(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 7639 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 16/23 EP 7639 B1 (13) (1) T3 Int.Cl. C07K 16/24 (06.01) A61K 39/39 (06.01) C12N 1/13 (06.01) A61P 37/06 (06.01) A61P 3/00 (06.01) (4) Tytuł wynalazku: CZĄSTECZKI PRZECIWCIAŁ, KTÓRE WIĄŻĄ IL-17A I IL - 17 F () Pierwszeństwo: GB (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 09/28 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 16/12 (73) Uprawniony z patentu: UCB Biopharma SPRL, Brussels, BE (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP 7639 T3 RALPH ADAMS, Slough, GB ANDREW GEORGE POPPLEWELL, Slough, GB STEPHEN EDWARD RAPECKI, Slough, GB (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Wojciech Tykarski SULIMA GRABOWSKA SIERZPUTOWSKA BIURO PATENTÓW I ZNAKÓW TOWAROWYCH SP.J. -1 Building ul. Puławska Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 SGS-8488/VAL EP B1 Opis [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy cząsteczek przeciwciał o specyficzności względem determinant antygenowych zarówno IL-17A, jak i IL-17F. Niniejszy wynalazek dotyczy również zastosowań terapeutycznych tych cząsteczek przeciwciał i sposobów ich wytwarzania. [0002] Interleukina 17 (IL-17), znana również jako CTLA-8 lub IL-17A, jest cytokiną prozapalną, która stymuluje wydzielanie szerokiej gamy innych cytokin z różnych komórek nieimmunologicznych. IL-17A jest zdolna do indukowania wydzielania IL-6, IL-8, PGE2, MCP-1, G-CSF przez komórki adherentne, takie jak fibroblasty, keratynocyty, komórki nabłonka i śródbłonka, a także jest zdolna do indukowania ekspresji powierzchniowej ICAM-1, proliferacji komórek T oraz wzrostu i różnicowania się ludzkich komórek progenitorowych CD34+ do neutrofilów, gdy są one hodowane razem w obecności napromieniowanych fibroblastów (Fossiez i in., 1998, Int.Rev.Immunol. 16, 41-1). IL-17A jest głównie wytwarzana przez aktywowane komórki T pamięci i działa przez wiązanie z wszechobecnie rozmieszczonym powierzchniowym receptorem komórkowym (IL-17R) (Yao i in., 1997, Cytokine, 9, ). Może ona również działać przez wiązanie z kompleksem IL-17RA i IL-17RC (Toy i in., 06, J. Immunol. 177(11); 36-39). Komórki T wytwarzające IL-17, zwane również komórkami TH17, odgrywają rolę w patogenezie niektórych nowotworów (Weaver i in., 06, Immunity, 24, ; Langowski i in., 06, 442, ; Iwakura i Ishigame, 06, J.Clin.Invest. 116,, ). [0003] Zidentyfikowano szereg homologów IL-17, które pełnią zarówno podobne, jak i różne role w regulacji odpowiedzi zapalnych. W celu przeglądu rodzin cytokin/receptorów IL-17 patrz Dumont, 03, Expert Opin. Ther. Patents, 13, Jednym z takich homologów jest IL-17F, znana również jako IL-24 i ML-1, która jest w około % identyczna z IL-17A i uważa się, że ma wspólne receptory z IL-17A (Kolls i Linden 04, Immunity, 21, ; Hymowitz, i in., 01, EMBO J. (19), ; Kuestner i in., 07, Journal of Immunology, 179, ). [0004] Zarówno IL-17A, jak i IL-17F mogą tworzyć białka homodimeryczne i heterodimeryczne, z których wszystkie są wytwarzane przez aktywowane ludzkie komórki T CD4+ (Wright i in., 07, J Biol Chem. 282 (18), ). [000] IL-17 może przyczyniać się do wielu chorób, w których pośredniczą nieprawidłowe odpowiedzi immunologiczne, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów i zapalenie dróg oddechowych, jak również odrzucenie przeszczepu narządu i odporność przeciwnowotworowa. Inhibitory aktywności IL-17 są dobrze znane w dziedzinie, na przykład białko fuzyjne mysi IL-17R:ludzki Fc, mysi rozpuszczalny IL-17R i przeciwciało monoklonalne anty- IL-17 zostały użyte w celu wykazania roli IL-17 w różnych modelach reumatoidalnego zapalenia stawów (Lubberts i in., J.Immunol. 01,167, 04-13; Chabaud i in., Arthritis Res. 01, 3, ). Ponadto neutralizujące przeciwciała poliklonalne stosowano w celu zmniejszenia powstawania zrostu otrzewnowego (Chung i in., 02, J. Exp. Med., 19, ). Pochodzące od szczura przeciwciała przeciwko ludzkiej IL-17 opisano w WO04/6377. Humanizowane przeciwciało anty-il-17 z powinowactwem około 2 pm opisano w WO06/0409. W pełni ludzkie przeciwciało monoklonalne anty-il-17 z powinowactwem około 188 pm opisano w WO06/0137. Przeciwciała, które wiążą IL- 17F i heterodimery IL-17A/IL-17F opisano w WO06/ Przeciwciała, które specyficznie wiążą heterodimer IL-17A/IL-17F opisano w WO0/0044. [0006] Antagonizm IL-17F został skojarzony z ochroną przed astmą (Kawaguchi i in., 06, J.Allergy Clin. Immunol. 117(4); ) i uważa się również, że IL-17F odgrywa rolę w patologii zapalenia stawów (Lubberts 03, Current Opinion in Investigational Drugs, 4 (), 72-77).

3 [0007] W związku z tym podwójni antagoniści IL-17A i IL-17F mogą być bardziej skuteczni niż pojedynczy antagonista w leczeniu chorób, w których pośredniczy IL-17. Przeciwciała, które wiążą IL-17A i IL-17F opisano w WO07/6769 opublikowanym Kozie przeciwciała poliklonalne IgG wobec ludzkiej IL-17 są dostępne z R&D Systems, numer katalogowy: AF-317-NA. [0008] Byliśmy w stanie wykazać, że możliwe jest wydzielenie przeciwciała, które jest zdolne do wiązania zarówno z IL-17A, jak i IL-17F i jest zdolne do neutralizacji aktywności obu izoform IL-17. W związku z tym niniejsze ujawnienie dostarcza przeciwciało anty- IL-17, które jest zdolne do wiązania zarówno z IL-17A, jak i IL-17F. W szczególności dostarcza się przeciwciało neutralizujące, które wiąże ludzką IL-17A i ludzką IL-17F, zawierające łańcuch ciężki i łańcuch lekki, przy czym domena zmienna łańcucha ciężkiego zawiera sekwencję przedstawioną w SEQ ID NO:9, a domena zmienna łańcucha lekkiego zawiera sekwencję przedstawioną w SEQ ID NO:7 lub sekwencję co najmniej w 9% identyczną do niej i przy czym to przeciwciało ma powinowactwo do IL-17A lepsze niż pm oraz powinowactwo do IL-17F lepsze niż 2 nm. [0009] W szczególności, przeciwciało według niniejszego wynalazku jest zdolne do specyficznego wiązania zarówno z IL-17A, jak i IL-17F, to znaczy przeciwciało nie wiąże innych izoform IL-17. Korzystnie, przeciwciało według niniejszego wynalazku wiąże również heterodimer IL-17A/IL-17F. Korzystnie, przeciwciało według niniejszego wynalazku neutralizuje aktywność zarówno IL-17A, jak i IL-17F. W jednej postaci przeciwciało według niniejszego wynalazku również neutralizuje aktywność heterodimeru IL-17A/IL-17F. Przeciwciała według niniejszego wynalazku wykazują zatem korzystną właściwość taką, że mogą hamować biologiczną aktywność zarówno IL-17A, jak i IL-17F. W związku z tym, niniejszy wynalazek dostarcza także zastosowania takich przeciwciał w leczeniu i/lub profilaktyce choroby, w której pośredniczy jedna lub obie z IL-17A i IL-17F, takiej jak choroba autoimmunologiczna lub zapalna, lub rak. [00] Stosowane w niniejszym opisie określenie przeciwciało neutralizujące opisuje przeciwciało, które jest zdolne do neutralizacji biologicznej aktywności sygnałowej zarówno IL-17A, jak i IL17F, na przykład przez blokowanie wiązania IL-17A i IL-17F z jednym lub większą liczbą ich receptorów i przez blokowanie wiązania się heterodimeru IL-17A/IL-17F z jednym lub większą liczbą jego receptorów. Będzie zrozumiałe, że użyte tu określenie neutralizacja odnosi się do zmniejszenia biologicznej aktywności sygnałowej, które może być częściowe lub całkowite. Ponadto, będzie zrozumiałe, że stopień neutralizacji aktywności IL-17A i IL-17F przez przeciwciało może być taki sam lub różny. W jednej postaci, stopień neutralizacji aktywności heterodimeru IL-17A/IL-17F może być taki sam lub różny, jak stopień neutralizacji aktywności IL-17A lub IL-17F. [0011] W jednej postaci przeciwciała według niniejszego wynalazku wiążą się specyficznie z IL-17A i IL-17F. Specyficznie wiążące oznacza, że przeciwciała mają większe powinowactwo do polipeptydów IL-17A i IL-17F (w tym heterodimeru IL-17A/ IL-17F), niż do innych polipeptydów. Korzystnie, polipeptydy IL-17A i IL-17F są ludzkie. W jednej postaci przeciwciało wiąże się również z IL-17F małpy cynomolgus. [0012] Polipeptydy IL-17A lub IL-17F, lub mieszaninę tych dwóch albo komórki wykazujące ekspresję jednego lub obu z tych polipeptydów można stosować do wytwarzania przeciwciał, które specyficznie rozpoznają oba polipeptydy. Polipeptydy IL-17 (IL-17A i IL- 17F) mogą być dojrzałymi polipeptydami lub ich biologicznie aktywnymi fragmentami, lub pochodnymi, które korzystnie zawierają miejsce wiązania receptora. Korzystnie, polipeptydy IL-17 są dojrzałymi polipeptydami. Polipeptydy IL-17, można wytwarzać sposobami dobrze znanymi w dziedzinie, z genetycznie zmodyfikowanych komórek gospodarzy zawierających systemy ekspresji lub można je odzyskiwać z naturalnych źródeł biologicznych. W niniejszym zgłoszeniu, określenie polipeptydy obejmuje peptydy, polipeptydy i białka. Są one stosowane wymiennie, chyba że podano inaczej. Polipeptyd IL-17 może w niektórych przypadkach być częścią większego białka, takiego jak białko fuzyjne, na przy-

4 kład w fuzji ze znacznikiem powinowactwa. Przeciwciała wytworzone przeciwko tym polipeptydom można otrzymać, gdy konieczna jest immunizacja zwierzęcia, przez podawanie polipeptydów zwierzęciu, korzystnie zwierzęciu innemu niż człowiek, z użyciem dobrze znanych i rutynowych protokołów, patrz na przykład Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir (red.), tom 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, Anglia, 1986). Immunizowanych może być wiele zwierząt ciepłokrwistych, takich jak króliki, myszy, szczury, owce, krowy lub świnie. Jednak na ogół korzystne są myszy, króliki, świnie i szczury. [0013] Przeciwciała do stosowania w niniejszym wynalazku obejmują całe przeciwciała i ich funkcjonalnie aktywne fragmenty lub pochodne i mogą to być, ale nie wyłącznie, przeciwciała monoklonalne, wielowartościowe, wielospecyficzne, humanizowane lub chimeryczne, przeciwciała domenowe, na przykład VH, VL, VHH, przeciwciała jednołańcuchowe, fragmenty Fab, fragmenty Fab' i F(ab')2 i fragmenty wiążące epitop z któregokolwiek z powyższych. Inne fragmenty przeciwciał obejmują te opisane w międzynarodowych zgłoszeniach patentowych WO , WO i WO Fragmenty przeciwciał i sposoby ich wytwarzania są dobrze znane w dziedzinie, patrz na przykład Verma i in., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, ; Adair i Lawson, 0. Therapeutic antibodies. Drug Design Reviews - Online 2(3): [0014] Przeciwciała do stosowania w niniejszym wynalazku obejmują cząsteczki immunoglobulin i immunologicznie aktywne części cząsteczek immunoglobulin, to znaczy cząsteczek, które zawierają miejsce wiążące antygen, które specyficznie wiąże antygen. Cząsteczki immunoglobulin według wynalazku mogą być jakiejkolwiek klasy (na przykład IgG, IgE, IgM, IgD i IgA) lub podklasy cząsteczek immunoglobulin. [001] Przeciwciała monoklonalne można wytworzyć dowolnym sposobem znanym w tej dziedzinie, takim jak technika hybrydoma (Kohler i Milstein, 197, Nature, 26:49-497), technika trioma, technika hybrydoma ludzkich komórek B (Kozbor i in., 1983, Immunology Today, 4:72) i technika EBV-hybrydoma (Cole i in., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, str , Alan R Liss, Inc., 198). [0016] Przeciwciała do stosowania w wynalazku mogą być również wytwarzane z użyciem metod przeciwciała pojedynczego limfocytu przez klonowanie i ekspresję cdna regionu zmiennego immunoglobulin wytwarzanych przez pojedyncze limfocyty wybrane do wytwarzania specyficznych przeciwciał, na przykład metodami opisanymi przez Babcook, J. i in., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(1): ; WO92/021; WO04/01268 i międzynarodowe zgłoszenie patentowe numer WO04/6377. [0017] Humanizowane przeciwciała są cząsteczkami przeciwciał z gatunków innych niż człowiek mającymi jeden lub większą liczbę regionów determinujących komplementarność (CDR) z gatunku innego niż człowiek oraz region zrębowy z ludzkiej cząsteczki immunoglobuliny (patrz na przykład US 8089; WO91/09967). [0018] Przeciwciała chimeryczne są przeciwciałami kodowanymi przez geny immunoglobulin, które zostały zmodyfikowane genetycznie tak, że geny łańcuchów lekkich i ciężkich składają się z segmentów genów immunoglobulin należących do różnych gatunków. Te chimeryczne przeciwciała są prawdopodobnie mniej antygeniczne. Przeciwciała dwuwartościowe można wytworzyć sposobami znanymi w dziedzinie (Milstein i in., 1983, Nature :37-39; WO 93/08829, Traunecker i in., 1991, EMBO J. :36-369). Przeciwciała wielowartościowe mogą zawierać wiele specyficzności lub mogą być monospecyficzne (patrz na przykład WO 92/2283 i WO0/11360). [0019] Przeciwciała do stosowania w niniejszym wynalazku można również wytwarzać z użyciem różnych sposobów prezentacji fagowej znanych w dziedzinie i obejmują te, ujawnione przez Brinkman i in. (w J. Immunol. Methods, 199, 182: 41-0), Ames i in. (J. Immunol. Methods, 199, 184: ), Kettleborough i in. (Eur. J. Immunol. 1994, 24:92-98), Persic i in. (Gene, ), Burton i in. (Advances in Immunology, 1994, 7: ) i WO 90/02809; WO 91/737; WO 92/047; WO 92/18619; WO 93/11236;

