stanowiącymi sekwencje zrębowe niepochodzące od danego przeciwciała, korzystnie regiony zrębowe ludzkiego przeciwciała. [0056] Według niniejszego wynalazku, cząsteczka wiążąca może również zawierać co najmniej jedno miejsce wiążące antygen, przy czym wymienione miejsce wiążące antygen zawiera albo : * kolejno regiony hiperzmienne CDR-H1-6A3 (SEQ ID NO: 8), CDR-H2-6A3 (SEQ ID NO: 9) i CDR-H3-6A3 (SEQ ID NO: ); albo * kolejno regiony hiperzmienne CDR-L1-6A3 (SEQ ID NO: 11), CDR-L2-6A3 (SEQ ID NO: 12) i CDR-L3-6A3 (SEQ ID NO: 13);
5 35 11 [0057] Według niniejszego wynalazku, cząsteczka wiążąca może również zawierać: * pierwsze miejsce wiążące antygen zawierające kolejno regiony hiperzmienne CDR-H1-6A3 (SEQ ID NO: 8), CDR-H2-6A3 (SEQ ID NO: 9) i CDR-H3-6A3 (SEQ ID NO: ); oraz * drugie miejsce wiążące antygen zawierające kolejno regiony hiperzmienne CDR-L1-6A3 (SEQ ID NO: 11), CDR-L2-6A3 (SEQ ID NO: 12) i CDR-L3-6A3 (SEQ ID NO: 13); [0058] Według niniejszego wynalazku, cząsteczka wiążąca może również zawierać: * co najmniej jeden łańcuch ciężki immunoglobuliny lub jego fragment zawierające (i) domenę zmienną zawierającą kolejno regiony hiperzmienne CDR-H1-6A3 (SEQ ID NO: 8), CDR-H2-6A3 (SEQ ID NO: 9) i CDR-H3-6A3 (SEQ ID NO: ) i (ii) część stałą lub jej fragment ludzkiego łańcucha ciężkiego; oraz * co najmniej jeden łańcuch lekkiej immunoglobuliny lub jego fragment zawierające (i) domenę zmienną zawierającą kolejno regiony hiperzmienne CDR-L1-6A3 (SEQ ID NO: 11), CDR-L2-6A3 (SEQ ID NO: 12) i CDR-L3-6A3 (SEQ ID NO: 13) i (ii) część stałą lub jej fragment ludzkiego łańcucha lekkiego; [0059] W cząsteczce wiążącej według niniejszego wynalazku część stała lub jej fragment ludzkiego łańcucha ciężkiego mogą być typu gamma (γ), korzystnie gamma 4 (γ4) i część stała lub jej fragment ludzkiego łańcucha lekkiego mogą być typu lambda (γ) lub korzystnie kappa (к). Dodatkowo, cząsteczka wiążąca według niniejszego wynalazku może być ludzkim, częściowo ludzkim lub chimerycznym, albo humanizowanym przeciwciałem monoklonalnym. [0060] Według niniejszego wynalazku, cząsteczka wiążąca może zawierać jedną lub większą liczbę sekwencji polipeptydu przedstawionych w dowolnej z SEQ ID NO: 4 (IgG1, ciężki), SEQ ID NO:5 (IgG1, lekki), SEQ ID NO:24 (IgG4, ciężki) i SEQ ID NO: (IgG4, lekki). [0061] W kolejnym korzystnym wykonaniu cząsteczka wiążąca według niniejszego wynalazku zawiera co najmniej jedno miejsce wiążące antygen, przy czym wymienione miejsce wiążące antygen zawiera kolejno regiony hiperzmienne CDR-H1-6A3, CDR-H2-6A3 i CDR-H3-6A3; gdzie wymieniony CDR-H1-6A3 ma sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 8, wymieniony CDR-H2-6A3 ma sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 9 i wymieniony CDR-H3-6A3 ma sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: ;
5 35 12 [0062] W kolejnym aspekcie według wynalazku, cząsteczka wiążąca według wynalazku zawiera co najmniej: a) pierwszą domenę zawierającą kolejno regiony hiperzmienne CDR-H1-6A3, CDR-H2-6A3 i CDR-H3-6A3; gdzie wymieniony CDR-H1-6A3 ma sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 8, wymieniony CDR-H2-6A3 ma sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 9 i wymieniony CDR-H3-6A3 ma sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: ; oraz b) drugą domenę zawierającą kolejno regiony hiperzmienne CDR-L1-6A3, CDR- L2-6A3 i CDR-L3-6A3, gdzie wymieniony