RZECZPOSPOLITA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 188222 POLSKA (21) Numer zgłoszenia: 329386 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: 24.04.1997 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego- 24.04.1997, PCT/DK97/00184 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: 30.10.1997, WO97/39768, PCT Gazette nr 46/97 ( 5 4 ) Wodny preparat farmaceutyczny zawierający ludzki hormon wzrostu oraz sposób jego wytwarzania (51) IntCl7 A61K 38/27 A61K 47/18 (30) Pierwszeństwo: 24.04.1996, DK,0490/96 (43) Zgłoszenie ogłoszono: 29.03.1999 BUP 07/99 (73) Uprawniony z patentu: NOVO NORDISK A/S, Bagsvaerd, DK (72) Twórcy wynalazku: Soren Bjorn, Lyngby, DK Hans Sorensen, Virum, DK Peter Langballe, Chariotteniund, DK Silke Molier Larsen, Chariotteniund, DK Kirsten Ebbehoj, Nerum, DK Brithe Lykkegaard Hansen, Verlose, DK (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 31.12.2004 WUP 12/04 (74) Pełnomocnik: Płotczyk Leokadia, POLSERVICE Sp.z o. o. PL 188222 B1 (57) 1. Wodny preparat farmaceutyczny, znamienny tym, że obejmuje: - ludzki hormon wzrostu (GH) w ilości od 1 mg/ml do 15 mg/ml; - histydynę w ilości od 0,05 do 0,5 mg/mg hgh; - poloksamer 188 w ilości od 0,1 do 2 mg/mg hgh; - mannitol w ilości nadającej izotoniczność, oraz - fenol jako konserwant; przy czym preparat ma ph od 6,0 do 6,3. 3. Sposób wytwarzania preparatu określonego w zastrz. 1, znamienny tym, ze obejmuje rozpuszczanie takiej ilości ludzkiego hormonu wzrostu, by jego ilość w końcowym preparacie wodnym sięgała od 1do 15 mg w roztworze wodnym zawierającym wodę dejonizowaną, histydynę w ilości od 0,05 do 0,5 mg/mg hgh; poloksamer 188 w ilości od 0,1 do 2 mg/mg hgh; mannitol w ilości nadającej izotoniczność, oraz fenol; przy czym ph preparatu doprowadza się do wartości H od 6,0 do 6,3.
2 188 222 Wodny preparat farmaceutyczny zawierający ludzki hormon wzrostu oraz sposób jego wytwarzania Zastrzeżenia patentowe 1. Wodny preparat farmaceutyczny, znamienny tym, że obejmuje: - ludzki hormon wzrostu (GH) w ilości od 1 mg/ml do 15 mg/ml; - histydynę w ilości od 0,05 do 0,5 mg/mg hgh; - poloksamer 188 w ilości od 0,1 do 2 mg/mg hgh; - mannitol w ilości nadającej izotoniczność, oraz - fenol jako konserwant; przy czym preparat ma ph od 6,0 do 6,3. 2. Preparat farmaceutyczny według zastrz. 1, znamienny tym, że ma ph w przybliżeniu 6,1. 3. Sposób wytwarzania preparatu określonego w zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje rozpuszczanie takiej ilości ludzkiego hormonu wzrostu, by jego ilość w końcowym preparacie wodnym sięgała od 1 do 15 mg w roztworze wodnym zawierającym wodę dejonizowaną, histydynę w ilości od 0,05 do 0,5 mg/mg hgh; poloksamer 188 w ilości od 0,1 do 2 mg/mg hgh; mannitol w ilości nadającej izotoniczność, oraz fenol; przy czym ph preparatu doprowadza się do wartości H od 6,0 do 6,3. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że ph uzyskanego preparatu doprowadza się do wartości w przybliżeniu 6,1. * * Dziedzina wynalazku Wynalazek dotyczy nowego preparatu farmaceutycznego zawierającego hormon wzrostu, lub pochodną hormonu wzrostu, i aminokwas wybrany z grupy obejmującej: Asp, Ile, Val, Leu, His, lub pochodną histydyny, lub peptyd obejmujący co najmniej jeden zasadowy aminokwas i co najmniej jeden kwasowy aminokwas, i niejonowy detergent, np. polisorbat lub poloksamer. Wynalazek ponadto dotyczy sposobu wytwarzania takiego preparatu. Tło wynalazku Hormony wzrostu u człowieka i