5 WO 9/1982; WO 9/401; i US ; ; ; 80717; ; 7073; 8247; 71698; ; 16637; 78022; 68727; i Techniki wytwarzania przeciwciał jednołańcuchowych, takie jak te opisane w US mogą być również dostosowane do wytwarzania jednołańcuchowych przeciwciał, które wiążą się z IL-17A i IL-17F. Ponadto, myszy transgeniczne lub inne organizmy, w tym inne ssaki, mogą być stosowane do ekspresji przeciwciał humanizowanych. [00] Reszty w zmiennych domenach przeciwciał są umownie ponumerowane zgodnie z systemem opracowanym przez Kabata i in. Ten system jest przedstawiony w Kabat i in. 1987, w Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA (dalej określanym jako Kabat i in. (powyżej) ). Ten system numeracji jest stosowany w niniejszym opisie, chyba że zaznaczono inaczej. [0021] Oznaczenia reszt według Kabata nie zawsze odpowiadają bezpośrednio liniowej numeracji reszt aminokwasowych. Rzeczywista liniowa sekwencja aminokwasów może zawierać mniej lub dodatkowe aminokwasy w porównaniu ze ścisłą numeracją Kabata, co odpowiada skróceniu lub wstawieniu do elementu strukturalnego, czy regionu zrębowego lub determinującego komplementarność (CDR), podstawowej struktury domeny zmiennej. Prawidłową numerację reszt według Kabata można określić dla danego przeciwciała przez ustawienie reszt homologicznych w sekwencji przeciwciała ze standardową sekwencją ponumerowaną według Kabata. [0022] CDR domeny zmiennej łańcucha ciężkiego znajdują się w resztach 31-3 (CDR- H1), resztach 0-6 (CDR-H2) i resztach 9-2 (CDR-H3), zgodnie z systemem numeracji Kabata. Jednakże, zgodnie z Chothia (Chothia, C. i Lesk, A.M. J. Mol. Biol., 196, (1987)), pętla równoważna z CDR-H1 rozciąga się od reszty 26 do reszty 32. Tak więc stosowane tu określenie CDR-H1 obejmuje reszty od 26 do 3, jak opisano przez połączenie systemu numeracji Kabata i definicji topologicznej pętli według Chothii. [0023] CDR domeny zmiennej łańcucha lekkiego znajdują się w resztach (CDR-L1), resztach 0-6 (CDR-L2) i resztach (CDR-L3), zgodnie z systemem numeracji Kabata. [0024] W jednej postaci ujawnienie dostarcza przeciwciało neutralizujące, wykazujące specyficzność wobec ludzkiej IL-17A i ludzkiej IL-17F, zawierające ciężki łańcuch, przy czym domena zmienna łańcucha ciężkiego zawiera sekwencję podaną w SEQ ID NO:1 dla CDR-H1, sekwencję podaną w SEQ ID NO:2 dla CDR-H2 i sekwencję podaną w SEQ ID NO:3 dla CDR-H3. [002] W innej postaci niniejsze ujawnienie dostarcza przeciwciało neutralizujące, wykazujące specyficzność wobec ludzkiej IL-17A i ludzkiej IL-17F, zawierające lekki łańcuch, przy czym domena zmienna zawiera sekwencję podaną w SEQ ID NO:4 dla CDR-L1, sekwencję podaną w SEQ ID NO: dla CDR-L2 i sekwencję podaną w SEQ ID NO:6 dla CDR-L3. [0026] Cząsteczki przeciwciał według niniejszego ujawnienia korzystnie zawierają odpowiednio komplementarny łańcuch lekki lub komplementarny łańcuch ciężki. [0027] Zatem, w jednej postaci, przeciwciało zawiera łańcuch ciężki, przy czym domena zmienna łańcucha ciężkiego zawiera sekwencję podaną w SEQ ID NO: 1 dla CDR-H1, sekwencję podaną w SEQ ID NO:2 dla CDR-H2 i sekwencję podaną w SEQ ID NO:3 dla CDR-H3 i łańcuch lekki, przy czym domena zmienna łańcucha lekkiego zawiera sekwencję podaną w SEQ ID NO:4 dla CDR-L1, sekwencję podaną w SEQ ID NO: dla CDR-L2 i sekwencję podaną w SEQ ID NO:6 dla CDR-L3. [0028] Będzie zrozumiałe, że w dostarczonych przez niniejsze ujawnienie CDR można dokonać jedno lub większą liczbę podstawień aminokwasowych bez znaczącej zmiany zdolności przeciwciała do wiązania z IL-17A i IL-17F i neutralizacji aktywności IL-17A i IL-17F. Wpływ wszelkich podstawień aminokwasowych na wiązanie i neutralizację może być łatwy do sprawdzenia przez specjalistę w dziedzinie, na przykład z użyciem opisanych tu sposobów. W związku z tym, niniejsze ujawnienie dostarcza przeciwciało zawierające

6 CDR wybrane spośród CDRH-1 (SEQ ID NO:1), CDRH-2 (SEQ ID NO:2), CDRH-3 (SEQ ID NO:3), CDRL-1 (SEQ ID NO:4), CDRL-2 (SEQ ID NO:) i CDRL-3 (SEQ ID NO:6), przy czym jeden lub większa liczba aminokwasów w jednym lub większej liczbie CDR, jest podstawiona przez inny aminokwas. Należy również zauważyć, że długość jednego lub większej liczby CDR może być zmieniona bez znaczącej zmiany zdolności przeciwciała do wiązania z IL-17A i IL-17F i neutralizacji aktywności IL-17A i IL-17F. [0029] W jednej postaci, przeciwciało według niniejszego ujawnienia zawiera ciężki łańcuch, przy czym domena zmienna ciężkiego łańcucha zawiera trzy CDR, przy czym sekwencja CDRH-1 wykazuje co najmniej 60% identyczności lub podobieństwa z sekwencją podaną w SEQ ID NO: 1, CDRH-2 wykazuje co najmniej 60% identyczności lub podobieństwa z sekwencją podaną w SEQ ID NO: 2 i/lub CDRH-3 wykazuje co najmniej 60% identyczności lub podobieństwa z sekwencją podaną w SEQ ID NO: 3. W innej postaci, przeciwciało według niniejszego ujawnienia zawiera ciężki łańcuch, przy czym domena zmienna ciężkiego łańcucha zawiera trzy CDR, przy czym sekwencja CDRH-1 wykazuje co najmniej 70%, 80%, 90%, 9% lub 98% identyczności lub podobieństwa z sekwencją podaną w SEQ ID NO:1, CDRH-2 wykazuje co najmniej 70%, 80%, 90%, 9% lub 98% identyczności lub podobieństwa z sekwencją podaną w SEQ ID NO:2 i/lub CDRH-3 wykazuje co najmniej 70%, 80%, 90%, 9% lub 98% identyczności lub podobieństwa z sekwencją podaną w SEQ ID NO:3. [00] Użyte tu określenie identyczność, oznacza, że w dowolnej określonej pozycji w dopasowanych sekwencjach, reszta aminokwasowa jest identyczna pomiędzy sekwencjami. Użyte tu określenie podobieństwo, oznacza, że w dowolnej określonej pozycji w dopasowanych sekwencjach, reszta aminokwasowa jest podobnego typu pomiędzy sekwencjami. Na przykład, leucyna może być podstawiona przez izoleucynę lub walinę. Inne aminokwasy, które często mogą być podstawione sobą nawzajem obejmują, ale nie wyłącznie: - fenyloalaninę, tyrozynę i tryptofan (aminokwasy mające aromatyczne łańcuchy boczne); - lizynę, argininę i histydynę (aminokwasy mające zasadowe łańcuchy boczne); - asparaginian i glutaminian (aminokwasy mające kwasowe łańcuchy boczne); - asparaginę i glutaminę (aminokwasy mające amidowe łańcuchy boczne); i - cysteinę i metioninę (aminokwasy mające łańcuchy boczne zawierające atom siarki). Stopnie identyczności i podobieństwa można łatwo obliczyć (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., red., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., red., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Część 1, Griffin, A.M., i Griffin, H.G., red., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; i Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. i Devereux, J., red., M Stockton Press, New York, 1991). [0031] W jednej postaci przeciwciało dostarczone przez niniejsze ujawnienie jest przeciwciałem monoklonalnym. [0032] W jednej postaci przeciwciało dostarczone przez niniejsze ujawnienie jest przeciwciałem chimerycznym. [0033] W jednej postaci przeciwciało dostarczone przez niniejsze ujawnienie jest cząsteczką przeciwciała z przeszczepionym CDR, zawierającą jeden lub większą liczbę CDR dostarczonych w SEQ ID NO: 1 do 6. Użyte tu określenie cząsteczka przeciwciała z przeszczepionym CDR odnosi się do cząsteczki przeciwciała, w której łańcuch ciężki i/lub lekki zawiera jeden lub większą liczbę CDR (w tym, jeśli jest to pożądane, jeden lub większą liczbę zmodyfikowanych CDR) z przeciwciała donorowego (na przykład mysiego przeciwciała monoklonalnego) przeszczepionych do zrębu regionu zmiennego łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego przeciwciała akceptorowego (na przykład ludzkiego przeciwciała). W celu przeglądu, patrz Vaughan i in., Nature Biotechnology, 16, 3-39, W

7 jednej postaci zamiast przeniesienia całych CDR, tylko jedna lub większa liczba reszt determinujących specyficzność z któregokolwiek z CDR opisanych tu powyżej, jest przenoszona na zrąb ludzkiego przeciwciała (patrz na przykład Kashmiri i in., 0, Methods, 36, 2-34). W jednej postaci tylko reszty determinujące specyficzność z jednego lub większej liczby CDR opisanych tu powyżej, są przenoszone na zrąb ludzkiego przeciwciała. W innej postaci tylko reszty determinujące specyficzność z każdego z CDR opisanych tu powyżej są przenoszone na zrąb ludzkiego przeciwciała. [0034] Korzystny region zrębowy dla łańcucha ciężkiego przeciwciała z przeszczepionym CDR według niniejszego wynalazku pochodzi z sekwencji ludzkiej VH wraz z JH4. Zgodnie z tym, dostarcza się neutralizujące przeciwciało z przeszczepionym CDR zawierające co najmniej jeden donorowy CDR niepochodzący od człowieka, przy czym region zrębowy łańcucha ciężkiego pochodzi z sekwencji ludzkiej podgrupy wraz z JH4. Sekwencja ludzkiego JH4 jest następująca: (YFDY) WGQGTLVTVSS. Motyw YFDY jest częścią CDR-H3 i nie jest częścią zrębu 4 (Ravetch, JV. i in., 1981, Cell, 27, 83-91). [003] Korzystny region zrębowy łańcucha lekkiego przeciwciała z przeszczepionym CDR według niniejszego wynalazku pochodzi z sekwencji podgrupy ludzkiej linii zarodkowej VK1 2-1-(1) L4 wraz z JK1. Zgodnie z tym, dostarcza się neutralizujące przeciwciało z przeszczepionym CDR zawierające co najmniej jeden donorowy CDR niepochodzący od człowieka, przy czym region zrębowy łańcucha lekkiego pochodzi z sekwencji ludzkiej podgrupy VK1 2-1-(1) L4 wraz z JK1. Sekwencja JK1 jest następująca: (WT) FGQGTKVEIK. Motyw WT jest częścią CDR-L3 i nie jest częścią zrębu 4 (Hieter, PA., i in., 1982, J. Biol. Chem., 27, ). [0036] Również w przeciwciele z przeszczepionym CDR według niniejszego ujawnienia regiony zrębowe nie muszą mieć dokładnie takiej samej sekwencji, jak te z przeciwciała akceptorowego. Na przykład, nietypowe reszty mogą być zmienione na reszty częściej występujące dla tej klasy lub typu łańcucha akceptorowego. Alternatywnie, wybrane reszty w akceptorowych regionach zrębowych mogą być zmienione tak, że odpowiadają reszcie znajdującej się w tej samej pozycji w przeciwciele donorowym (patrz Reichmann i in., 1998, Nature, 332, ). Takie zmiany powinny być ograniczone do minimum niezbędnego do odzyskania powinowactwa przeciwciała donorowego. Protokół do selekcji reszt w akceptorowych regionach zrębowych, które mogą być konieczne do zmiany, jest przedstawiony w WO 91/ [0037] Korzystnie w cząsteczce przeciwciała z przeszczepionym CDR według niniejszego ujawnienia, jeśli akceptorowy łańcuch ciężki ma ludzką sekwencję VH wraz z JH4, to akceptorowe regiony zrębowe łańcucha ciężkiego zawierają, oprócz jednego lub większej liczby donorowych CDR, resztę donorową co najmniej w pozycji 94 (zgodnie z Kabat i in., (powyżej)). W związku z tym, dostarcza się przeciwciało z przeszczepionym CDR, w którym co najmniej reszta w pozycji 94 domeny zmiennej łańcucha ciężkiego jest resztą donorową. [0038] Korzystnie, w cząsteczce przeciwciała z przeszczepionym CDR według niniejszego ujawnienia, jeśli akceptorowy łańcuch lekki zawiera sekwencję ludzkiej podgrupy VK1 2-1-(1) L4 wraz z JK1, to żadne reszty donorowe nie są przeniesione, czyli przeniesione są tylko CDR. W związku z tym, dostarcza się przeciwciało z przeszczepionym CDR, w którym tylko CDR są przeniesione na donorowy zrąb. [0039] Reszty donorowe są resztami z przeciwciała donorowego, to znaczy przeciwciała, z którego pierwotnie wywodzą się CDR. [0040] W jednej postaci, przeciwciało według niniejszego ujawnienia zawiera łańcuch ciężki, przy czym domena zmienna łańcucha ciężkiego zawiera sekwencję podaną w SEQ ID NO:9 (gh9). [0041] W jednej postaci, przeciwciało według niniejszego ujawnienia zawiera łańcuch lekki, przy czym domena zmienna łańcucha lekkiego zawiera sekwencję podaną w SEQ ID