CDR-L1-6A3 ma sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 11, wymieniony CDR-L2-6A3 ma sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 12 i wymieniony CDR-L3-6A3 ma sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 13; [0063] Ponadto, wynalazek dostarcza także następującej cząsteczki wiążącej według wynalazku, zawierającej co najmniej jedno miejsce wiążące antygen zawierające: a) albo region zmienny łańcucha ciężkiego 6A3 (SEQ ID NO: 4); albo b) region zmienny łańcucha lekkiego 6A3 (SEQ ID NO: 5). [0064] Gdy miejsce wiążące antygen zawiera zarówno pierwszą, jak i drugą domenę, mogą one być umieszczone na tej samej cząsteczce polipeptydu lub, korzystnie, każda domena może znajdować się na innym łańcuchu, pierwsza domena może stanowić część łańcucha ciężkiego immunoglobuliny lub jego fragmentu, a druga domena może stanowić część łańcucha lekkiego immunoglobuliny lub jego fragmentu. [0065] Przykładowe cząsteczki wiążące według wynalazku obejmują przeciwciała takie jak te wytwarzane przez komórki B lub hybrydomy i ludzkie lub chimeryczne, albo humanizowane przeciwciała lub ich dowolne fragmenty, na przykład F(ab )2; i fragmenty Fab, a także jednołańcuchowe lub jednodomenowe przeciwciała, takie jak te opisane w publikacji patentu Stanów Zjednoczonych US070065440A1. [0066] W znaczeniu stosowanym w niniejszym dokumencie, jednodomenowe przeciwciało oznacza domenę zmienną, która wiąże się specyficznie z epitopem lub antygenem, lub ligandem niezależnie od innej zmiennej domeny wiążącej, która wiąże się z epitopem lub antygenem, lub ligandem. Jednodomenowe przeciwciało może występować w homo- lub heteromultimerze z innymi domenami VH lub VL, gdy inne domeny nie są wymagane dla wiązania antygenu przez jednodomenowe przeciwciało, tj. gdy jednodomenowe przeciwciało wiąże się z antygenem niezależnie od domeny VH lub VL. W korzystnym wykonaniu jednodomenowe przeciwciało zawiera izolowaną pojedynczą domenę VH lub izolowaną pojedynczą domenę VL. Techniki wytwarzania jednodomenowego przeciwciała o co najmniej jednej specyficzności wiązania
5 35 13 nienaruszonego przeciwciała, od którego pochodzi, są znane w dziedzinie. Nna przykład, Ward, i wsp., w Binding Activities of a Repertoire of Single Immunoglobulin Variable Domains Secreted from Escherichia coli Nature 341:644-646, ujawniają sposób skriningu służący do otrzymania regionu zmiennego ciężkiego łańcucha przeciwciała (jednodomenowe przeciwciało VH) o wystarczającym powinowactwie do jego docelowego epitopu, w celu związania się z nim w postaci izolowanej. [0067] Jednołańcuchowe przeciwciało składa się z domen zmiennych/regionów łańcuchów ciężkich i lekkich przeciwciała kowalencyjnie połączonych za pomocą łącznika peptydowego zazwyczaj składającego się z do aminokwasów, korzystnie od do aminokwasów. Korzystne metody obejmują zastosowanie łączników polipeptydowych, jak opisano, na przykład, w powiązaniu z cząsteczkami scfv (Bird i wsp., (1988) Science 242:423-426). Zatem, taka struktura nie obejmuje części stałej łańcucha ciężkiego i lekkiego i uważa się, że ta mały peptydowy element rozdzielający powinien być mniej antygenowy niż cała część stała. Chimeryczne przeciwciało oznacza przeciwciało, w którym regiony stałe ciężkiego lub lekkiego łańcucha przeciwciała, lub obu, pochodzą od pierwszego gatunku, podczas gdy zmienne regiony obu łańcuchów, łańcucha ciężkiego i lekkiego, pochodzą