Rola wybranych metaloproteinaz macierzy zewnątrzkomórkowej i tkankowych inhibitorów metaloproteinaz w raku pęcherza moczowego Edyta Wieczorek Praca doktorska wykonana pod kierunkiem Dr hab. Edyty Reszki, prof. IMP Zakład Toksykologii i Kancerogenezy 2016 Zbiór publikacji wchodzących w skład rozprawy doktorskiej 1.1 Wieczorek E, Reszka E, Jablonowski Z, Jablonska E, Beata Krol M, Grzegorczyk A, Gromadzinska J, Sosnowski M, Wasowicz W. Genetic polymorphisms in matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of MPs (TIMPs), and bladder cancer susceptibility. BJU Int. 2013;112(8):1207-14, doi: 10.1111/bju.12230, Praca oryginalna (IF 3,130, MNiSW 35pkt.), 1.2 Wieczorek E, Wasowicz W, Gromadzinska J, Reszka E. Functional polymorphisms in the matrix metalloproteinase genes and their association with bladder cancer risk and recurrence: A mini-review. Int J Urol. 2014;21(8):744-52, doi: 10.1111/iju.12431, Praca przeglądowa (IF 2,409, MNiSW 25pkt.), 1.3 Wieczorek E, Reszka E, Wasowicz W, Grzegorczyk A, Konecki T, Sosnowski M, Jablonowski Z. MMP7 and MMP8 genetic polymorphisms in bladder cancer patients. Cent European J Urol. 2014;66(4):405-10, doi: 10.5173/ceju.2013.04.art3, Praca oryginalna (IF 0,000, MNiSW 9pkt.), 1.4 Wieczorek E, Jablonska E, Wasowicz W, Reszka E. Matrix metalloproteinases and genetic mouse models in cancer research: a mini-review. Tumor Biol. 2015 Jan;36(1):163-75. doi: 10.1007/s13277-014-2747-6, Praca przeglądowa (IF 2,926, MNiSW 30pkt.), 1.5 Wieczorek E, Jablonowski Z, Fendler W, Tomasik B, Jablonska E, Konecki T, Gromadzinska J, Sosnowski M, Wasowicz W, Reszka E. MMP, VEGF and TIMP as prognostic factors in recurring bladder cancer. Clin Biochem. 2015 Dec;48(18):1235-40. doi: 10.1016/j.clinbiochem.2015.07.021, Praca oryginalna (IF 2,382, MNiSW 30pkt.). 1
STRESZCZENIE Rak pęcherza moczowego jest najczęściej występującym nowotworem układu moczowego i dotyka czterokrotnie częściej mężczyzn niż kobiety. Krajowy Rejestr Nowotworów z 2013 roku podaje, iż w klasyfikacji zachorowań na nowotwory złośliwe w Polsce rak pęcherza moczowego plasuje się na 4 miejscu wśród mężczyzn (6,9%) i na 14 miejscu wśród kobiet (2,0%). Metaloproteinazy macierzy zewnątrzkomórkowej (MMPs-matrix metalloproteinases) to enzymy proteolityczne, które w sposób znaczący uczestniczą w procesach patologicznych, m.in. w kancerogenezie. Ich rola w progresji choroby nowotworowej polega przede wszystkim na degradacji macierzy zewnątrzkomórkowej, co umożliwia inwazję nowotworową, przerzuty, angiogenezę oraz pobudzanie do wzrostu komórek nowotworowych. Najważniejszymi tkankowymi inhibitorami MMPs są tkankowe inhibitory metaloproteinaz (TIMPs-tissue inhibitors of metalloproteinases). Podstawową rolą TIMPs jest hamowanie proteolitycznej aktywności MMPs przez wiązanie niekowalencyjne z aktywnymi MMPs. TIMPs również ograniczają aktywność proteolityczną MMPs poprzez przyłączenie się do zymogenów MMPs (pro-mmp). Obecnie do najważniejszych czynników prognostycznych w raku pęcherza moczowego zalicza się m.in. liczbę i wielkość guzów, częstotliwość