8 NO:7 (gl7). [0042] W innej postaci, przeciwciało według niniejszego ujawnienia zawiera łańcuch lekki, przy czym domena zmienna łańcucha lekkiego zawiera sekwencję wykazującą co najmniej 9% identyczności lub podobieństwa z sekwencją podaną w SEQ ID NO:7. [0043] W jednej postaci, przeciwciało według niniejszego ujawnienia zawiera łańcuch ciężki, przy czym domena zmienna łańcucha ciężkiego zawiera sekwencję podaną w SEQ ID NO:9 i łańcuch lekki, przy czym domena zmienna łańcucha lekkiego zawiera sekwencję podaną w SEQ ID NO:7. [0044] W innej postaci ujawnienia, przeciwciało zawiera łańcuch ciężki i łańcuch lekki, przy czym domena zmienna łańcucha ciężkiego zawiera sekwencję mającą sekwencję podaną w SEQ ID NO:9, a domena zmienna łańcucha lekkiego zawiera sekwencję wykazującą co najmniej 9% identyczności lub podobieństwa z sekwencją podaną w SEQ ID NO:7. [004] Jak opisano tu powyżej, cząsteczka przeciwciała według niniejszego ujawnienia może obejmować pełną cząsteczkę przeciwciała posiadającą pełnej długości łańcuchy ciężkie i lekkie, lub jej fragment, tak jak przeciwciało domenowe, na przykład VH, VL, VHH, Fab, zmodyfikowany Fab, Fab', F(ab')2, Fv lub fragment scfv. [0046] Domeny regionów stałych cząsteczki przeciwciała według niniejszego wynalazku, jeśli występują, mogą być wybrane z uwzględnieniem proponowanej funkcji cząsteczki przeciwciała, w szczególności funkcji efektorowych, które mogą być wymagane. Na przykład, domeny regionów stałych mogą być ludzkimi domenami IgA, IgD, IgE, IgG lub IgM. W szczególności domeny regionu stałego ludzkiej IgG mogą być używane, zwłaszcza izotypów IgG1 i IgG3, gdy cząsteczka przeciwciała jest przeznaczona do zastosowań terapeutycznych i wymagane są funkcje efektorowe przeciwciała. Alternatywnie, izotypy IgG2 i IgG4 mogą być stosowane, gdy cząsteczka przeciwciała jest przeznaczona do zastosowań terapeutycznych i funkcje efektorowe przeciwciała nie są wymagane, na przykład do zwykłego blokowania aktywności IL-17. Na przykład, można użyć cząsteczki IgG4, w których seryna w pozycji 241 została zastąpiona proliną, jak opisano w Angal i in., Molecular Immunology, 1993, (1), -8. Szczególnie korzystna jest stała domena lgg4 zawierająca tę zmianę. [0047] W jednej postaci łańcuch ciężki przeciwciała zawiera domenę CH1, a łańcuch lekki przeciwciała zawiera domenę CL, kappa lub lambda. [0048] W korzystnej postaci, przeciwciało dostarczone w niniejszym wynalazku jest przeciwciałem neutralizującym o specyficzności względem ludzkiej IL-17A i ludzkiej IL-17F, w którym region stały łańcucha ciężkiego obejmuje region stały ludzkiej IgG4, w którym seryna w pozycji 241 została podstawiona przez prolinę w sposób opisany w Angal i in., powyżej. Zgodnie z tym, niniejszy wynalazek dostarcza przeciwciało, w którym łańcuch ciężki zawiera lub składa się z sekwencji podanej w SEQ ID NO:1. [0049] Korzystnie, przeciwciało zawiera łańcuch ciężki, przy czym ten łańcuch ciężki zawiera sekwencję wykazującą co najmniej 90%, 9% lub 98% identyczności lub podobieństwa z sekwencją podaną w SEQ ID NO:1. [000] W jednej postaci, cząsteczka przeciwciała według niniejszego wynalazku zawiera łańcuch lekki, obejmujący sekwencję podaną w SEQ ID NO:11. [001] Korzystnie, przeciwciało zawiera łańcuch lekki, przy czym ten łańcuch lekki zawiera sekwencję wykazującą co najmniej 90%, 9% lub 98% identyczności lub podobieństwa z sekwencją podaną w SEQ ID NO: 11. [002] W jednej postaci niniejszy wynalazek dostarcza przeciwciało, w którym łańcuch ciężki zawiera lub składa się z sekwencji podanej w SEQ ID NO: 1, a łańcuch lekki zawiera lub składa się z sekwencji podanej w SEQ ID NO: 11. [003] Dostarczony przez niniejsze ujawnienie jest również specyficzny region lub epitop z ludzkiej IL-17A i/lub specyficzny region lub epitop z ludzkiej IL-17F i/lub specyficzny region lub epitop z ludzkiego heterodimeru IL-17A/F, który jest wiązany przez przeciwciało dostarczone przez niniejszy wynalazek, w szczególności przeciwciało zawierające se-

9 kwencję łańcucha ciężkiego gh9 (SEQ ID NO: 9) i sekwencję łańcucha lekkiego gl7 (SEQ ID NO: 7). [004] Specyficzny region lub epitop ludzkiego polipeptydu IL-17A i specyficzny region lub epitop ludzkiego polipeptydu IL-17F, i specyficzny region lub epitop ludzkiego heterodimeru IL-17A/F można określić dowolną odpowiednią metodą mapowania epitopu znaną w dziedzinie, w połączeniu z którymkolwiek z przeciwciał dostarczonych przez niniejszy wynalazek. Przykłady takich metod obejmują przeszukiwanie peptydów o różnych długościach pochodzących z IL-17A i IL-17F pod kątem wiązania się z przeciwciałem według niniejszego wynalazku, przy czym najmniejszy fragment, który może specyficznie wiązać się z przeciwciałem zawiera sekwencję epitopu rozpoznawanego przez to przeciwciało. Peptydy IL-17 mogą być wytwarzane syntetycznie lub drogą proteolitycznego trawienia odpowiedniego polipeptydu IL-17. Peptydy, które wiążą przeciwciało można zidentyfikować, na przykład, przez analizę metodą spektrometrii mas. W innym przykładzie, do identyfikacji epitopu wiązanego przez przeciwciało według niniejszego wynalazku można użyć spektroskopię NMR. Po zidentyfikowaniu, fragment epitopu, który wiąże przeciwciało według niniejszego wynalazku może być stosowany, jeśli to konieczne, jako immunogen dla uzyskania dodatkowych neutralizujących przeciwciał, które wiążą ten sam epitop. [00] Przeciwciała, które blokują krzyżowo wiązanie przeciwciała według niniejszego wynalazku, w szczególności, przeciwciała zawierającego sekwencję ciężkiego łańcucha gh9 (SEQ ID NO: 9) i sekwencję lekkiego łańcucha gl7 (SEQ ID NO: 7) mogą być podobnie użyteczne w neutralizacji aktywności IL-17A i IL-17F. W związku z tym, niniejsze ujawnienie dostarcza również przeciwciało neutralizujące, które wiąże ludzką IL-17A i ludzką IL-17F, które krzyżowo blokuje wiązanie któregokolwiek z opisanych powyżej przeciwciał z ludzką IL-17A i/lub ludzką IL-17F, i/lub ludzkim heterodimerem IL-17A/F, i/lub jest krzyżowo blokowane przed wiązaniem IL-17A, i/lub IL-17F, i/lub ludzkiego heterodimeru IL-17A/F przez którekolwiek z tych przeciwciał. W jednej postaci takie przeciwciało wiąże się z tym samym epitopem, co przeciwciało opisane powyżej. [006] Przeciwciała blokujące krzyżowo można zidentyfikować z użyciem dowolnego odpowiedniego sposobu w dziedzinie, na przykład z użyciem kompetycyjnych testów ELISA lub BIAcore, w których wiązanie przeciwciała blokującego krzyżowo z ludzką IL- 17A i/lub ludzką IL-17F zapobiega wiązaniu przeciwciała według niniejszego wynalazku lub na odwrót. [007] W jednej postaci dostarcza się przeciwciało neutralizujące, które wiąże się z ludzką IL-17A i ludzką IL-17F, które krzyżowo blokuje wiązanie przeciwciała, którego łańcuch ciężki zawiera sekwencję gh9 (SEQ ID NO: 9) i którego łańcuch lekki zawiera sekwencję gl7 (SEQ ID NO: 7) z ludzką IL-17A i z ludzką IL-17F. W jednej postaci przeciwciała blokujące krzyżowo hamują wiązanie przeciwciała zawierającego sekwencję łańcucha ciężkiego gh9 (SEQ ID NO: 9) i sekwencję łańcucha lekkiego gl7 (SEQ ID NO: 7) z IL- 17A o ponad 80%, korzystnie ponad 8%, korzystniej o ponad 90%, jeszcze korzystniej o ponad 9% i z IL-17F o ponad 80%, korzystnie o ponad 8%, korzystniej o ponad 90%, jeszcze korzystniej o ponad 9%. [008] W jednej postaci dostarcza się przeciwciało neutralizujące, które wiąże się z ludzką IL-17A i ludzką IL-17F, które krzyżowo blokuje wiązanie przeciwciała, którego łańcuch ciężki zawiera sekwencję gh9 (SEQ ID NO: 9) i którego łańcuch lekki zawiera sekwencję gl7 (SEQ ID NO: 7) z ludzką IL-17A i z ludzką IL-17F, i z ludzkim heterodimerem IL- 17A/F. W jednej postaci przeciwciała blokujące krzyżowo hamują wiązanie przeciwciała zawierającego sekwencję łańcucha ciężkiego gh9 (SEQ ID NO: 9) i sekwencję łańcucha lekkiego gl7 (SEQ ID NO: 7) z IL-17A o ponad 80%, korzystnie ponad 8%, korzystniej o ponad 90%, jeszcze korzystniej o ponad 9% i z IL-17F o ponad 80%, korzystnie o ponad 8%, korzystniej o ponad 90%, jeszcze korzystniej o ponad 9%, i z ludzkim heterodimerem IL-17A/F z IL-17F o ponad 80%, korzystnie o ponad 8%, korzystniej o ponad 90%, jeszcze korzystniej o ponad 9%.