od drugiego gatunku. Korzystnie, chimerycznym przeciwciałem jest przeciwciało, w którym regiony stałe łańcucha ciężkiego lub lekkiego, lub obu, są pochodzenia ludzkiego, podczas gdy domeny zmienne obu łańcuchów ciężkiego i lekkiego nie są pochodzenia ludzkiego (na przykład pochodzą od myszy, małp, szczurów, świń, myszy, kurczaków, ptaków). Humanizowane przeciwciało oznacza przeciwciało, w którym regiony hiperzmienne (CDR) są pochodzenia nie-ludzkiego (na przykład mysiego), podczas gdy wszystkie lub zasadniczo wszystkie części immunoglobuliny, na przykład regiony stałe i wysoce konserwatywne części domen zmiennych, tj. regiony zrębowe, są pochodzenia ludzkiego. Humanizowane przeciwciało może jednakże zachować kilka aminokwasów mysiej sekwencji w części regionów zrębowych sąsiadujących z regionami hiperzmiennymi. [0068] Regiony hiperzmienne mogą być połączone z dowolnym rodzajem regionów zrębowych, korzystnie pochodzenia mysiego lub ludzkiego. Odpowiednie regiony zrębowe opisano w Sequences of proteins of immunological interest", Kabat E.A. i wsp., US department of health and human services, Public health service, National Institute of Health. Korzystnie część stała ludzkiego łańcucha ciężkiego cząsteczek wiążących może być typu IgG, korzystniej typu IgG4, włączając podtypy, korzystnie część stała ludzkiego łańcucha lekkiego może być typu lambda (γ) lub typu kappa (к), korzystniej typu kappa (к).
5 35 14 [0069] Monoklonalne przeciwciała przeciw białku naturalnie występującemu u wszystkich ludzi można opracować w systemie nie-ludzkim, na przykład, mysim. W bezpośredniej tego konsekwencji, ksenogeniczne przeciwciało wytworzone przez hybrydomę, gdy podawane ludziom, wywołuje niepożądaną odpowiedź immunologiczną, w której pośredniczy głównie część stała ksenogenicznej immunoglobuliny. To wyraźnie ogranicza zastosowanie takiego przeciwciała, ponieważ nie może ono być podawane przez dłuższy okres czasu. Zatem szczególnie korzystne jest zastosowanie jednołańcuchowego, jednodomenowego, chimerycznego lub humanizowanego przeciwciała, które nie jest w stanie wywołać znacznej reakcji allogenicznej, gdy podaje się je ludziom. [0070] W związku z powyższym, cząsteczkę wiążącą według wynalazku można również wybrać spośród chimerycznego przeciwciała, zawierającego co najmniej: a) jeden łańcuch ciężki immunoglobuliny lub jego fragment zawierające (i) domenę zmienną zawierającą kolejno regiony hiperzmienne CDR-H1-6A3, CDR-H2-6A3 i CDR-H3-6A3 i (ii) część stałą lub jej fragment ludzkiego łańcucha ciężkiego; gdzie wymieniony CDR-H1-6A3 ma sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: 8), wymieniony CDRH2-6A3 ma sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: 9) i wymieniony CDR-H3-6A3 ma sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: ) oraz b) jeden łańcuch lekki immunoglobuliny lub jego fragment zawierające (i) domenę zmienną zawierającą kolejno regiony hiperzmienne CDR-L1-6A3, CDR-L2-6A3 i CDR-L3-6A3 i (ii) część stałą lub jej fragment ludzkiego łańcucha lekkiego; gdzie wymieniony CDR-L1-6A3 ma sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: 11), wymieniony CDR-L2-6A3 ma sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: 12) i wymieniony CDR-L3-6A3 ma sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: 13); [0071] Alternatywnie, cząsteczkę wiążącą według wynalazku można wybrać spośród jednołańcuchowej