nawrotów, stopień zaawansowania i stopień złośliwości histopatologicznej. Do oceny ryzyka wystąpienia wznowy używany jest EORTC kalkulator ryzyka. Niestety żadna z powyższych metod nie jest niezawodna w przewidywaniu przebiegu choroby i ocenie ryzyka wystąpienia wznowy u pacjentów po TUR. Obecnie także żaden z badanych testów genetycznych nie jest w stanie zastąpić badania cystoskopem w diagnostyce i monitorowaniu raka pęcherza moczowego. Prawdopodobnie w przyszłości czułe i obiektywne czynniki prognostyczne oznaczane metodami molekularnymi podczas monitorowania chorych po zabiegach leczniczych uzupełnią np. rutynowe badania cytologiczne. Przez co przyczynią się do zwiększenia skuteczności leczenia i wydłużenia czasu przeżycia pacjentów. Cel pracy. Cele tej rozprawy koncentrują się wokół roli wybranych MMPs i TIMPs w rozwoju oraz przebiegu raka pęcherza moczowego. Zaproponowana w pracy analiza polimorfizmu genetycznego oraz zbadanie profilu ekspresji mrna wybranych MMPs i TIMPs, umożliwi przybliżenie znaczenia czynników genetycznych tych enzymów w raku pęcherza moczowego w populacji kaukaskiej. Spośród licznej rodziny metaloproteinaz do analiz polimorfizmu genetycznego wybraliśmy jedne z najważniejszych, tj.: MMP1, MMP2, MMP7, MMP8, MMP9, MMP12 oraz z rodziny tkankowych inhibitorów metaloproteinaz, tj.: TIMP1 i TIMP3. Natomiast ekspresja mrna w leukocytach krwi obwodowej (PBLs - peripheral blood leukocytes) została zbadana dla genów MMP1, MMP2, MMP9 oraz TIMP1 i TIMP3. Dodatkowo, włączenie do analizy obrazu histopatologicznego, tj.: stopień zaawansowania guza pierwotnego i stopień zróżnicowania, pozwoliło na zbadanie przypuszczalnej roli MMPs i TIMPs w etiologii raka pęcherza moczowego. Szczegółowe cele pracy doktorskiej wraz z publikacjami (oznaczenia publikacji podano w nawiasach, zgodnie z zestawieniem ze stronie 1) przedstawiono poniżej: 1.) Zbadanie związku pomiędzy genotypem MMP1 (rs1799750), MMP2 (rs243865), MMP7 (rs11568818), MMP8 (rs11225395), MMP9 (rs3918242), MMP12 (rs2276109), TIMP1 (rs2070584) i TIMP3 (rs9619311) a ryzykiem zachorowania na raka pęcherza moczowego w populacji kaukaskiej (1.1 i 1.3), 2.) Zbadanie związku pomiędzy genotypem MMP1 (rs1799750), MMP2 (rs243865), MMP7 (rs11568818), MMP8 (rs11225395), MMP9 (rs3918242), MMP12 (rs2276109), TIMP1 (rs2070584) i TIMP3 (rs9619311) a stopniem zróżnicowania i zaawansowania raka pęcherza moczowego podczas diagnozy (1.1 i 1.3), 2
3.) Przybliżenie obecnego stanu wiedzy oraz klinicznej wartości prognozowania ryzyka raka pęcherza moczowego i jego wznowy, na podstawie polimorfizmu genetycznego MMPs (1.2), 4.) Przybliżenie obecnego stanu wiedzy i znaczenia Mmps z wykorzystaniem genetycznych modeli mysich oraz MMPs z wykorzystaniem badań asocjacyjnych w badaniach nad nowotworami (1.4), 5.) Zbadanie profilu ekspresji mrna w PBLs dla genów MMP1, MMP2, MMP9, TIMP1 i TIMP3, w odniesieniu do wystąpienia choroby i wznowy, a także obrazu histopatologicznego i nałogu palenia (1.5), 6.) Zbadanie związku pomiędzy całkowitym stężeniem MMP1 w osoczu krwi