10 [009] W jednej postaci dostarcza się przeciwciało neutralizujące, które wiąże się z ludzką IL-17A i ludzką IL-17F, które krzyżowo blokuje wiązanie przeciwciała, którego łańcuch ciężki zawiera sekwencję gh9 (SEQ ID NO: 9) i którego łańcuch lekki zawiera sekwencję gl7 (SEQ ID NO: 7) z ludzką IL-17A lub z ludzką IL-17F, lub z ludzkim heterodimerem IL-17A/F. W jednej postaci przeciwciała blokujące krzyżowo hamują wiązanie przeciwciała zawierającego sekwencję łańcucha ciężkiego gh9 (SEQ ID NO: 9) i sekwencję łańcucha lekkiego gl7 (SEQ ID NO: 7) z IL-17A lub z IL-17F, lub z IL-17A/F o ponad 80%, korzystnie ponad 8%, korzystniej o ponad 90%, jeszcze korzystniej o ponad 9%. [0060] Alternatywnie lub dodatkowo, przeciwciała neutralizujące mogą być krzyżowo blokowane przed wiązaniem z ludzką IL-17A i ludzką IL-17F przez przeciwciało zawierające sekwencję łańcucha ciężkiego gh9 (SEQ ID NO: 9) i sekwencję łańcucha lekkiego gl7 (SEQ ID NO: 7). Dostarcza się także zatem cząsteczkę neutralizującego przeciwciała, która wiąże się z ludzką IL-17A i ludzką IL-17F, która jest blokowana krzyżowo przed wiązaniem z ludzką IL-17A i ludzką IL-17F przez przeciwciało zawierające sekwencję łańcucha ciężkiego gh9 (SEQ ID NO: 9) i sekwencję łańcucha lekkiego gl7 (SEQ ID NO: 7). W jednej postaci przeciwciała neutralizujące są hamowane przed wiązaniem z ludzką IL-17A i ludzką IL-17F przez przeciwciało zawierające sekwencję łańcucha ciężkiego gh9 (SEQ ID NO: 9) i sekwencję łańcucha lekkiego gl7 (SEQ ID NO: 7) o ponad 80%, korzystnie o ponad 8%, korzystniej o ponad 90%, jeszcze korzystniej o ponad 9%. [0061] W innej postaci dostarcza się cząsteczkę neutralizującego przeciwciała, która wiąże się z ludzką IL-17A i ludzką IL-17F, która jest krzyżowo blokowana przed wiązaniem się z ludzką IL-17A i z ludzką IL-17F i z ludzkim heterodimerem IL-17A/F przez przeciwciało zawierające sekwencję łańcucha ciężkiego gh9 (SEQ ID NO: 9) i sekwencję łańcucha lekkiego gl7 (SEQ ID NO: 7). W jednej postaci przeciwciała neutralizujące są hamowane przed wiązaniem z ludzką IL-17A i z ludzką IL-17F, i z ludzkim heterodimerem IL-17A/F przez przeciwciało zawierające sekwencję łańcucha ciężkiego gh9 (SEQ ID NO: 9) i sekwencję łańcucha lekkiego gl7 (SEQ ID NO: 7) o ponad 80%, korzystnie o ponad 8%, korzystniej o ponad 90%, jeszcze korzystniej o ponad 9%. [0062] Dostarcza się zatem także cząsteczkę neutralizującego przeciwciała, która wiąże się z ludzką IL-17A i z ludzką IL-17F, która jest krzyżowo blokowana przed wiązaniem z ludzką IL-17A lub z ludzką IL-17F, lub z ludzkim heterodimerem IL-17A/F przez przeciwciało zawierające sekwencję łańcucha ciężkiego gh9 (SEQ ID NO: 9) i sekwencję łańcucha lekkiego gl7 (SEQ ID NO: 7). W jednej postaci przeciwciała neutralizujące są hamowane przed wiązaniem z ludzką IL-17A lub z ludzką IL-17F, lub z ludzkim IL-17A/F przez przeciwciało zawierające sekwencję łańcucha ciężkiego gh9 (SEQ ID NO: 9) i sekwencję łańcucha lekkiego gl7 (SEQ ID NO: 7) o ponad 80%, korzystnie o ponad 8%, korzystniej o ponad 90%, jeszcze korzystniej o ponad 9%. [0063] Cząsteczka przeciwciała według któregokolwiek aspektu niniejszego wynalazku korzystnie wykazuje duże powinowactwo wiązania się, korzystnie nanomolowe, jeszcze korzystniej pikomolowe. Będzie zrozumiałe, że powinowactwo wiązania przeciwciała według niniejszego wynalazku do ludzkiej IL-17A może być inne niż powinowactwo wiązania tego samego przeciwciała do ludzkiej IL-17F i/lub heterodimeru IL-17A/F. W jednym przykładzie, cząsteczka przeciwciała według niniejszego wynalazku wykazuje powinowactwo do IL-17A, które jest większe niż jego powinowactwo do IL-17F. W jednym przykładzie, cząsteczka przeciwciała według niniejszego wynalazku wykazuje powinowactwo do IL-17A, które jest co najmniej -krotnie większe niż jego powinowactwo wiązania do IL- 17F. W jednym przykładzie, cząsteczka przeciwciała według niniejszego wynalazku wykazuje powinowactwo do IL-17A, które jest co najmniej 0-krotnie większe niż jego powinowactwo wiązania do IL-17F. W jednym przykładzie, cząsteczka przeciwciała według niniejszego wynalazku wykazuje powinowactwo do IL-17A, które jest co najmniej 0- krotnie większe niż jego powinowactwo wiązania do IL-17F. W jednym przykładzie, cząsteczka przeciwciała według niniejszego wynalazku wykazuje powinowactwo do IL-17F,

11 które jest większe niż jego powinowactwo do IL-17A. W jednym przykładzie, cząsteczka przeciwciała według niniejszego wynalazku wykazuje powinowactwo do IL-17A, które jest takie samo jak jego powinowactwo do IL-17F. W jednym przykładzie, cząsteczka przeciwciała według niniejszego wynalazku wykazuje pikomolowe powinowactwo do IL- 17A i nanomolowe powinowactwo do IL-17F. W jednym przykładzie, cząsteczka przeciwciała według niniejszego wynalazku wykazuje nanomolowe powinowactwo do IL-17F i pikomolowe powinowactwo do IL-17A. W jednym przykładzie, cząsteczka przeciwciała według niniejszego wynalazku wykazuje powinowactwo nanomolowe zarówno do IL- 17A, jak i IL-17F. W jednym przykładzie, cząsteczka przeciwciała według niniejszego wynalazku wykazuje pikomolowe powinowactwo zarówno do IL-17A, jak i IL-17F. [0064] Korzystnie, cząsteczka przeciwciała według niniejszego wynalazku wykazuje powinowactwo wiązania do IL-17A, lepsze niż pm. W jednej postaci przeciwciało według niniejszego wynalazku wykazuje powinowactwo do IL-17A równe 16 pm. [006] Korzystnie, cząsteczka przeciwciała według niniejszego wynalazku wykazuje powinowactwo wiązania do IL-17F, lepsze niż 2 nm. W jednej postaci przeciwciało według niniejszego wynalazku wykazuje powinowactwo do IL-17F równe 1,7 nm. [0066] Korzystnie, cząsteczka przeciwciała według niniejszego wynalazku wykazuje powinowactwo wiązania do heterodimeru IL-17A/F, lepsze niż nm. W jednej postaci, cząsteczka przeciwciała według niniejszego wynalazku wykazuje powinowactwo wiązania do heterodimeru IL-17A/F lepsze niż 00 pm. W jednej postaci, cząsteczka przeciwciała według niniejszego wynalazku wykazuje powinowactwo wiązania do heterodimeru IL- 17A/F lepsze niż pm. W jednej postaci, cząsteczka przeciwciała według niniejszego wynalazku wykazuje powinowactwo wiązania do heterodimeru IL-17A/F równe 116 pm. [0067] W jednej postaci, cząsteczka przeciwciała według niniejszego wynalazku wykazuje powinowactwo wiązania do IL-17F małpy cynomolgus lepsze niż 2 nm. W jednej postaci cząsteczka przeciwciała według niniejszego wynalazku wykazuje powinowactwo wiązania do IL-17F małpy cynomolgus równe 1,03 nm. [0068] Będzie zrozumiałe, że powinowactwo przeciwciał dostarczonych przez niniejszy wynalazek można zmienić z użyciem dowolnego odpowiedniego sposobu znanego w dziedzinie. Niniejszy wynalazek dotyczy zatem również wariantów cząsteczek przeciwciał według niniejszego wynalazku, które mają ulepszone powinowactwo do IL-17A i/lub IL- 17F. Takie warianty można otrzymać w wielu protokołach dojrzewania powinowactwa, w tym mutacji CDR (Yang i in., J. Mol. Biol., 24, , 199), tasowania łańcuchów (Marks i in., Bio/Technology,, , 1992), użycia szczepów mutatorowych E. coli (Low i in., J. Mol. Biol.,, , 1996), tasowania DNA (Patten i in., Curr. Opin. Biotechnol., 8, , 1997), prezentacji fagowej (Thompson i in., J. Mol. Biol., 26, 77-88, 1996) i metody sexual PCR (Crameri i in., Nature, 391, , 1998). Vaughan i in. (powyżej) omawiają te metody dojrzewania powinowactwa. [0069] W jednej postaci cząsteczki przeciwciał według niniejszego wynalazku neutralizują aktywność IL-17A i IL-17F, na przykład w testach in vitro opisanych w Przykładach. W jednej postaci, niniejszy wynalazek dostarcza przeciwciało neutralizujące, wykazuje specyficzność wobec ludzkiej IL-17A i IL-17F, które jest zdolne do hamowania aktywności 0,8 nm ludzkiej IL-17A o 0% przy stężeniu mniejszym niż nm i aktywności 4,2 nm IL-17F o 0% przy stężeniu mniejszym niż 12 nm, przy czym wspomnianą aktywność hamującą mierzy się na podstawie indukowanego przez IL-17A lub IL-17F uwalniania IL-6 z komórek Hela. W jednej postaci stężenie przeciwciała, które hamuje IL-17A o 0% jest mniejsze niż 3 nm. W jednej postaci stężenie przeciwciała, które hamuje IL-17F o 0% jest mniejsze niż 11 nm. W jednej postaci, ludzka IL-17A i ludzka IL-17F stosowane w teście są rekombinowaną ludzką IL-17A i IL-17F. W jednej postaci neutralizujące przeciwciało jest przeciwciałem humanizowanym lub w pełni ludzkim. [0070] Jeśli jest to pożądane, przeciwciało do stosowania w niniejszym wynalazku może być sprzężone z jedną lub większą liczbą cząsteczki(ek) efektorowej(ych). Będzie zrozu-

12 miałe, że cząsteczka efektorowa może obejmować pojedynczą cząsteczkę efektorową lub dwie lub większą liczbę takich cząsteczek połączonych tak, by tworzyły jedno ugrupowanie, które może być dołączone do przeciwciał według niniejszego wynalazku. Gdy pożądane jest uzyskanie fragmentu przeciwciała połączonego z cząsteczką efektorową, można go przygotować z użyciem standardowych procedur chemicznych lub rekombinacji DNA, w których ten fragment przeciwciała jest łączony bezpośrednio lub przez środek sprzęgający z cząsteczką efektorową. Techniki sprzęgania takich cząsteczek efektorowych z przeciwciałami są dobrze znane w dziedzinie (patrz Hellstrom i in., Controlled Drug Delivery, wyd. 2, Robinson i in., red., 1987, str ; Thorpe i in., 1982, Immunol. Rev., 62:119-8 i Dubowchik i in., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, ). Konkretne procedury chemiczne obejmują, na przykład, te opisane w WO 93/06231, WO 92/2283, WO 89/0019, WO 89/01476 i WO Alternatywnie, gdy cząsteczką efektorową jest białko lub polipeptyd, wiązanie można wytworzyć z użyciem procedur rekombinacji DNA, przykładowo tak jak opisano w WO 86/0133 i EP [0071] Stosowane tu określenie cząsteczka efektorowa obejmuje, na przykład, środki przeciwnowotworowe, leki, toksyny, białka aktywne biologicznie, na przykład enzymy, inne przeciwciała lub fragmenty przeciwciał, syntetyczne lub naturalnie występujące polimery, kwasy nukleinowe i ich fragmenty, na przykład DNA, RNA i ich fragmenty, radionuklidy, w szczególności promieniotwórczy jodek, radioizotopy, chelatowane metale, nanocząstki i grupy reporterowe, takie jak związki fluorescencyjne lub związki, które można wykryć metodą spektroskopii NMR i ESR. [0072] Przykłady cząsteczek efektorowych mogą obejmować cytotoksyny lub środki cytotoksyczne, w tym jakikolwiek czynnik, który jest szkodliwy (np. zabija) dla komórek. Przykłady obejmują kombrestatyny, dolastatyny, epotilony, staurosporynę, majtanzynoidy, spongistatyny, rizoksynę, halichondryny, rorydyny, hemiasterliny, taksol, cytochalazynę B, gramicydynę D, bromek etydyny, emetynę, mitomycynę, etopozyd, tenopozyd, winkrystynę, winblastynę, kolchicynę, doksorubicynę, daunorubicynę, dihydroksyantracynodion, mitoksantron, mitramycynę, aktynomycynę D, 1-dehydrotestosteron, glukokortykoidy, prokainę, tetrakainę, lidokainę, propranolol i puromycynę oraz ich analogi i homologi. [0073] Cząsteczki efektorowe obejmują także, ale nie wyłącznie, antymetabolity (na przykład metotreksat, 6-merkaptopurynę, 6-tioguaninę, cytarabinę, -fluorouracyl, dekarbazynę), środki alkilujące (na przykład mechloretaminę, tioepę, chlorambucyl, melfalan, karmustynę (BSNU) i lomustynę (CCNU), cyklothosfamid, busulfan, dibromomannitol, streptozotocynę, mitomycynę C i cis-dichlorodiaminoplatynę (II) (DDP) cisplatynę), antracykliny (np. daunorubicynę (dawniej daunomycynę) i doksorubicynę), antybiotyki (np. dak- tynomycynę (dawniej aktynomycynę), bleomycynę, mitramycynę, antramycynę (AMC), kalicheamycyny lub duokarmycyny), oraz środki antymitotyczne (np. winkrystynę i winblastynę). [0074] Inne cząsteczki efektorowe mogą obejmować chelatowane radionuklidy, takie jak 111 In i 90 Y, Lu 177, bizmut 213, kaliforn 22, iryd 192 i wolfram 188 /ren 188 ; lub leki, takie jak, ale nie wyłącznie, alkilofosfocholiny, inhibitory topoizomerazy I, taksoidy i suramina. [007] Inne cząsteczki efektorowe obejmują białka, peptydy i enzymy. Enzymy będące przedmiotem zainteresowania obejmują, ale nie wyłącznie, enzymy proteolityczne, hydrolazy, liazy, izomerazy, transferazy. Białka, polipeptydy i peptydy będące przedmiotem zainteresowania obejmują, ale nie wyłącznie immunoglobuliny, toksyny, takie jak abryna, rycyna A, egzotoksyna pseudomonas lub toksyna błonicza, białko, takie jak insulina, czynnik martwicy nowotworu, interferon α, interferon β, czynnik wzrostu nerwów, płytkopochodny czynnik wzrostu lub tkankowy aktywator plazminogenu, środek zakrzepowy lub środek antyangiogenny, na przykład angiostatyna lub endostatyna, albo modyfikator odpowiedzi biologicznej, taki jak limfokina, interleukina-1 (IL-1), interleukina-2 (IL-2), in- terleukina-6 (IL-6), czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF), czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów (G-CSF), czynnik wzro-