cząsteczki wiążącej zawierającej miejsce wiążące antygen zawierające: a) pierwszą domenę zawierającą kolejno regiony hiperzmienne CDR-H1-6A3, CDR-H2-6A3 i CDR-H3-6A3; gdzie wymieniony CDR-H1-6A3 ma sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: 8), wymieniony CDR-H2-6A3 ma sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: 9) i wymieniony CDR-H3-6A3 ma sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: ); oraz b) drugą domenę zawierającą kolejno regiony hiperzmienne CDR-L1-6A3, CDR- L2-6A3 i CDR-L3-6A3; gdzie wymieniony CDR-L1-6A3 ma sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: 11), wymieniony CDR-L2-6A3 ma sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: 12) i wymieniony CDR-L3-6A3 ma sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: 13); oraz
5 c) łącznik peptydowy, który jest związany albo z N-końcem pierwszej domeny i z C-końcem drugiej domeny, albo z C-końcem pierwszej domeny i z N-końcem drugiej domeny. [0072] Stałą dysocjacji dogodnie można określić w różnych testach włączając, na przykład, metodę powinowactwa do bioczujnika (BIAcore) (zob. powyżej). Dodatkowo, właściwości wiązania i właściwości funkcjonalne cząsteczek wiążących można wykazać w testach biologicznych, na przykład jak opisano poniżej. [0073] Część stała ludzkiego łańcucha ciężkiego może być typu γ1; γ2; γ3; γ4; α1; α2; δ lub ε, korzystnie typu γ, korzystniej typu γ4; podczas gdy część stała ludzkiego łańcucha lekkiego może być typu γ lub к (włączając podtypy γ1; γ2; γ3; i γ4), ale korzystnie jest typu к. Sekwencję aminokwasową wszystkich tych części stałych podano w Kabat i wsp. (supra). [0074] W zakresie niniejszego wynalazku mieszczą się koniugaty cząsteczek wiążących według wynalazku, na przykład koniugaty z użyciem enzymów, toksyn lub radioizotopów. W innym aspekcie, kompozycję zawierająca cząsteczkę wiążącą się z NogoA lub NiG stabilizuje się in vivo poprzez łącznik lub związanie z (niepolipeptydowym) polimerycznym ugrupowaniem wiążącym, na przykład poprzez glikozylowanie, co można uzyskać w procesach in vitro lub in vivo. Przykłady tego typu stabilizacji opisano, na przykład, w WO99/64460 (Chapman i wsp.) i EP11605 (King i wsp.). Szczególnie, w odnośnikach tych opisano zastosowanie syntetycznych lub naturalnie występujących cząsteczek polimerów, takich jak polialkilen, polialkenyleny, polioksyalkileny lub polisacharydy, w celu zwiększenia okresu półtrwania in vivo polipeptydów immunoglobuliny. Typowym przykładem ugrupowania stabilizującego jest poli(glikol etylenowy), lub PEG, polialkilen. Proces dołączania PEG do polipeptydu immunoglobuliny opisano w tych odnośnikach i jest określany w niniejszym dokumencie jako PEG-ylowanie. Jak opisano w niniejszym dokumencie, cząsteczka wiążąca się z NogoA lub NiG może być PEG-ylowana losowo, na przykład poprzez dołączenie PEG do lizyny lub innych aminokwasów na powierzchni cząsteczki wiążącej się z NogoA lub NiG, lub specyficznie w stosunku do miejsca, na przykład, poprzez dołączenie PEG do sztucznie wprowadzonej powierzchniowej reszty cysteiny. Zależnie od cząsteczki wiążącej się z NogoA lub NiG, korzystne może być zastosowanie nielosowej metody dołączania polimeru, ponieważ dołączanie losowe, poprzez przyłączanie w lub w pobliżu miejsca wiążącego lub miejsc wiążących na cząsteczce, często wpływa na powinowactwo lub specyficzność cząsteczki wobec jej docelowego antygenu.