u pospolitych zwierząt domowych są proteinami o około 191 aminokwasach, zsyntetyzowanymi i wydzielanymi w przednim płacie gruczołu przysadki. Ludzki hormon wzrostu składa się ze 191 aminokwasów. Hormon wzrostu stanowi kluczowy hormon związany z regulacją nie tylko wzrostu somatycznego, lecz także z regulacją metabolizmu protein, węglowodanów i lipidów. Główne działanie hormonu wzrostu polega na sprzyjaniu wzrostowi. Układy narządów, na które wpływa hormon wzrostu obejmują szkielet, tkankę łączną, mięśnie i narządy wewnętrzne, takie jak wątroba, jelita, nerki. Do czasu rozwoju techniki rekombinacyjnej i klonowania genu hormonu wzrostu, co zapoczątkowało wytwarzanie- przykładowo ludzkiego hormonu wzrostu (hgh) i Met-hGH na skalę przemysłową, ludzki hormon wzrostu można było jedynie otrzymać przez wyciąg z gruczołu przysadki zmarłych ludzi. Bardzo ograniczone ilości hormonu wzrostu ograniczyły jego stosowanie do wspomagania wzrostu wzdłużnego w dzieciństwie i okresie dojrzewania dla leczenia karłowatości, chociaż proponowano jego użycie m.in. w leczeniu niskiego wzrostu (wskutek niedoboru hormonu wzrostu, normalny niski wzrost i syndrom Turnera), niedoboru hormonu wzrostu u dorosłych, bezpłodności, oparzeń, ran, dystrofii, zrost fragmentów kości, osteoporozy, rozproszonego krwawienia żołądka i pseudochoroby zwyrodnieniowej stawów. Ponadto zaproponowano stosowanie hormonu wzrostu w celu zwiększenia szybkości wzrostu zwierząt domowych lub dla obniżenia ilości tłuszczu.
188 222 3 Preparaty farmaceutyczne hormonu wzrostu są nietrwale. Tworzą się produkty degradacji, takie jak deamidowane lub sulfotlenkowane produkty oraz formy dimerowe lub polimerowe - zwłaszcza w roztworach hormonu wzrostu. Dominującymi reakcjami chemicznymi degradacji hgh są 1) deamidowanie przez bezpośrednią hydrolizę lub przez pośredni cykliczny sukcynimid z utworzeniem różnych ilości L-asphGH, L-izo-asp-hGH, D-asp-hGH, i D-izo-asp-hGH (ref 1-3), 2) utlenianie reszt metioniny w pozycjach 14 i 125 (ods. 4-9), i 3) rozszczepienie wiązań peptydowych. Deamidowanie ma miejsce zwłaszcza w Asn w pozycji 149. hgh dość łatwo ulega utlenieniu w pozycjach 14 i 125, zwłaszcza w roztworze (4-8), ponieważ utlenianie hgh w roztworze, gdzie tworzą się sulfotlenki, odbywa się zwykle wskutek tlenu rozpuszczonego w preparacie. Obecnie nie uważa się, że te produkty degradacji powinny mieć toksyczną lub zmienioną aktywność biologiczną lub własności wiązania do receptora, lecz wskazuje się na taki efekt, że trwałość konformacji sulfotlenków jest obniżona w porównaniu z rodzimym hgh. Innymi produktami degradacji hormonu wzrostu są produkty agregacji takie jak dimery i polimery. Wykonano badania w celu wyjaśnienia roli tych form w indukowaniu reakcji immunologicznej przy użyciu mierzalnych ilości przeciwciał względem rodzimego hgh. Badania te wykazały, że agregaty hgh stanowią pierwotną przyczynę immunogenności u pacjentów. Zatem jest pożądane, by w formulacji farmaceutycznej uniknąć tworzenia agregatów hormonu wzrostu, ponieważ takie agregaty są zdolne do spowodowania niepożądanej immunogenności lub zmiany okresu półtrwania. Kinetyka degradacji zalezy od temperatury, ph i różnych dodatków lub adjuwantów w formulacji hgh. Wskutek nietrwałości, preparat hormonu wzrostu jest obecnie - w celu zminimalizowania degradacji - w normalnym przypadku liofilizowany i przechowywany w liofilizowanej formie w 2-8 C do momentu rekonstytuowania (przywrócenia pierwotnej postaci) przed