13 stu nerwów (NGF) lub inny czynnik wzrostu i immunoglobuliny. [0076] Inne cząsteczki efektorowe mogą obejmować wykrywalne substancje przydatne na przykład w diagnostyce. Przykłady wykrywalnych substancji obejmują różne enzymy, grupy prostetyczne, materiały fluorescencyjne, materiały luminescencyjne, materiały bioluminescencyjne, nuklidy promieniotwórcze, metale emitujące pozytony (do stosowania w pozytonowej tomografii emisyjnej) i niepromieniotwórcze paramagnetyczne jony metali. Patrz ogólnie patent U.S. nr dla jonów metali, które można sprzęgać z przeciwciałami do celów diagnostycznych. Odpowiednie enzymy obejmują peroksydazę chrzanową, fosfatazę alkaliczną, beta-galaktozydazę lub acetylocholinoesterazę; odpowiednie grupy prostetyczne obejmują streptawidynę, awidynę i biotynę; odpowiednie materiały fluorescencyjne obejmują umbeliferon, fluoresceinę, izotiocyjanian fluoresceiny, rodaminę, dichlorotriazynyloaminofluoresceinę, chlorek dansylu i fikoerytrynę; odpowiednie materiały luminescencyjne obejmują luminol; Odpowiednie materiały bioluminescencyjne obejmują lucyferazę, lucyferynę i ekworynę; a odpowiednie nuklidy promieniotwórcze obejmują 12 I, 131 I, 111 In i 99 Tc. [0077] W innym przykładzie cząsteczka efektorowa może zwiększać okres półtrwania przeciwciała in vivo i/lub zmniejszać immunogenność przeciwciała i/lub poprawiać dostarczanie przeciwciała przez barierę nabłonkową do układu immunologicznego. Przykłady odpowiednich cząsteczek efektorowych tego typu obejmują polimery, albuminę, białka wiążące albuminę lub związki wiążące albuminę, takie jak te opisane w WO0/ [0078] Gdy cząsteczka efektorowa jest polimerem może ona, ogólnie, być syntetycznym lub naturalnie występującym polimerem, na przykład ewentualnie podstawionym polimerem polialkilenowym, polialkenylenowym lub polioksyalkilenowym o prostym lub rozgałęzionym łańcuchu lub rozgałęzionym lub nierozgałęzionym polisacharydem, na przykład homo- lub heteropolisacharydem. [0079] Konkretne ewentualne podstawniki, które mogą być obecne we wspomnianych powyżej syntetycznych polimerach obejmują jedną lub większą liczbę grup hydroksylowych, metylowych lub metoksylowych. [0080] Konkretne przykłady syntetycznych polimerów obejmują ewentualnie podstawiony poli(glikol etylenowy), poli(glikol propylenowy), poli(alkohol winylowy) o prostym lub rozgałęzionym łańcuchu lub ich pochodne, zwłaszcza ewentualnie podstawiony poli (glikol etylenowy), taki jak metoksypoli(glikol etylenowy) lub jego pochodne. [0081] Konkretne polimery występujące naturalnie obejmują laktozę, amylozę, dekstran, glikogen lub ich pochodne. [0082] Użyte tu określenie pochodne w zamierzeniu obejmuje reaktywne pochodne, na przykład tiolo-selektywne grupy reaktywne, takie jak maleimidy i tym podobne. Grupa reaktywna może być połączona bezpośrednio lub przez segment łącznikowy z polimerem. Będzie zrozumiałe, że reszta takiej grupy będzie w niektórych przypadkach stanowić część produktu jako grupa łącznikowa pomiędzy fragmentem przeciwciała i polimerem. [0083] Wielkość polimeru może być różna, w zależności od potrzeb, lecz na ogół będzie mieścić się w zakresie średniej masy cząsteczkowej od 00 Da do 0000 Da, korzystnie od 000 do Da, a korzystniej od 000 do Da. Wielkość polimeru może być w szczególności wybrana na podstawie zamierzonego zastosowania produktu, na przykład zdolności do lokalizowania się w pewnych tkankach, takich jak nowotwory, albo przedłużonego czasu półtrwania w krążeniu (w celu przeglądu, patrz Chapman, 02, Advanced Drug Delivery Reviews 4, 31-4). Tak więc, na przykład, gdy produkt z zamierzenia ma opuścić krwiobieg i przenikać do tkanki, na przykład do stosowania w leczeniu nowotworu, korzystne może być użycie polimeru o małej masie cząsteczkowej, na przykład o masie cząsteczkowej około 000 Da. W przypadku zastosowań, w których produkt pozostaje w krwiobiegu, korzystne może być użycie polimeru o wyższej masie cząsteczkowej, na przykład o masie cząsteczkowej w zakresie od 000 Da do Da. [0084] Szczególnie korzystne polimery obejmują polimer polialkilenowy, taki jak po-

14 li(glikol etylenowy) lub, zwłaszcza, metoksypoli(glikol etylenowy) albo jego pochodną, w szczególności o masie cząsteczkowej w zakresie od około 00 Da do około Da. [008] W jednym przykładzie przeciwciała do stosowania w niniejszym wynalazku są przyłączone do ugrupowań poli(glikolu etylenowego) (PEG). W jednym szczególnym przykładzie przeciwciało jest fragmentem przeciwciała i cząsteczki PEG mogą być przyłączone przez jakikolwiek dostępny łańcuch boczny aminokwasu lub końcową grupę funkcyjną aminokwasu znajdującą się w tym fragmencie przeciwciała, na przykład jakąkolwiek wolną grupę aminową, iminową, tiolową, hydroksylową lub karboksylową. Takie aminokwasy mogą występować naturalnie we fragmencie przeciwciała albo mogą być wprowadzone do fragmentu z użyciem metod rekombinacji DNA (patrz na przykład US ; US 66742; WO98/2971). W przykładzie, cząsteczka przeciwciała według niniejszego wynalazku jest zmodyfikowanym fragmentem Fab, przy czym modyfikacja polega na dodaniu do C-końca jego łańcucha ciężkiego jednego lub większej liczby aminokwasów, aby umożliwić przyłączenie cząsteczki efektorowej. Korzystnie, dodatkowe aminokwasy tworzą zmodyfikowany region zawiasowy zawierający jedną lub większą liczbę reszt cysteiny, do których cząsteczka efektorowa może być przyłączona. Wiele miejsc można użyć do przyłączenia dwóch lub większej liczby cząsteczek PEG. [0086] Korzystnie, cząsteczki PEG są kowalencyjnie połączone przez grupę tiolową co najmniej jednej reszty cysteiny, znajdującej się we fragmencie przeciwciała. Każda cząsteczka polimeru przyłączona do zmodyfikowanego fragmentu przeciwciała może być kowalencyjnie połączona z atomem siarki reszty cysteiny, znajdującej się we fragmencie. Wiązanie kowalencyjne będzie na ogół wiązaniem dwusiarczkowym, lub w szczególności wiązaniem siarka-węgiel. Gdy grupa tiolowa jest używana jako punkt przyłączenia odpowiednio aktywowanych cząsteczek efektorowych, można użyć na przykład pochodne tioloselektywne, takie jak maleimidy i pochodne cysteiny. Aktywowany polimer można stosować jako materiał wyjściowy do wytwarzania fragmentów przeciwciał zmodyfikowanych polimerem, jak opisano powyżej. Aktywowany polimer może być dowolnym polimerem zawierającym tiolową grupę reaktywną, taką jak kwas α-halokarboksylowy lub ester, na przykład jodoacetamid, imid, na przykład maleimid, sulfon winylu lub disiarczek. Tego rodzaju materiały wyjściowe można otrzymać ze źródeł handlowych (na przykład z Nektar, dawniej Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, USA) albo można je wytworzyć z dostępnych w handlu materiałów wyjściowych z użyciem standardowych procedur chemicznych. Szczególne cząsteczki PEG obejmują K metoksy-peg-aminę (możliwą do uzyskania z Nektar, dawniej Shearwater; Rapp Polymere; i SunBio) i M-PEG-SPA (możliwą do uzyskania z Nektar, dawniej Shearwater). [0087] W jednej postaci, przeciwciało jest zmodyfikowanym fragmentem Fab, który jest PEGylowany, to znaczy ma przyłączony do niego kowalencyjnie PEG (poli(glikol etylenowy)), na przykład zgodnie ze sposobem ujawnionym w EP [patrz też Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications, 1992, J. Milton Harris (red.), Plenum Press, New York, Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications, 1997, J. Milton Harris i S. Zalipsky (red.), American Chemical Society, Washington DC i Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences, 1998, M. Aslam i A. Dent, Grove Publishers, New York; Chapman, A. 02, Advanced Drug Delivery Reviews 02, 4:31-4]. ]. W jednym przykładzie, PEG jest przyłączony do cysteiny w regionie zawiasowym. W jednym przykładzie, fragment Fab zmodyfikowany PEG ma grupę maleimidową kowalencyjnie połączoną z jedną grupą tiolową w zmodyfikowanym regionie zawiasowym. Reszta lizyny może być kowalencyjnie połączona z grupą maleimidową, a do każdej z grup aminowych reszty lizyny może być przyłączony metoksypoli(glikol etylenowy) o masie cząsteczkowej wynoszącej około 000 Da. Całkowita masa cząsteczkowa PEG przyłączonego do fragmentu Fab może zatem wynosić około Da. [0088] W jednej postaci, niniejszy wynalazek dostarcza cząsteczkę przeciwciała neutrali-

15 zującego o specyficzności względem ludzkiej IL-17A i ludzkiej IL-17F, która jest zmodyfikowanym fragmentem Fab, mającym łańcuch ciężki o sekwencji podanej w SEQ ID NO: 9 i łańcuch lekki o sekwencji podanej w SEQ ID NO: 7 i mający na C-końcu swojego łańcucha ciężkiego zmodyfikowany region zawiasowy zawierający co najmniej jedną resztę cysteiny, do której przyłączona jest cząsteczka efektorowa. Korzystnie cząsteczką efektorową jest PEG, który jest przyłączony z użyciem sposobów opisanych w (WO98/2971 i WO ), w których grupa lizylo-maleimidowa jest przyłączona do reszty cysteiny na C-końcu łańcucha ciężkiego, a każda grupa aminowa reszty lizylowej jest kowalencyjnie związana z resztą metoksypoli(glikolu etylenowego), o masie cząsteczkowej około 000 Da. Całkowita masa cząsteczkowa PEG przyłączonego do przeciwciała wynosi zatem około Da. [0089] W innym przykładzie cząsteczki efektorowe mogą być przyłączone do fragmentów przeciwciał z użyciem sposobów opisanych w międzynarodowych zgłoszeniach patentowych WO0/003169, WO0/ i WO0/ [0090] Niniejszy wynalazek dostarcza także izolowaną sekwencję DNA kodującą ciężki i lekki łańcuch cząsteczki przeciwciał według niniejszego wynalazku. Sekwencja DNA według niniejszego wynalazku może obejmować syntetyczne DNA, na przykład wytworzone drogą obróbki chemicznej, cdna, genomowe DNA lub dowolną ich kombinację. [0091] Sekwencje DNA, które kodują cząsteczkę przeciwciała według niniejszego wynalazku można otrzymać sposobami dobrze znanymi specjalistom w tej dziedzinie. Na przykład, sekwencje DNA kodujące część lub całość ciężkich i lekkich łańcuchów przeciwciał mogą być syntetyzowane, w razie potrzeby, z określonych sekwencji DNA, albo na podstawie odpowiadających sekwencji aminokwasowych. [0092] DNA kodujący akceptorowe sekwencje zrębowe jest szeroko dostępny dla specjalistów w dziedzinie i można go łatwo syntetyzować na podstawie znanych sekwencji aminokwasowych. [0093] Do wytwarzania sekwencji DNA kodujących cząsteczkę przeciwciała według niniejszego wynalazku można użyć standardowe techniki biologii molekularnej. Pożądane sekwencje DNA można syntetyzować w całości lub w części z użyciem technik syntezy oligonukleotydów. Gdy jest to odpowiednie, można użyć techniki ukierunkowanej mutagenezy i łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR). [0094] Przykłady odpowiednich sekwencji są dostarczone w SEQ ID NO:8; SEQ ID NO:; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 17 i SEQ ID NO: 18. Nukleotydy 1-7 w SEQ ID NO 18 i 1-60 w SEQ ID NO 14 kodują sekwencję peptydu sygnałowego z mysiego przeciwciała B72.3 (Whittle i in., 1987, Protein Eng. 1(6) ), która jest odcinana z wytworzeniem cząsteczki neutralizującego przeciwciała według niniejszego wynalazku. [009] Niniejszy wynalazek dotyczy również wektora do klonowania lub ekspresji zawierającego jedną lub większą liczbę sekwencji DNA według niniejszego wynalazku. Zgodnie z tym, dostarcza się wektor do klonowania lub ekspresji zawierający jedną lub większą liczbę sekwencji DNA kodujących przeciwciało według niniejszego wynalazku. Korzystnie, wektor do klonowania lub ekspresji zawiera dwie sekwencje DNA kodujące odpowiednio łańcuch lekki i łańcuch ciężki cząsteczki przeciwciała według niniejszego wynalazku. Korzystnie, wektor według niniejszego wynalazku zawiera sekwencje podane w SEQ ID NO: 14 i SEQ ID NO: 18. Nukleotydy 1-7 w SEQ ID NO 18 i 1-60 w SEQ ID NO 14 kodują sekwencję peptydu sygnałowego z mysiego przeciwciała B72.3 (odpowiednio reszty 1-19 w SEQ ID NO: 16 i 1- w SEQ ID NO: 12), która jest najkorzystniej odcinana, z wytworzeniem cząsteczki neutralizującego przeciwciała według niniejszego wynalazku. [0096] Ogólne sposoby, którymi można konstruować wektory, sposoby transfekcji i sposoby hodowli są dobrze znane specjalistom w dziedzinie. W tym zakresie należy odnieść się do Current Protocols in Molecular Biology, 1999, F. M. Ausubel (red.), Wiley Inter-