5 35 16 [0075] Korzystnie, dodanie PEG lub innego polimeru nie wpływa na powinowactwo wiązania się z antygenem ani na specyficzność przeciwciała cząsteczki wiążącej się z NogoA lub NiG. Określenie nie wpływa na powinowactwo wiązania się z antygenem ani na specyficzność oznacza, że połączona przez PEG cząsteczka wiążąca się z NogoA lub NiG ma IC50 lub ND50 nie większe niż % w stosunku do IC50 lub ND50, odpowiednio, niepołączonej przez PEG cząsteczki wiążącej się z NogoA lub NiG mającej taką samą pojedynczą domenę zmienną przeciwciała. Ewentualnie, określenie nie wpływa na powinowactwo wiązania się z antygenem ani na specyficzność oznacza, że połączona przez PEG postać cząsteczki wiążącej się z NogoA lub NiG zachowuje co najmniej 90% aktywności wiązania się z antygenem nie-peg-ylowanej postaci polipeptydu. [0076] PEG lub inny polimer użyteczne do zwiększania okresu półtrwania in vivo zasadniczo mają wielkość około 5000 do 50000 daltonów, na przykład, około 5,000 kd-,000 kd, 5,000 kd-,000 kd, 5,000 kd-,000 kd, 5,000-,000 kd, 5,000-,000 kd, 5,000 kd-35,000 kd, 5,000 kd-40,000 kd, lub około 5,000 kd-45,000. Wybór rozmiaru polimeru zależy od zamierzonego zastosowania kompleksu. Na przykład, tam, gdzie pożądana jest penetracja litej tkanki, na przykład, guza, korzystne jest zastosowanie małego polimeru, rzędu lub około 5,000 kd. Natomiast tam, gdzie pożądane jest utrzymanie kompleksu w krążeniu mogą być stosowane większe polimery, na przykład,,000 kd do 40,000 kd lub większe. [0077] Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku mogą zawierać terapeutycznie skuteczną ilość lub profilaktycznie skuteczną ilość cząsteczki wiążącej się z NogoA lub NiG według wynalazku. Terapeutycznie skuteczna ilość odnosi się do ilości skutecznej, w dawce i przez okres czasu konieczny dla osiągnięcia pożądanego efektu terapeutycznego. Terapeutycznie skuteczna ilość cząsteczki wiążącej się z NogoA lub NiG według wynalazku może się różnić w zależności od czynników, takich jak stan chorobowy, wiek, płeć i masa osobnika, oraz zdolność cząsteczki wiążącej się z NogoA lub NiG według wynalazku do wywołania pożądanej odpowiedzi u osobnika. Ilość skuteczna terapeutycznie to również taka, przy której efekty terapeutycznie korzystne przewyższają wszelkie toksyczne lub szkodliwe działania cząsteczki wiążącej się z NogoA lub NiG według wynalazku. Profilaktycznie skuteczna ilość odnosi się do ilości skutecznej, w dawce i przez okres czasu konieczny dla osiągnięcia pożądanego efektu profilaktycznego. [0078] W znaczeniu stosowanym w niniejszym dokumencie, określenie wiąże się specyficznie odnosi się do wiązania antygenu przez cząsteczkę wiążącą się z NogoA lub NiG według wynalazku ze stałą dysocjacji (Kd) 1 µm lub niższą w pomiarze metodą
5 35 17 powierzchniowego rezonansu plazmonowego przy użyciu, na przykład, systemu do powierzchniowego rezonansu plazmonowego BIAcore(r) i oprogramowania do analizy kinetycznej BIAcore(r). [0079] Termin polipeptyd, jeśli nie określono inaczej w niniejszym dokumencie, obejmuje dowolny polipeptyd lub białko zawierające aminokwasy połączone ze sobą wiązaniami peptydowymi, o sekwencji aminokwasowej zaczynającej się od N- końca i kończącej się na C-końcu. Korzystnie, polipeptyd według niniejszego wynalazku jest przeciwciałem monoklonalnym, korzystniej jest chimerycznym (określanym także jako przeciwciało z przeszczepami V) lub humanizowanym (z