chorych na raka pęcherza moczowego, a obrazem histopatologicznym oraz czasem do wystąpienia wznowy (1.5). Materiał i metody. W skład grup badanych weszli pacjenci I Kliniki Urologii, Katedry Urologii Uniwersytetu Medycznego, osoby zgłaszające się do przychodni Podstawowej Opieki Zdrowotnej przy tym szpitalu oraz osoby uczestniczące w badaniach Pracowni Biochemii Toksykologicznej IMP. Materiał biologiczny był zbierany i zabezpieczany w latach 2005-2013. U ochotników uczestniczących w badaniu wykonano badanie kwestionariuszowe. Dodatkowo od pacjentów uzyskano informacje dotyczące wyniku histopatologicznego, tj.: stopień zaawansowania (T) i stopień zróżnicowania (G), a także czasu do wystąpienia wznowy. W badaniu analizującym polimorfizm genetyczny grupę kontrolną stanowiła grupa 199 osób zdrowych, a grupę badaną grupa 241 osób z rozpoznanym rakiem pęcherza moczowego. W badaniu analizującym ekspresję genów grupę kontrolną stanowiła grupa 100 osób zdrowych, a grupę badaną stanowiło 40 pacjentów chorych na raka pęcherza moczowego, którzy oddawali krew dwukrotnie, przy pierwszym wystąpieniu raka, tj. diagnoza (n=40) i przy wznowie (n=40). Całkowite stężenie MMP1 oznaczono w 80 próbach od pacjentów chorych na raka pęcherza. Z krwi pobranej na heparynę litową, wyizolowano genomowe DNA przy pomocy komercyjnego zestawu QIAamp DNA Mini Kits. Do analiz polimorfizmu genetycznego MMP7, MMP8, TIMP1, TIMP3 wykorzystano technikę RT-PCR z sondami fluorescencyjnymi TaqMan. Dla polimorfizmu MMP1, MMP2, MMP9, MMP12 wykorzystano technikę krzywych topnienia wysokiej rozdzielczości (HRM) przy użyciu aparatu CFX96. Identyfikacja genotypu HRM została wykonana poprzez badanie polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP-PCR) lub sekwencjonowanie (1.1). Do badania ekspresji genów wykorzystano krew pobraną na EDTA. Komórki z krwi obwodowej lizowano w buforze do lizy RLT z 0.1% β-merkaptoetanolem. Następnie całkowite RNA zostało wyizolowane z zamrożonych lizatów PBLs (-70 C) przy pomocy komercyjnego zestawu RNeasy Mini Kit i przepisane na cdna - QuantiTect cdna synthesis kit. Do zbadania profilu ekspresji wybranych genów w PBLs wykorzystano technikę qrt-pcr z barwnikiem interkalującym SYBR Green, przy użyciu aparatu Real-Time LightCycler 96 (1.5). Oznaczenie całkowitego stężenia MMP1, czyli formy proaktywnej i aktywnej tego enzymu wykonano w osoczu pacjentów z rakiem pęcherza moczowego, przy pomocy komercyjnego testu immunoenzymatycznego (1.5). Wyniki. Analiza charakterystyki grup uczestniczących w badaniu polimorfizmu genetycznego, wykazała różnice pomiędzy grupami dla rozkładu płci (p=0,001) oraz brak różnic w średniej wieku (p=0,872). Różnice w statusie palenia były istotne statystycznie zarówno przy podziale na dwie grupy, tj. niepalący, palący (p=0,048), a także przy podziale na trzy grupy, tj. nigdy niepalący, byli palący i palący (p=0,001) (1.1 i 1.3). Podczas charakterystyki grup wykorzystanych w badaniu ekspresji genów, wykazałam istotne statystycznie różnice dla indeksu masy ciała (p=0,001) i statusu palenia (p<0,001). Nie wykazałam 3