16 science, New York i Maniatis Manual wydany przez Cold Spring Harbor Publishing. [0097] Dostarczono również komórkę gospodarza zawierającą jeden lub większą liczbę wektorów do klonowania lub ekspresji, zawierających jedną lub większą liczbę sekwencji DNA kodujących przeciwciało według niniejszego wynalazku. Do ekspresji sekwencji DNA kodujących cząsteczkę przeciwciała według niniejszego wynalazku można użyć każdy odpowiedni układ komórka gospodarza/wektor. Można stosować bakteryjne, na przykład E. coli i inne układy mikrobiologiczne lub można też stosować eukariotyczne, na przykład ssacze, układy ekspresyjne komórek gospodarza. Odpowiednie ssacze komórki gospodarze obejmują komórki CHO, szpiczaka lub hybrydoma. [0098] Niniejszy wynalazek dostarcza również sposób wytwarzania cząsteczki przeciwciała według niniejszego wynalazku, obejmujący hodowanie komórki gospodarza zawierającej wektor według niniejszego wynalazku w warunkach odpowiednich do prowadzenia ekspresji białka z DNA kodującego cząsteczkę przeciwciała według niniejszego wynalazku i wydzielenie tej cząsteczki przeciwciała. [0099] Cząsteczka przeciwciała może zawierać tylko polipeptyd łańcucha ciężkiego lub lekkiego, w którym to przypadku należy zastosować jedynie sekwencję kodującą polipeptyd łańcucha ciężkiego lub lekkiego do transfekcji komórek gospodarzy. Do wytwarzania produktów zawierających zarówno łańcuchy ciężkie, jak i lekkie, linia komórkowa może być transfekowana dwoma wektorami, pierwszym wektorem kodującym polipeptyd łańcucha lekkiego i drugim wektorem kodującym polipeptyd łańcucha ciężkiego. Alternatywnie, można użyć pojedynczy wektor, który to wektor zawiera sekwencje kodujące polipeptydy łańcucha lekkiego i łańcucha ciężkiego. [00] Ponieważ przeciwciała według niniejszego wynalazku są użyteczne w leczeniu i/lub profilaktyce stanów patologicznych, niniejszy wynalazek dostarcza także kompozycję farmaceutyczną lub diagnostyczną, zawierającą cząsteczkę przeciwciała według niniejszego wynalazku w połączeniu z jedną lub większą liczbą farmaceutycznie dopuszczalnej zaróbki, rozcieńczalnika lub nośnika. Zgodnie z tym, dostarcza się zastosowanie przeciwciała według niniejszego wynalazku do wytwarzania leku. Kompozycja będzie zwykle dostarczana jako część sterylnej kompozycji farmaceutycznej, która zazwyczaj będzie zawierać farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Kompozycja farmaceutyczna według niniejszego wynalazku może zawierać dodatkowo farmaceutycznie dopuszczalny środek wspomagający. [01] Niniejszy wynalazek dostarcza także sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej lub diagnostycznej obejmujący dodawanie i mieszanie cząsteczki przeciwciała według niniejszego wynalazku razem z jedną lub większą liczbą farmaceutycznie dopuszczalnej zaróbki, rozcieńczalnika lub nośnika. [02] Cząsteczka przeciwciała może być jedynym aktywnym składnikiem w kompozycji farmaceutycznej lub diagnostycznej, lub mogą jej towarzyszyć inne składniki aktywne, w tym składniki w postaci innych przeciwciał, na przykład przeciwciała anty-tnf, anty-il-1 β, anty-komórka T, anty-ifny lub anty-lps i składniki niebędące przeciwciałami, takie jak ksantyny. [03] Kompozycje farmaceutyczne korzystnie zawierają terapeutycznie skuteczną ilość przeciwciała według wynalazku. Użyte tu określenie terapeutycznie skuteczna ilość odnosi się do ilości środka terapeutycznego potrzebnej do leczenia, łagodzenia lub profilaktyki docelowej choroby lub stanu, albo do wywołania wykrywalnego efektu terapeutycznego lub profilaktycznego. Dla jakiegokolwiek przeciwciała, terapeutycznie skuteczną ilość można oszacować wstępnie w testach na hodowlach komórkowych lub w modelach zwierzęcych, zazwyczaj u gryzoni, królików, psów, świń lub naczelnych. Model zwierzęcy można też użyć do określenia właściwego zakresu stężeń i drogi podawania. Takie informacje można następnie użyć do określenia użytecznych dawek i dróg podawania u ludzi. [04] Dokładna terapeutycznie skuteczna ilość dla osobnika będącego człowiekiem będzie zależeć od nasilenia stanu chorobowego, ogólnego stanu zdrowia pacjenta, wieku,

17 masy ciała i płci pacjenta, diety, czasu i częstotliwości podawania, kombinacji leków, czułości reakcji i tolerancji/odpowiedzi na terapię. Tę ilość można ustalić w rutynowych doświadczeniach i w ramach oceny klinicysty. Ogólnie, terapeutycznie skuteczna ilość będzie wynosić od 0,01 mg/kg do 0 mg/kg, korzystnie od 0,1 mg/kg do mg/kg. Kompozycje farmaceutyczne mogą być dogodnie obecne w postaci dawek jednostkowych zawierających wstępnie ustaloną ilość środka aktywnego według wynalazku na dawkę. [0] Kompozycje można podawać pojedynczo pacjentowi lub można podawać w połączeniu (na przykład jednocześnie, kolejno lub oddzielnie) z innymi środkami, lekami lub hormonami. [06] Dawka, w której podaje się cząsteczki przeciwciała według niniejszego wynalazku zależy od charakteru leczonego stanu, stopnia obecnego zapalenia i od tego, czy cząsteczki przeciwciała stosuje się profilaktycznie czy do leczenia istniejącego stanu. [07] Częstość dawek będzie zależeć od okresu półtrwania cząsteczki przeciwciała oraz czasu trwania jej efektu. Jeżeli cząsteczka przeciwciała ma krótki okres półtrwania (na przykład od 2 do godzin), konieczne może być podawanie jednej lub większej liczby dawek dziennie. Alternatywnie, jeśli cząsteczka przeciwciała ma długi okres półtrwania (na przykład od 2 do 1 dni), wymagane może być podawanie dawki jedynie raz dziennie, raz na tydzień lub nawet raz na 1 lub 2 miesiące. [08] Farmaceutycznie dopuszczalny nośnik nie powinien sam wywoływać wytwarzania przeciwciał szkodliwych dla osobnika otrzymującego kompozycję i nie powinien być toksyczny. Odpowiednimi nośnikami mogą być duże, powoli metabolizowane makrocząsteczki, takie jak białka, polipeptydy, liposomy, polisacharydy, poli(kwasy mlekowe), poli(kwasy glikolowe), polimeryczne aminokwasy, kopolimery aminokwasów i nieaktywne cząstki wirusów. [09] Stosowane mogą być farmaceutycznie dopuszczalne sole, na przykład sole kwasów nieorganicznych, takie jak chlorowodorki, bromowodorki, fosforany i siarczany i sole kwasów organicznych, takie jak octany, propioniany, maloniany i benzoesany. [01] Farmaceutycznie dopuszczalne nośniki w kompozycjach terapeutycznych mogą dodatkowo zawierać ciecze, takie jak woda, sól fizjologiczna, glicerol i etanol. Dodatkowo, w takich kompozycjach mogą być obecne substancje pomocnicze, takie jak środki zwilżające lub emulgujące lub substancje buforujące ph. Takie nośniki umożliwiają skomponowanie kompozycji farmaceutycznych w postaci tabletek, pigułek, drażetek, kapsułek, cieczy, żeli, syropów, papek i zawiesin, do spożycia przez pacjenta. [0111] Korzystne postacie do podawania obejmują postacie odpowiednie do podawania pozajelitowego, na przykład przez wstrzyknięcie lub wlew, na przykład przez wstrzyknięcie dużej dawki lub ciągły wlew. W przypadku, gdy produkt jest przeznaczony do wstrzykiwania lub wlewu, może on mieć postać zawiesiny, roztworu lub emulsji w nośniku olejowym lub wodnym i może zawierać środki formułujące, takie jak środki zawieszające, konserwujące, stabilizujące i/lub dyspergujące. Alternatywnie, cząsteczka przeciwciała może być w postaci suchej, do roztwarzania przed użyciem w odpowiedniej sterylnej cieczy. [0112] Po sformułowaniu, kompozycje według wynalazku można podawać bezpośrednio osobnikowi. Osobnikami leczonymi mogą być zwierzęta. Jednakże, korzystne jest, aby kompozycje były przystosowane do podawania osobnikom będącym ludźmi. [0113] Kompozycje farmaceutyczne według tego wynalazku mogą być podawane dowolną liczbą dróg, obejmujących, ale nie wyłącznie, drogę doustną, dożylną, domięśniową, dotętniczą, doszpikową, dooponową, dokomorową, transdermalną, przezskórną (patrz na przykład WO 98/734), podskórną, dootrzewnową, donosową, dojelitową, miejscową, podjęzykową, dopochwową lub doodbytniczą. Do podawania kompozycji farmaceutycznych według wynalazku mogą również służyć strzykawki bezigłowe. Zazwyczaj kompozycje terapeutyczne można przygotować w postaci do wstrzykiwania, jako ciekłe roztwory lub zawiesiny. Przygotowane mogą być również postacie stałe odpowiednie do rozpusz-

18 czania lub przeprowadzania w zawiesinę w ciekłych nośnikach przed wstrzyknięciem. [0114] Dostarczanie bezpośrednie kompozycji będzie zazwyczaj realizowane przez wstrzyknięcie podskórne, dootrzewnowe, dożylne lub domięśniowe lub też dostarczanie do śródmiąższowej przestrzeni w tkance. Kompozycje można również podawać do zmiany chorobowej. Dawkowanie może być w schemacie pojedynczej dawki lub w schemacie dawek wielokrotnych. [011] Będzie zrozumiałe, że składnikiem aktywnym w kompozycji będzie cząsteczka przeciwciała. Jako taka, będzie ona podatna na rozkład w przewodzie pokarmowym. Zatem, jeśli kompozycja ma być podawana z wykorzystaniem przewodu pokarmowego, kompozycja będzie musiała zawierać środki, które chronią przeciwciało przed rozkładem, ale które uwalniają przeciwciało po wchłonięciu z przewodu pokarmowego. [0116] Dokładne omówienie farmaceutycznie dopuszczalnych nośników dostępne jest w Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991). [0117] Przewiduje się także, że przeciwciało według niniejszego wynalazku będzie podawane drogą terapii genowej. Aby to osiągnąć, sekwencje DNA kodujące ciężkie i lekkie i łańcuchy cząsteczki przeciwciała pod kontrolą odpowiednich elementów DNA wprowadza się do pacjenta, tak że łańcuchy przeciwciała ulegają ekspresji z sekwencji DNA i są składane in situ. [0118] Niniejszy wynalazek dostarcza także cząsteczkę przeciwciała do stosowania w kontroli chorób zapalnych. Korzystnie, cząsteczka przeciwciała może być stosowana do zmniejszenia procesu zapalnego lub do zapobiegania procesowi zapalnemu. [0119] Niniejszy wynalazek dostarcza również cząsteczkę przeciwciała według niniejszego wynalazku do stosowania w leczeniu lub profilaktyce patologicznego zaburzenia, w którym pośredniczy IL-17A i/lub IL-17F lub które jest związane ze zwiększonym poziomem IL-17A i/lub IL-17F. Korzystnie, stan patologiczny jest wybrany z grupy składającej się z zakażeń (wirusowych, bakteryjnych, grzybiczych i pasożytniczych), wstrząsu endotoksycznego związanego z zakażeniem, zapalenia stawów, reumatoidalnego zapalenia stawów, astmy, choroby zapalnej miednicy, choroby Alzheimera, choroby Crohna, choroby zapalnej jelita, wrzodziejącego zapalenia jelita grubego, choroby Peyroniego, choroby trzewnej, choroby pęcherzyka żółciowego, choroby związanej z powstawaniem torbieli włosowych, zapalenia otrzewnej, łuszczycy, zapalenia naczyń, zrostów chirurgicznych, udaru, cukrzycy typu I, zapalenia stawów z Lyme, zapalenia opon i mózgu, zaburzeń zapalnych ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego, w których pośredniczy układ odpornościowy, takich jak stwardnienie rozsiane i zespół Guillaina-Barrego, innych zaburzeń autoimmunologicznych, zapalenia trzustki, urazu (operacji), choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi, odrzucenia przeszczepu, raka (zarówno guzów litych, takich jak czerniaki, wątrobiaki zarodkowe, mięsaki, raki płaskonabłonkowe, raki komórek przejściowych, raki jajnika, jak i hematologicznych nowotworów złośliwych, w szczególności ostrej białaczki szpikowej, przewlekłej białaczki szpikowej, raka żołądka i raka okrężnicy), choroby serca, w tym chorób niedokrwiennych takich jak zawał mięśnia sercowego, a także miażdżyca tętnic, krzepnięcia wewnątrznaczyniowego, resorpcji kości, osteoporozy, zapalenia ozębnej i niedoboru kwasu solnego w soku żołądkowym. [01] Niniejszy wynalazek dostarcza również cząsteczkę przeciwciała według niniejszego wynalazku do stosowania w leczeniu lub profilaktyce bólu. [0121] Niniejszy wynalazek dotyczy ponadto zastosowania cząsteczki przeciwciała według niniejszego wynalazku do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki zaburzenia patologicznego, w którym pośredniczy IL-17A i/lub IL-17F lub związanego ze zwiększonym poziomem IL-17A i/lub IL-17F. Korzystnie, zaburzeniem patologicznym jest reumatoidalne zapalenie stawów lub stwardnienie rozsiane. [0122] Niniejszy wynalazek dostarcza ponadto zastosowanie cząsteczki przeciwciała według niniejszego wynalazku do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki bólu. [0123] Cząsteczka przeciwciała według niniejszego wynalazku może być stosowana w