przeszczepionymi regionami CDR) przeciwciałem monoklonalnym. Humanizowane (z przeszczepionymi regionami CDR) lub w pełni ludzkie przeciwciało monoklonalne może, ale nie musi zawierać kolejnych mutacji wprowadzanych do sekwencji regionu zrębowego (FR) przeciwciała-biorcy. [0080] Funkcjonalna pochodna polipeptydu w znaczeniu stosowanym w niniejszym dokumencie obejmuje cząsteczkę wykazującą jakościową aktywność biologiczną wspólną z polipeptydem według wynalazku, tj. wykazującą zdolność wiązania z ludzkim NogoA lub ludzkim NiG. Funkcjonalna pochodna obejmuje fragmenty i analogi peptydowe polipeptydu według niniejszego wynalazku. Fragmenty zawierają regiony w obrębie sekwencji polipeptydu według niniejszego wynalazku, na przykład o określonej sekwencji. Termin pochodna jest stosowany w celu określenia wariantów sekwencji aminokwasowych i kowalencyjnych modyfikacji polipeptydu według niniejszego wynalazku, na przykład określonej sekwencji. Funkcjonalne pochodne polipeptydu według niniejszego wynalazku, na przykład określonej sekwencji, na przykład regionu hiperzmiennego lekkiego i ciężkiego łańcucha, korzystnie wykazują co najmniej około 90%, korzystniej co najmniej około 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% całkowitej identyczności sekwencji z sekwencją aminokwasową polipeptydu według niniejszego wynalazku, na przykład określoną sekwencją i zasadniczo zachowują zdolność do wiązania się z ludzkim NogoA lub ludzkim NiG. [0081] W znaczeniu stosowanym w niniejszym dokumencie, określenie domena zmienna odnosi się do polipeptydu mającego sekwencję pochodzącą od regionu V immunoglobuliny ssaczej linii germinalnej. Sekwencja pochodzi od regionu V ssaczej linii germinalnej, gdy sekwencja jest albo izolowana od osobnika ludzkiego, izolowana od zwierzęcia niebędącego człowiekiem, takiego jak gryzoń, na przykład mysz, gdzie zwierzę niebędące człowiekiem jest zdolne do wytwarzania ludzkich immunoglobulin w odpowiedzi na immunogen, korzystniej wymienione zwierzę niebędące człowiekiem nie
5 35 18 jest zdolne do wytwarzania przeciwciała endogennego dla jego gatunków, izolowana z biblioteki sklonowanych sekwencji genów przeciwciał ludzkich (lub biblioteki sekwencji genu regionu V ludzkiego przeciwciała), lub gdy sklonowaną sekwencję regionu V ludzkiej linii germinalnej zastosowano do wytworzenia jednej lub większej liczby zróżnicowanych sekwencji (metodą mutagenezy losowej lub ukierunkowanej), którą następnie wyselekcjonowano do wiązania z żądanym docelowym antygenem. Minimalnie, zmienna domena ludzkiej immunoglobuliny wykazuje co najmniej 85% podobieństwo aminokwasów (włączając, na przykład, 87%, 90%, 93%, 95%, 97%, 99% lub wyższe podobieństwo) z naturalnie występującą sekwencją zmiennej domeny ludzkiej immunoglobuliny. Alternatywnie lub dodatkowo, domena zmienna jest zmienną domeną immunoglobuliny, która zawiera cztery regiony zrębowe zmiennej domeny immunoglobuliny (FW1-FW4), korzystnie ludzkie, takie jak regiony zrębowe przedstawione przez Kabata i wsp. (1991,). Regiony zrębowe zmiennej domeny obejmują a) sekwencję aminokwasową regionu zrębowego, korzystnie ludzkiego, i b) region zrębowy zawierający co najmniej 8 sąsiadujących aminokwasów o sekwencji aminokwasowej ludzkiego regionu zrębowego. Zmienna domena przeciwciała może zawierać sekwencje aminokwasowe FW1-FW4, które są takie same jak sekwencje aminokwasowe odpowiednich regionów zrębowych kodowane