użyciem. Liofilizowane preparaty farmaceutyczne obejmujące hgh są rekonstytuowane przez pacjenta, a następnie przechowywane jako roztwór podczas stosowania przez okres do 30 dni, w którym to czasie zachodzi pewna degradacja. Obecnie uważa się, że korzystne jest przywracanie hormonu wzrostu do pierwotnej postaci możliwie najpóźniej przed użyciem i przechowywanie oraz przesyłanie preparatu w stanie liofilizowanym. Począwszy od wytwórcy aż do apteki, można operować preparatami przy kontrolowanej niskiej temperaturze np. 2-8 C, co pozwala na okres przechowywania do trzech lat. Korzystnie, liofilizowany, a następnie rekonstytuowany preparat powinien być trwały u końcowego odbiorcy w stanie liofilizowanym przez około jeden miesiąc i dodatkowo jeden miesiąc w stanie rekonstytuowanym w piórze przez zamierzony czas stosowania naboju. Alternatywnie do preparatów liofilizowanych i rekonstytuowanych, hormon wzrostu może być sformułowany jako preparat ciekły odpowiedni do stosowania w fiolkach lub w systemie pióra dla samoleczenia. Zwiększone stosowanie systemów z piórem dla samoleczenia i zwiększony obszar stosowania wymaga preparatu, który jest trwały przez wystarczająco długi okres czasu u końcowego odbiorcy. Taka stabilizacja ma bardzo duże znaczenie przy przeniesieniu podawania hormonu wzrostu z klinik do domów poszczególnych osób poddawanych leczeniu, gdzie może nie być optymalnych warunków przechowywania. Formulacja gotowa do użycia ponadto zmniejsza jakiekolwiek problemy z posługiwaniem się w związku z rekonstytuowaniem, a zatem jest wygodą dla pacjenta. Trwały rozpuszczony preparat obejmujący hormon wzrostu można wytwarzać w postaci gotowej do użycia jako fiolki stosowane przez pacjenta w połączeniu z typowymi strzykawkami lub jako naboje pasujące do pióra stosowanego przez pacjenta. W obydwu przypadkach, pacjent może uniknąć rekonstytuowania preparatu i tym samym nie będzie musiał dysponować liofilizowanym preparatem, odpowiednią zaróbką do rekonstytuowania oraz niezbędnymi umiejętnościami i sterylnym wyposażeniem dla sterylnego rekonstytuowania preparatu. Racje
4 188 222 bezpieczeństwa także przemawiają za tym, że pożądane jest uniknięcie rekonstytuowania liofilizowanego preparatu bezpośrednio przed użyciem preparatu. Z punktu widzenia wytwórcy, może być korzystne uniknięcie etapu liofilizacji w wytwarzaniu preparatów hormonu wzrostu. Liofilizacja jest procesem czasochłonnym i kosztownym i jest także często wąskim gardłem przy wytwarzaniu wskutek ograniczonej przepustowości liofilizatora. Zatem istnieje zapotrzebowanie na trwalsze rozpuszczone preparaty hormonu wzrostu, tak by ułatwić pacjentowi posługiwanie się lekiem. Istnieje także potrzeba zmniejszenia szybkości procesów degradacji, tak by preparaty rozpuszczonego hgh były trwałe podczas okresu przechowywania i podczas okresu stosowania do około jednego miesiąca. Stan techniki Dotychczasowe próby stabilizowania hgh nie były w pełni udane pod względem zapobiegania tworzeniu dimeru. Problemy związane z tworzeniem dimerów m.in. podano w: Becker, G.W., Biotechnology and Applied Biochemistry and Applied Biochemistry 9, 478 (1987). Opis międzynarodowego zgłoszenia patentowego nr WO 89/09614 i Australijskie zgłoszenie patentowe nr 30771/89 ujawniają trwały preparat farmaceutyczny zawierający ludzki hormon wzrostu, glicynę, i mannitol. Taki preparat wykazuje zwiększoną trwałość podczas normalnego przetwarzania i przechowywania w stanie liofilizowanym oraz w