19 jakiejkolwiek terapii, w której pożądane jest obniżenie wpływu IL-17A i/lub IL-17F w organizmie człowieka lub zwierzęcia. IL-17A i/lub IL-17F może krążyć w organizmie lub może być obecna na niepożądanie wysokim poziomie zlokalizowana w określonym miejscu w organizmie, na przykład w miejscu zapalenia. [0124] Cząsteczkę przeciwciała według niniejszego wynalazku korzystnie stosuje się do kontrolowania choroby zapalnej, choroby autoimmunologicznej lub raka. [012] Niniejszy wynalazek dostarcza również sposób leczenia osobników będącymi ludźmi lub zwierzętami cierpiących na lub wykazujących ryzyko wystąpienia zaburzenia, w którym pośredniczy IL-17A i/lub IL-17F, który to sposób obejmuje podawanie temu osobnikowi skutecznej ilości cząsteczki przeciwciała według niniejszego wynalazku. [0126] Cząsteczkę przeciwciała według niniejszego wynalazku można również stosować w diagnostyce, na przykład w diagnostyce i obrazowaniu in vivo stanów chorobowych związanych z IL-17A i/lub IL-17F. [0127] Niniejszy wynalazek jest dalej opisany jedynie w charakterze ilustracji w następujących przykładach, które odnoszą się do załączonych Figur, na których: Figura: 1 a) Region V łańcucha lekkiego przeciwciała CA028_0496 (SEQ ID NO:7) b) Region V łańcucha ciężkiego przeciwciała CA028_0496 (SEQ ID NO:9) c) CDRH1 (SEQ ID NO:1), CDRH2 (SEQ ID NO:2), CDRH3 (SEQ ID NO:3), CDRL1 (SEQ ID NO:4), CDRL2 (SEQ ID NO:), CDRL3 (SEQ ID NO:6) przeciwciała CA028_496. d) Lekki łańcuch przeciwciała CA028_496 (SEQ ID NO:11). e) Ciężki łańcuch przeciwciała CA028_496 (SEQ ID NO:1). f) DNA kodujący lekki łańcuch przeciwciała CA028_496 wraz z sekwencją sygnałową (SEQ ID NO:14). g) DNA kodujący ciężki łańcuch przeciwciała CA028_496 wraz z sekwencją sygnałową (SEQ ID NO:18) Figura 2 a) Wpływ przeciwciała CA028_0496 (oznaczonego w legendzie Ab#496) na indukowane przez ludzką IL-17 wytwarzanie IL-6 z komórek Hela. b) Wpływ przeciwciała CA028_0496 (oznaczonego w legendzie) Ab#496 na indukowane przez ludzką IL-17F wytwarzanie IL-6 z komórek Hela. Manipulacje DNA i sposoby ogólne [0128] Szczep E. coli INVαF' (Invitrogen) użyto do transformacji i rutynowego wzrostu hodowli. Enzymy restrykcyjne i modyfikujące DNA uzyskano z Roche Diagnostics Ltd. oraz New England Biolabs. Preparaty plazmidu wytworzono z użyciem zestawów do oczyszczania Maxi Plasmid (QIAGEN, nr katalogowy 1216). Reakcje sekwencjonowania DNA przeprowadzono z użyciem zestawu do sekwencjonowania ABI Prism Big Dye terminator (nr katalogowy 44149) i prowadzono na automatycznym sekwenatorze ABI (Applied Biosystems). Dane analizowano z użyciem programu AutoAssembler (Applied Biosystems). Oligonukleotydy pochodziły z firmy Invitrogen. Stężenie IgG oznaczono z użyciem zestawu ELISA dla IgG. Izoformy IL-17 [0129] Rekombinowane IL-17A i IL-17F zostały nabyte z firmy R&D Systems. [01] Rekombinowany heterodimer IL-17A/F wytworzono przez połączenie IL-17A i IL- 17F z użyciem łącznika GS. Heterodimer miał następującą sekwencję (SEQ ID NO: 19) [0131] MGITIPRNPGCPNSEDKNFPRTVMVNLNIHNRNTNTNPKRSSDYYNRSTSP WNLHRNEDPERYPSVIWEAKCRHLGCINADGNVDYHMNSVPIQQEILVLRREPPH CPNSFRLEKILVSVGCTCVTPIVHHVAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSRKIPKVG HTFFQKPESCPPVPGGSMKLDIGIINENQRVSMSRNIESRSTSPWNYTVTWDPNRY PSEVVQAQCRNLGCINAQGKEDISMNSVPIQQETLVVRRKHQGCSVSFQLEKVLV TVGCTCVTPVIHHVQ Rekombinowana IL-17F małpy cynomolgus (SEQ ID NO:)

20 [0132] MRKIPKVGHTFFQKPESCPPVPEGSMKLDTGIINENQRVSMSRNIESRSTSP WNYTVTWDPNRYPSEVVQAQCKHLGCINAQGKEDISMNSVPIQQETLVLRRKHQ GCSVSFQLEKVLVTVGCTCVTPVIHHVQ [0133] Sekwencja DNA kodująca heterodimer IL-17A/F została chemicznie zsyntetyzowana przez Entelechon GmbH i subklonowana do pet43.1a w miejscach Ndel/Xhol. Sekwencja DNA kodująca L-17F cyno była amplifikowana w reakcji PCR z użyciem starterów, które wprowadzały miejsca restrykcyjne Ndel i Xhol. Produkty PCR ligowano do pcr4blunt-topo, a sekwencję weryfikowano przed trawieniem i ligacją do pet43.1a w miejscach Ndel/Xhol. [0134] DNA pet43.1a kodujące izoformy IL-17 użyto do transfekcji komórek BL21 (DE3) i wybrane klony oporne na karbenicylinę hodowano w temperaturze 37 C przez noc w bulionie 2TY zawierającym 2% glukozy i 0 µg/ml karbenicyliny. Następnie hodowle rozcieńczono i hodowano w tej samej pożywce do OD600 0,-0,7, indukowano z użyciem 1 mm IPTG i hodowano w temperaturze 37 C przez kolejne 4- godzin. [013] Komórki zebrano przez wirowanie i ciała inkluzyjne wypreparowano z komórek. Ciała inkluzyjne rozpuszczono w 0 mm Tris-HCl, M chlorowodorku guanidyny, 0 mm NaCl, 1 mm EDTA, 2 mm zredukowanego glutationu, 0,2 mm utlenionego glutationu, ph 8,. Białko IL-17 ponownie sfałdowano przez wkroplenie rozpuszczonego białka do powyższego buforu bez chlorowodorku guanidyny, przy energicznym mieszaniu. Ostateczną objętość dobrano tak, aby końcowe stężenie białka wynosiło nie więcej niż 0,1 mg/ml. [0136] Roztwór ponownie sfałdowanego białka zatężono, jeśli to konieczne, przed wymianą buforu na mm MES ph 6. Białko następnie naniesiono na kolumnę SP-Sepharose HP, zrównoważoną mm MES, ph 6. Białko wymywano liniowym gradientem 0-00 mm NaCl w MES ph 6 przez objętości kolumny. Dla IL-17F, gradient rozszerzono do 600 mm NaCl. W celu dalszego oczyszczania IL-17, odpowiednie frakcje z kolumny SP HP Sepharose połączono, zatężono i rozcieńczono mm CAPSO (ph ) i naniesiono na kolumnę Mono Q, zrównoważoną mm CAPSO. Białko wymywano liniowym gradientem 0- mm NaCl w mm CAPSO przez objętości kolumny. Frakcje zawierające IL-17 połączono i zobojętniono z użyciem 1 M MES, ph 6. Przykład 1: Wytwarzanie neutralizującego przeciwciała anty-il-17 [0137] Samice szczurów Sprague Dawly immunizowano rekombinowaną ludzką IL-17 (nabytą z R & D Systems). Szczury otrzymały cztery immunizacje po µg IL-17 w 0 µl adiuwantu Freunda. Przeciwciało 22, które wiąże ludzką IL-17 izolowano z użyciem sposobów opisanych w WO04/ Geny dla domeny zmiennej łańcucha ciężkiego (VH) i domeny zmiennej łańcucha lekkiego (VL) przeciwciała 22 wyizolowano i zsekwencjonowano po sklonowaniu metodą PCR z odwrotną transkrypcją. [0138] Zaprojektowano szereg humanizowanych regionów VL i VH z użyciem ludzkich zrębów akceptorowych regionu V i przez zróżnicowanie liczby reszt donorowych w regionach zrębowych. Zaprojektowano osiem przeszczepionych regionów VL (gl1-8) i 9 przeszczepionych regionów VH (gh1-9), i zbudowano ich geny przez składanie oligonukleotydów oraz mutagenezę PCR. [0139] Przeszczepione sekwencje łańcucha lekkiego subklonowano do wektora ekspresyjnego ludzkiego łańcucha lekkiego pkh. 1, który zawiera DNA kodujący ludzki region stały C-Kappa (allotypu KM3). Przeszczepione sekwencje łańcucha ciężkiego subklonowano wektora ekspresyjnego ludzkiego gamma-4 pvhg4p FL, który zawiera DNA kodujący ludzki region stały gamma-4 zawierający mutację stabilizującą region zawiasowy S241P (Angal i in., powyżej). Plazmidy kotransfekowano do komórek CHO i wytwarzane przeciwciała przeszukiwano pod kątem aktywności IL-17 w testach wiązania i neutralizacji. Transfekcje komórek CHO prowadzono stosując procedurę Lipofectamine 00 zgodnie z instrukcjami producenta (Invitrogen, nr katalogowy 11668). [0140] Wybrano najbardziej optymalny przeszczep na podstawie ekspresji, powinowactwa

21 i siły neutralizacji (gl7gh9) i nazwano go CA028_0496. Sekwencje regionu V tego przeciwciała są przedstawione na Figurze 1 (a) i (b) i w SEQ ID NO: 7 i 9, odpowiednio dla łańcucha lekkiego (gl7) i łańcuchów ciężkich (gh9). [0141] Akceptorowym regionem zrębowym łańcucha ciężkiego jest ludzka sekwencja linii zarodkowej VH ze zrębem 4 pochodzącym z tej części ludzkiego regionu JH linii zarodkowej JH4. Akceptorowym zrębem łańcucha lekkiego jest ludzka sekwencja linii zarodkowej VK1 2-1-(1) L4 ze zrębem 4 pochodzącym z tej części ludzkiego regionu JK linii zarodkowej JK1. Przykład 2: Przeciwciało CA neutralizuje IL-17 i IL-17F i heterodimer IL- 17A/F Komórki Hela [0142] Siłę przeciwciała CA028_0496 przeciwko rekombinowanej ludzkiej IL-17 i rekombinowanej ludzkiej IL-17F w komórkach Hela badano i porównywano z przeciwciałem CDP43 (WO06/0409). Komórki Hela uzyskano z banku komórek w ATCC (ATCC CCL-2). Komórki hodowano w pożywce Eagle'a zmodyfikowanej przez Dulbecco (DMEM) z dodatkiem % płodowej surowicy cielęcej, penicyliny, gentamycyny i glutaminy. 1x 4 komórek wysiano na 96-studzienkowych płytkach z płaskim dnem do hodowli tkankowych. Komórki inkubowano przez noc i przemyto raz w buforze testowym. Ludzką IL-17A (2 ng ml -1 ) albo ludzką IL-17F (12 ng ml -1 ) inkubowano w obecności stałego stężenia ludzkiego TNF-α i tę mieszaninę wstępnie inkubowano z przeciwciałem CA028_0496 lub przeciwciałem CDP43. Następnie cytokinę wraz z przeciwciałem dodano do komórek Hela, które inkubowano przez noc. Wytwarzanie IL-6 w supernatancie hodowli komórek było proporcjonalne do ilości IL-17A/IL-17F dodanej do komórek. Poziomy ludzkiej IL-6 mierzono z użyciem ELISA i określono ilościowo przez porównanie ze znanym wzorcem stężeń ludzkiej IL-6. [0143] Dane (Figury 2a i 2b) wskazują, że przeciwciało CA028_0496 silnie neutralizowało ludzką rekombinowaną IL-17A i wykazywało również pewną aktywność przeciwko ludzkiej IL-17F. Dane z tych doświadczeń wskazywały, że przeciwciało CA028_0496 dało IC0 równe 43 ng/ml przeciwko rekombinowanej ludzkiej IL-17 (2 ng ml -1 ) i 1477 ng/ml przeciwko rekombinowanej IL-17F (12 ng ml -1 ). Zgodnie z tym, przeciwciało CA028_0496 dało IC0 równe 0,29 M przeciwko rekombinowanej ludzkiej IL-17 (0,78 nm) i,18 nm przeciwko rekombinowanej ludzkiej IL-17F (4,16 nm) w tym teście (obliczenia w oparciu o IgG przy założeniu masy cząsteczkowej jako średniej dla IgG4 i przy założeniu, że IL-17A i IL-17F są dimerami). Ludzkie komórki mikrogleju [0144] Ludzkie komórki mikrogleju (TCS Cellworks) wysiano na płaskodennej 96- studzienkowej płytce w ilości 000 komórek na studzienkę w całkowitej objętości 0 µl i pozostawiono na 24 godziny w celu przywarcia do plastiku. W tym czasie miareczkowania (, 1, 0,2 i 0,04 µg/ml) rekombinowanej ludzkiej IL-17A, rekombinowanej ludzkiej IL- 17F, rekombinowanej IL-17F małpy cynomolgus i ludzkiego rekombinowanego heterodimeru IL-17A/C w obecności i bez obecności ng/ml rekombinowanego ludzkiego TNFα dodano do studzienek w trzech powtórzeniach. Studzienki kontrolne nie zawierały żadnej stymulacji, zawierały tylko IL-17A (0 ng/ml), tylko TNFα i IL-17A razem z TNFα. Wszystkie cytokiny dodawano w całkowitej objętości 1 µl/studzienkę, co dawało całkowitą objętość studzienki 2 µl. W doświadczeniach prowadzonych z udziałem przeciwciał, komórki wysiewano w ten sam sposób. Po 24 godzinach przeciwciała i cytokiny dodawano w tym samym czasie do określonych końcowych stężeń w końcowej całkowitej objętości 0 µl. [014] Po kolejnych 24 godzinach inkubacji w 37 C supernatanty zebrano i zamrożono w - C aż do analizy. Do analizy supernatanty rozcieńczono 1/ i zmierzono pod kątem IL-6 z użyciem zestawu MSD dla ludzkiej IL-6, zgodnie z instrukcjami producenta. [0146] Stwierdzono, że wszystkie badane izoformy IL-17 były aktywne w tym teście, w