przez segment genu przeciwciała linii germinalnej, korzystnie ludzki, lub może zawierać domenę zmienną, której sekwencje FW1-FW4 łącznie mają do różnic w sekwencjach aminokwasowych (na przykład, do 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 lub różnic w sekwencjach aminokwasowych) w stosunku do sekwencji aminokwasowych odpowiednich regionów zrębowych kodowanych przez segment genu przeciwciała linii germinalnej, korzystnie ludzki. W znaczeniu stosowanym w niniejszym dokumencie, określenie uniwersalny zrąb odnosi się sekwencji zrębu pojedynczego przeciwciała odpowiadającej regionom przeciwciała konserwatywnym pod względem sekwencji, jak określili Kabat i wsp. (1991) lub odpowiadającej repertuarowi lub strukturze immunoglobuliny ludzkiej linii germinalnej, jak określili Chothia i Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196: 9-917. Wynalazek dostarcza zastosowania pojedynczego zrębu, lub zestawu takich zrębów, które, jak stwierdzono, umożliwiają otrzymanie praktycznie każdej specyficzności wiązania poprzez zmiany w samych regionach hiperzmiennych. W jednym wykonaniu, regiony hiperzmienne lub CDR specyficznie wiążą się z NogoA i/lub NiG. Termin modyfikacja kowalencyjna obejmuje modyfikacje polipeptydu według niniejszego wynalazku, na przykład o określonej sekwencji; lub jego fragmentu przy użyciu organicznego białkowego lub niebiałkowego środka derywatyzującego, fuzje do heterologicznych sekwencji polipeptydów oraz
5 35 19 posttranslacyjne modyfikacje. Kowalencyjnie modyfikowane polipeptydy, na przykład o określonych sekwencjach, ciągle wykazują zdolność wiązania się z ludzkim NogoA lub ludzkim NiG poprzez wiązanie krzyżowe. Modyfikacje kowalencyjne tradycyjnie wprowadza się poprzez poddawanie reakcji docelowych reszt aminokwasowych z organicznym środkiem derywatyzującym, który posiada zdolność reakcji z wybranymi łańcuchami bocznymi lub resztami terminalnymi, lub wykorzystując mechanizmy posttranslacyjnych modyfikacji, funkcjonujące w wybranych rekombinowanych komórkach gospodarza. Pewne posttranslacyjne modyfikacje są wynikiem działania rekombinowanych komórek gospodarza na ulegający ekspresji polipeptyd. Reszty glutaminylowe i asparaginylowe są często posttranslacyjnie dezaminowane do odpowiednich reszt glutamylowych i aspartylowych. Alternatywnie, reszty te są dezaminowane w warunkach słabo kwasowych. Inne posttranslacyjne modyfikacje obejmują hydroksylowanie proliny i lizyny, fosforylowanie grup hydroksylowych reszt serylowych, tyrozynowych lub treonylowych, metylowanie grup α-aminowych łańcuchów bocznych lizyny, argininy i histydyny, zob., na przykład, T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, str. 79-86 (1983). Modyfikacje kowalencyjne obejmują, na przykład, białka fuzyjne zawierające polipeptyd według niniejszego wynalazku, na przykład o określonej sekwencji i wariantach tych sekwencji aminokwasowych, takie jak immunoadhezyny oraz N-końcowe produkty fuzji do heterologicznych sekwencji sygnałowych. [0082] Identyczność w odniesieniu do natywnego polipeptydu i jego funkcjonalnej pochodnej definiuje się w niniejszym dokumencie jako zawartość procentową reszt aminokwasowych w sekwencji-kandydacie, które są identyczne z resztami odpowiadającego natywnego polipeptydu, po dopasowaniu sekwencji i wprowadzeniu przerw, jeśli to konieczne, w celu osiągnięcia maksymalnej procentowej identyczności i bez rozważania jakichkolwiek