4 różnic pomiędzy grupą kontrolną a grupą pacjentów z rakiem pęcherza moczowego pod względem płci (p=0,815) i rozkładu wieku (p=0,151) (1.5). W badaniach wykazałam istotny wpływ polimorfizmu MMP1 (rs1799750), gdzie genotyp 2G/1G+1G/1G związany był z obniżonym ryzykiem zachorowania na raka pęcherza moczowego (OR=0,62; 95% CI=0,39-0,98; p=0,042). Dla polimorfizmu genetycznego MMP7 (rs11568818) wykazałam częstsze występowanie genotypu GG wśród chorych w porównaniu z grupą kontrolną (OR=1,54; 95% CI=0,93-2,55; p=0,093). Dla pozostałych polimorfizmów nie wykazałam związku pomiędzy genotypem związanym z nosicielstwem przynajmniej jednego rzadkiego allela a ryzykiem raka pęcherza moczowego, tj.: MMP2 (rs243865) (OR=1,05; 95% CI=0,71-1,55; p=0,799), MMP7 (rs11568818) (OR=0,91; 95% CI=0,60-1,39; p=0,662), MMP8 (rs11225395) (OR=0,96; 95% CI=0,63-1,46; p=0,836), MMP9 (rs3918242) (OR=1,30; 95% CI=0,86-1,95; p=0,209), MMP12 (rs2276109) (OR=1,21; 95% CI=0,78-1,88; p=0,372). Kombinowany genotyp MMP2 (rs243865) z MMP9 (rs3918242) wpływał na wzrost ryzyka zachorowania na raka pęcherza moczowego u osób z podwójnie rzadkim allelem TT dla obu genów (OR=2,00; 95% CI=1,10-3,62; p=0,022). Badanie polimorfizmu genetycznego TIMPs nie wykazało istotnego statystycznie związku pomiędzy genotypem związanym z nosicielstwem przynajmniej jednego rzadkiego allela a ryzykiem choroby dla TIMP1 (rs2070584) wśród mężczyzn (OR=1,10; 95% CI=0,72-1,68; p=0,652) i kobiet (OR=0,66; 95% CI=0,11-3,67; p=0,638), oraz dla TIMP3 (rs9619311) (OR=0,99; 95% CI=0,67-1,45; p=0,952). Analizę polimorfizmu genetycznego dla TIMP1 wykonałam z podziałem na płeć ze względu na położenie tego genu na chromosomie X (1.1 i 1.3). W pracy przeglądowej (1.2) przedstawiłam obecny stan wiedzy dotyczący możliwości klinicznego zastosowania badań SNPs w genach MMPs i TIMPs, tj. w prognozowaniu ryzyka czy taż wznowy. Zebrane dane dowodzą, iż genetyczny polimorfizm MMP1 (rs1799750) jest najczęściej badanym polimorfizmem, sugerowane jest także, iż rzadki genotyp 2G2G może wiązać się ze wzrostem ryzyka zachorowania na raka pęcherza moczowego, szczególnie wśród palaczy. Praca także dostarcza podstawowej wiedzy, która może zostać wykorzystana w przyszłych badaniach związanych ze znaczeniem polimorfizmu genów. Badanie roli MMPs w procesie kancerogenezy jest przeprowadzane także z wykorzystaniem modeli zwierzęcych. Analizy genetycznie modyfikowanych gryzoni ze zmienioną aktywnością genów kodujących Mmp, przybliżają znaczenie MMPs w rozwoju różnych typów nowotworów. W pracy przeglądowej przybliżyłam istniejący stan wiedzy i dowody na znaczenie wybranych MMPs przy wykorzystaniu genetycznych mysich modelach nowotworowych i ludzkich genetycznych badaniach asocjacyjnych. Spośród 25 MMPs, jedynie MMP1, MMP2, MMP3, MMP7, MMP8, MM9, MMP11, MMP14, MMP19 zostały przebadane w mysich modelach. Jedną z najczęściej badanych MMPs była MMP9. Z kolei do najczęściej badanych nowotworów zaliczmy rak piersi, płuc i trzustki. Opisane badania potwierdzają znaczenie genów MMPs w genetycznych