22 szczególności w obecności TNFα. [0147] Siłę przeciwciała CA028_0496 przeciwko rekombinowanej ludzkiej IL-17 i rekombinowanej ludzkiej IL-17F, rekombinowanej IL-17F małpy cynomolgus i ludzkiego rekombinowanego heterodimeru IL-17A/C w ludzkich komórkach mikrogleju zbadano w obecności TNFα oraz porównano z przeciwciałem kontrolnym i przeciwciałem specyficznym wobec IL-17A z użyciem sposobu opisanego powyżej. [0148] Przeciwciało kontrolne nie miało wpływu na aktywność którejkolwiek z badanych cytokin. [0149] Przeciwciało CA028_0496 wykazywało aktywność hamującą wobec wszystkich trzech cytokin IL-17, IL-17F i IL-17A/F, w tym IL-17F małpy cynomolgus, podczas gdy przeciwciało specyficzne wobec IL-17A wykazywało aktywność hamującą tylko w stosunku do IL-17A i heterodimeru IL-17A/F. Przykład 3 Powinowactwo przeciwciała CA (regiony stałe ludzkiej IgG4) do IL-17A i IL-17F [0] Analizę BIA (Biamolecular Interaction Analysis) przeprowadzono z użyciem Biacore 00 (Biacore AB). Wszystkie doświadczenia prowadzono w temperaturze 2 C. Fragment Fc Affinipure koziej anty-ludzkiej IgG, specyficznej dla fragmentu Fc (Jackson ImmunoResearch) unieruchomiono na chipie sensora CM Sensor Chip w reakcji sprzęgania amin do poziomu wychwytywania 6000 jednostek odpowiedzi (RU). Jako bufor roboczy stosowano bufor HBS-EP ( mm HEPES ph 7,4, 0,1 M NaCl, 3 mm EDTA, 0,00% Surfactant P, Biacore AB) z szybkością przepływu µl/min. Dla wychwytywania przez unieruchomioną anty-ludzką IgG-Fc zastosowano wstrzyknięcie µl przeciwciała CA028_0496 (1,81 mg/ml). Ludzkie izoformy IL-17A i IL-17 były miareczkowane nad wychwyconym CA028_0496 w dwukrotnych rozcieńczeniach od 0 nm do sub nm z szybkością przepływu µl/min. Powierzchnię regenerowano przez wstrzyknięcia µl 40 mm HCI, a następnie przez jedno wstrzyknięcie µl mm NaOH. [011] Krzywe wiązania po odjęciu tła były podwójnego odniesienia i były analizowane z użyciem oprogramowania BIAevaluation (wersja 3.2) zgodnie ze standardowymi procedurami. Parametry kinetyczne określono z algorytmu dopasowania. [012] Wartość powinowactwa określona dla wiązania przeciwciała CA028_0496 z IL- 17A wynosiła 16 pm i 170 pm dla IL-17F. Przeciwciało CA028_0496 nie wiązało się z innymi izoformami IL-17 (IL-17 B, C, D i E). Przeciwciało CA028_0496 zatem specyficznie wiąże IL-17A i IL-17F. Przykład 4: Powinowactwo przeciwciała CA (mysie regiony stałe IgG1) do IL-17A, IL-17F małpy cynomolgus i heterodimeru IL-17A/F [013] Analizę BIA (Biamolecular Interaction Analysis) przeprowadzono z użyciem Biacore 00 (Biacore AB). Wszystkie doświadczenia prowadzono w temperaturze 2 C. Fragment F(ab')2 Affinipure koziej anty-mysiej IgG, specyficznej dla fragmentu Fc (Jackson ImmunoResearch) unieruchomiono na chipie sensora CM Sensor Chip w reakcji sprzęgania amin do poziomu wychwytywania 6000 jednostek odpowiedzi (RU). Jako bufor roboczy stosowano bufor HBS-EP ( mm HEPES ph 7,4, 0,1 M NaCl, 3 mm EDTA, 0,00% Surfactant P, Biacore AB) z szybkością przepływu µl/min. Do wychwytywania przez unieruchomioną anty-mysią IgG,Fc użyto wstrzyknięcie µl przeciwciała CA028_0496 w stężeniu 4 µg/mll. Ludzka IL-17A, IL-17 cyno i heterodimer A/F miareczkowano nad wychwyconym CA028_0496 w dwukrotnych rozcieńczeniach od 2 nm do sub nm z szybkością przepływu µl/min. Powierzchnię regenerowano z szybkością przepływu µl/min przez wstrzyknięcie µl 40 mm HCI, a następnie przez wstrzyknięcie µl mm NaOH. [014] Krzywe wiązania podwójnego odniesienia po odjęciu tła analizowano z użyciem oprogramowania BIAevaluation (wersja 3.2) z użyciem standardowych procedur. Parametry kinetyczne określono z algorytmu dopasowania. [01] Przeciwciało CA028_0496 miało powinowactwo równe 21 pm do IL-17A, 116 pm

23 22 1 do heterodimeru IL-17A/F i pm do IL-17F małpy cynomolgus. [016] Należy oczywiście rozumieć, że niniejszy wynalazek został opisany wyłącznie na zasadzie przykładu, w żaden sposób nie ma na celu być ograniczającym, oraz, że modyfikacje szczegółów mogą być dokonywane w obrębie zakresu poniższych zastrzeżeń patentowych. WYKAZ SEKWENCJI [017] <1> UCB PHARMA S.A. Adams, Ralph Popplewell, Andrew Rapecki, Stephen <1> Cząsteczki przeciwciał, które wiążą IL-17A i IL-17F <1> G003-WO01 <160> <170> PatentIn wersja 3.3 <2> 1 <211> <212> PRT <213> Rattus rattus <400> 1 <2> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Sztuczna <2> <223> CDRH2 <400> 2 2 <2> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Sztuczna <2> <223> CDRH3 <400> 3

24 23 <2> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Sztuczna <2> <223> CDRL1 <400> 4 <2> <211> 7 <212> PRT <213> Rattus rattus <400> 1 <2> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Rattus rattus <400> 6 <2> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Sztuczna <2> <223> gl7 <400> 7

25 24 <2> 8 <211> 324 <212> DNA <213> Sztuczna <2> <223> gl7 <400> 8 <2> 9 <211> 12 <212> PRT <213> Sztuczna <2> <223> gh9 <400> 9

26 2 <2> <211> 37 <212> DNA <213> Sztuczna <2> <223> gh9 <400> <2> 11 <211> 214 <212> PRT <213> Sztuczna <2> <223> GL7+domena stała <400> 11

27 26 <2> 12 <211> 234 <212> PRT <213> Sztuczna <2> <223> Sygnałowa+gL7+domena stała

28 27 <2> 13 <211> 64 <212> DNA <213> Sztuczna <2>

29 28 <223> gl7+domena stała <400> 13 <2> 14 <211> 70 <212> DNA <213> Sztuczna <2> <223> sygnałowa+gl7+domena stała <400> 14 <2> 1 <211> 42 <212> PRT

30 29 <213> Sztuczna <2> <223> gh9+domena stała <400> 1

31

32 31 <2> 16 <211> 471 <212> PRT <213> Sztuczna <2> <223> sygnałowa+gh9+domena stała <400> 16

33 32

34 33 <2> 17 <211> 1963 <212> DNA <213> Sztuczna <2> <223> gh9+domena stała <400> 17

35 34 <2> 18 <211> <212> DNA <213> Sztuczna <2> <223> sygnałowa+gh9+domena stała <400> 18

36 3 <2> 19 <211> 286 <212> PRT <213> Sztuczna

37 36 <2> <223> heterodimer IL-17A/F <400> 19

38 37 <2> <211> 134 <212> PRT <213> Sztuczna <2> <223> IL-17F małpy cynomolgus <400>

39 38 Zastrzeżenia patentowe Przeciwciało neutralizujące, które wiąże ludzką IL-17A i ludzką IL-17F, zawierające łańcuch ciężki i łańcuch lekki, przy czym domena zmienna łańcucha ciężkiego zawiera sekwencję podaną w SEQ ID NO:9, a domena zmienna łańcucha lekkiego zawiera sekwencję podaną w SEQ ID NO:7 lub sekwencję co najmniej w 9% identyczną do niej, oraz przy czym to przeciwciało ma powinowactwo do IL-17A lepsze niż pm i powinowactwo do IL-17F lepsze niż 2 nm. 2. Przeciwciało neutralizujące według zastrzeżenia 1, mające łańcuch ciężki zawierający sekwencję podaną w SEQ ID NO: 9 i łańcuch lekki zawierający sekwencję podaną w SEQ ID NO: Przeciwciało neutralizujące według zastrzeżenia 2, które wiąże ludzką IL-17A i ludzką IL-17F, mające łańcuch ciężki zawierający sekwencję podaną w SEQ ID NO: 1 i łańcuch lekki zawierający sekwencję podaną w SEQ ID NO: Przeciwciało neutralizujące według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 3, gdzie to przeciwciało jest całym przeciwciałem lub jego funkcjonalnie aktywnym fragmentem, lub jego pochodną.. Przeciwciało neutralizujące według zastrzeżenia 4, gdzie fragmentem przeciwciała jest Fab, Fab', F(ab')2, ScFv lub ich fragment wiążący epitop. 6. Przeciwciało neutralizujące według zastrzeżenia 4 albo zastrzeżenia, gdzie to przeciwciało lub jego fragment jest przeciwciałem z przeszczepionym CDR. 7. Przeciwciało według któregokolwiek z zastrzeżeń 1-6, gdzie to przeciwciało lub jego fragment, jest sprzężone z jedną lub większą liczbą cząsteczek efektorowych. 8. Izolowana sekwencja DNA kodująca ciężkie i lekkie łańcuchy przeciwciała według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do Wektor do klonowania lub ekspresji zawierający jedną lub większą liczbę sekwencji DNA według zastrzeżenia 8.. Wektor według zastrzeżenia 9, gdzie ten wektor zawiera sekwencje podane w SEQ ID NO: 14 i SEQ ID NO: Komórka gospodarz do ekspresji przeciwciała według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 6, zawierająca: i) sekwencję DNA kodującą łańcuch ciężki tego przeciwciała, i ii) sekwencję DNA kodującą łańcuch lekki tego przeciwciała przy czym te sekwencje DNA są dostarczone w jednym lub większej liczbie wektorów do klonowania lub ekspresji. 12. Komórka gospodarz według zastrzeżenia 11, zawierająca jeden lub większą liczbę wektorów do klonowania lub ekspresji według zastrzeżenia 9 albo zastrzeżenia. 13. Sposób wytwarzania przeciwciała według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 6, obejmujący hodowanie komórki gospodarza według zastrzeżenia 11 i wydzielanie tego przeciwciała. 14. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca przeciwciało według któregokolwiek z za-

40 strzeżeń 1 do 6, w połączeniu z jedną lub większą liczbą spośród farmaceutycznie dopuszczalnej zaróbki, rozcieńczalnika lub nośnika. 1. Kompozycja farmaceutyczna według zastrzeżenia 14, dodatkowo zawierająca inne składniki aktywne. 16. Przeciwciało według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 6 lub kompozycja farmaceutyczna według zastrzeżenia 14 albo zastrzeżenia 1 do stosowania w terapii. 17. Przeciwciało według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 6 lub kompozycja farmaceutyczna według zastrzeżenia 14 albo zastrzeżenia 1 do stosowania w leczeniu lub profilaktyce zaburzenia patologicznego, w którym pośredniczy IL-17A i/lub IL-17F albo które jest związane ze zwiększonym poziomem IL-17A i/lub IL-17F, gdzie to zaburzenie patologiczne jest wybrane z grupy składającej się z zakażeń (wirusowych, bakteryjnych, grzybiczych i pasożytniczych), wstrząsu endotoksycznego związanego z zakażeniem, zapalenia stawów, reumatoidalnego zapalenia stawów, astmy, choroby zapalnej miednicy, choroby Alzheimera, choroby Crohna, choroby Peyroniego, choroby trzewnej, choroby pęcherzyka żółciowego, choroby związanej z powstawaniem torbieli włosowych, zapalenia otrzewnej, łuszczycy, zapalenia naczyń, zrostów chirurgicznych, udaru, cukrzycy typu I, zapalenia stawów z Lyme, zapalenia opon i mózgu, zaburzeń zapalnych ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego w których pośredniczy układ odpornościowy, takich jak stwardnienie rozsiane i zespół Guillaina- Barrego, innych zaburzeń autoimmunologicznych, zapalenia trzustki, urazu (operacji), choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi, odrzucenia przeszczepu, raka (zarówno guzów litych, takich jak czerniaki, wątrobiaki zarodkowe, mięsaki, raki płaskonabłonkowe, raki komórek przejściowych, raki jajnika, jak i hematologicznych nowotworów złośliwych, w szczególności ostrej białaczki szpikowej, przewlekłej białaczki szpikowej, raka żołądka i raka jelita grubego), choroby serca, w tym chorób niedokrwiennych takich jak zawał mięśnia sercowego, a także miażdżyca tętnic, krzepnięcia wewnątrznaczyniowego, resorpcji kości, osteoporozy, zapalenia ozębnej i niedoboru kwasu solnego w soku żołądkowym. Uprawniony: UCB Biopharma SPRL Pełnomocnik: dr inż. Wojciech Tykarski Rzecznik patentowy

41 40

42 41