konserwatywnych substytucji jako części identyczności sekwencji. Nie poddaje się interpretacji wydłużeń N- ani C-końca, ani insercji, jako zmniejszających identyczność. Sposoby i programy komputerowe stosowania do dopasowywania są dobrze znane, zob. Altschul i wsp. supra. [0083] Termin aminokwas(y) odnosi się do występujących w przyrodzie L-αaminokwasów, na przykład i z włączeniem D-aminokwasów. Aminokwasy oznaczane są za pomocą dobrze znanego oznaczenia jednoliterowego lub trójliterowego. [0084] Termin wariant sekwencji aminokwasowej odnosi się do cząsteczek z pewnymi różnicami w ich sekwencji aminokwasowej w porównaniu z polipeptydem według niniejszego wynalazku, na przykład, o określonej sekwencji. Warianty sekwencji
5 35 aminokwasowej polipeptydu według niniejszego wynalazku, na przykład o określonej sekwencji, ciągle mają zdolność wiązania się z ludzkim NogoA lub ludzkim NiG. Warianty substytucyjne to te, w których w polipeptydzie według niniejszego wynalazku, na przykład o określonej sekwencji, usunięto przynajmniej jedną resztę aminokwasową i w jej miejsce wstawiono inny aminokwas w tej samej pozycji. Substytucje te mogą być pojedyncze w przypadku gdy podstawiono tylko jeden aminokwas w cząsteczce, lub wielokrotne gdy w tej samej cząsteczce podstawiono dwa lub większą liczbę aminokwasów. Warianty insercyjne to te, w których jeden lub większą liczbę aminokwasów wstawiono w pozycji bezpośrednio sąsiadującej z aminokwasem w polipeptydzie według niniejszego wynalazku, na przykład o określonej sekwencji. Pozycja bezpośrednio sąsiadująca z aminokwasem oznacza połączenie z α-karboksylową lub α- aminową grupą funkcyjną aminokwasu. Warianty delecyjne to te, w których usunięto jeden lub większą liczbę aminokwasów w polipeptydzie według niniejszego wynalazku, na przykład o określonej sekwencji. Zazwyczaj warianty delecyjne mają usunięty jeden lub dwa aminokwasy w danym regionie cząsteczki. [0085] Cząsteczkę wiążącą według wynalazku można wytworzyć technikami rekombinacji DNA. Zasadniczo, cząsteczki kwasów nukleinowych i konstrukty wektorowe wymagane do realizacji niniejszego wynalazku można skonstruować i stosować w sposób opisany w standardowych podręcznikach laboratoryjnych, takich jak Sambrook i wsp. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Stany Zjednoczone. Zatem, należy skonstruować jedną lub większą liczbę cząsteczek DNA kodujących cząsteczkę wiążącą, połączyć z odpowiednimi sekwencjami kontrolnymi i przenieść do odpowiedniego organizmu gospodarza w celu ekspresji. [0086] Bardzo zasadniczo, dostarczane są zatem w niniejszym dokumencie: (i) cząsteczki DNA kodujące region hiperzmienny, miejsce wiążące antygen, łańcuch przeciwciała lub jego fragment, lub jednodomenową cząsteczkę wiążącą według niniejszego wynalazku; oraz (ii) zastosowanie cząsteczki DNA według wynalazku do wytwarzania cząsteczki wiążącej według niniejszego wynalazku technikami rekombinacji. [0087] Obecny stan techniki pozwala osobom biegłym w dziedzinie na syntezę cząsteczki DNA według wynalazku na podstawie informacji dostarczanych w niniejszym dokumencie, tj. sekwencji aminokwasowych regionów hiperzmiennych i sekwencji DNA je kodujących. Sposób konstrukcji genu domeny zmiennej opisano, na przykład, w EP 239 400 i można go streścić następująco: Klonuje się gen kodujący domenę zmienną monoklonalnego przeciwciała o dowolnej specyficzności. Określa się segmenty DNA