patofizjologicznych mechanizmach w różnych typach nowotworów (1.4). Porównując wyniki ekspresji pomiędzy grupami zaobserwowałam istotnie niższą ekspresję genu MMP1 wśród pacjentów ze wznową w porównaniu do grupy kontrolnej (p=0,019). Ekspresja pozostałych genów MMP2, MMP9, TIMP1, TIMP3 nie różniła się istotnie pomiędzy tymi grupami. W momencie diagnozy ekspresja genu MMP9 była związana proporcjonalnie ze stopniem złośliwości guza (p=0,043). Ekspresja MMP9 była wyższa wśród palących pacjentów (p=0,039). Analizując wyniki ekspresji mrna MMP1, MMP2, MMP9, TIMP1, TIMP3 podczas przebiegu choroby (diagnoza vs. wznowa) zaobserwowałam istotny związek pomiędzy ekspresją genu MMP9, TIMP1 a stopniem zróżnicowania guza (p=0,029, p=0,043) oraz ekspresją genu TIMP1 a wystąpieniem wznowy (p=0,003). Wśród pacjentów ze stopniem zróżnicowania G2 ekspresja genu MMP9 wzrastała pomiędzy wizytami (diagnoza vs. wznowa). Natomiast u pacjentów ze szybką wznową (<12mc) zaobserwowałam obniżenie ekspresji genu TIMP1 podczas wznowy (1.5).
Analizy wyników stężenia MMP1 w osoczu pacjentów z rakiem pęcherza moczowego wykazały nieistotne statystycznie różnice pomiędzy wizytami (diagnoza vs. wznowa) (p=0,216). Porównanie stężeń MMP1 u pacjentów w momencie diagnozy z podziałem na wczesną i późną wznowę wykazały także nieistotne różnice (p=0,731). Także nie zaobserwowałam zależności pomiędzy stężeniami MMP1, a stopniem zaawansowania guza (p=0,873) czy stopniem zróżnicowania (p=0,599). Stężenia MMP1 nie korelowały z ekspresją genu MMP1, wśród badanych pacjentów z rakiem pęcherza moczowego (diagnoza R=-0,34, p=0,104, wznowa R=-0,27, p=0,180) (1.5). Wnioski. Uzyskane wyniki pozwoliły na sformułowanie następujących wniosków: 1. Spośród przebadanych SNPs: MMP1 (rs1799750), MMP2 (rs243865), MMP7 (rs11568818), MMP8 (rs11225395), MMP9 (rs3918242), MMP12 (rs2276109), TIMP1 (rs2070584) i TIMP3 (rs9619311), jedynie polimorfizm genu MMP1 (rs1799750) jest związany z ryzykiem wystąpienia raka pęcherza moczowego, szczególnie wśród osób palących tytoń (1.1, 1.3), 2. Polimorfizm genu MMP1 (rs1799750) jest najlepiej przebadanym SNPs i sugeruje się, iż rzadki genotyp 2G2G wpływa na wzrost ryzyka zachorowania na raka pęcherza moczowego, szczególnie wśród palących tytoń (1.2), 3. Genetyczne badania u ludzi wykazują wpływ SNPs w genach kodujących MMPs na ryzyko raka i fenotypowe cechy guza. Wydaje się, że utrata funkcji genu Mmp może mieć porównywalne znaczenie do funkcjonalnego polimorfizmu genetycznego MMPs. Dlatego też, metody inżynierii genetycznej na myszach mogą być wykorzystane jako tło pokazujące zależność pomiędzy środowiskowymi czynnikami ryzyka, genotypem i rakiem (1.4), 4. Ekspresja genu MMP9 w PBLs pacjentów w momencie diagnozy jest związana ze stopniem zróżnicowania guza i z paleniem tytoniu (1.5), 5. Ekspresja genów MMP9 i TIMP1 może spełniać ważną rolę w regulacji progresji raka pęcherza moczowego (1.5), 6. Ekspresja genu TIMP1 poprzez związek z wcześniejszą wznową raka pęcherza moczowego może być uznawana za ważny czynnik prognostyczny wznowy (1.5). 5