okresie stosowania po rekonstytuowaniu. Opublikowane Europejskie zgłoszenie patentowe nr 303 746 ujawnia, że zwierzęcy hormon wzrostu może być stabilizowany różnymi stabilizatorami dając zmniejszone tworzenie substancji nierozpuszczalnych oraz zachowanie aktywności rozpuszczalnej w środowiskach wodnych, przy czym takie stabilizatory zawierają pewne alkohole wielowodorotlenowe, aminokwasy, polimery aminokwasów o naładowanej grupie bocznej przy fizjologicznym ph, i sole choliny. Alkohole wielo wodorotlenowe są wybrane z grupy obejmującej: nieredukujące cukry, alkohole cukrowe, kwasy cukrowe, pentaerytrytol, laktozę, rozpuszczalne w wodzie dekstrany i Ficoll; amino kwasy są wybrane z grupy obejmującej: glicynę, sarkozynę, lizynę lub ich sole, serynę, argininę lub ich sole, betainę, N,N-dimetyloglicynę, kwas asparaginowy lub jego sole, kwas glutaminowy lub ich sole; polimery aminokwasów o naładowanej grupie bocznej przy fizjologicznym ph mogą być wybrane z grupy obejmującej: polilizynę, kwas poliasparaginowy, kwas poliglutaminowy, poliargininę, polihistydynę, poliomitynę i ich sole; a pochodne choliny są wybrane z grupy obejmującej: chlorek choliny, diwodorocytrynian choliny, diwinian choliny, wodorowęglan choliny, cytrynian tricholiny, askorbinian choliny, boran choliny, glukonian choliny, fosforan choliny, di(cholino)siarczan i śluzan dicholiny. Opis patentowy USA nr 4,917,685 ujawnia urządzenie do podawania służące do implantowania obejmujące hormon wzrostu stabilizowany przy użyciu tych samych stabilizatorów jak wspomniano w EP 303746. Opublikowane Europejskie zgłoszenie patentowe nr 374,120 ujawnia stabilizowany preparat obejmujący hgh i alkohol wielowodorotlenowy o trzech grupach hydroksylowych. Wspomniano glicerynę i tris(hydroksymetylo)aminometan. Ponadto ujawniono obecność chlorowodorku histydyny jako bufora wraz z alkoholem wielowodorotlenowym. Opis międzynarodowego zgłoszenia patentowego nr WO 93/12811 ujawnia stabilizowane preparaty hormonu wzrostu w formie liofilizowanego proszku lub wodnego roztworu obejmującego asparaginę. Opis międzynarodowego zgłoszenia patentowego nr WO 93/12812 ujawnia stabilizowane preparaty hormonu wzrostu w formie liofilizowanego proszku lub wodnego roztworu obejmującego histydynę. W takich preparatach deamidowanie jest zmniejszone o 25-30% w porównaniu do odpowiedniego preparatu hormonu wzrostu obejmującej bufor fosforanowy. Opis międzynarodowego zgłoszenia patentowego nr WO 96/11703 ujawnia stabilizowane preparaty hormonu wzrostu obejmujące izoleucynę. Opis międzynarodowego zgłoszenia patentowego nr WO 96/11702 ujawnia stabilizowane preparaty hormonu wzrostu obejmujące walinę.
188 222 5 Opis międzynarodowego zgłoszenia patentowego nr WO 96/11704 ujawnia stabilizowane preparaty hormonu wzrostu obejmujące leucynę. Opis międzynarodowego zgłoszenia patentowego nr WO 93/19776 ujawnia preparaty proteinowe zawierające hormon wzrostu z cytrynianem jako substancją buforującą bardziej trwałe niż preparaty obejmujące bufor fosforanowy. Preparaty mogą także obejmować aminokwasy, takie jak glicyna i alanina i/lub mannitol lub inne alkohole cukrowe i/lub glicerynę i/lub inne węglowodany i ewentualnie środek konserwujący taki jak alkohol benzylowy. Opis międzynarodowego zgłoszenia patentowego nr WO 94/03198 ujawnia trwały wodny preparat zawierający ludzki hormon wzrostu, bufor, niejonowy środek powierzchniowo czynny, i ewentualnie, sól obojętną mannitol, lub, środek konserwujący. Buforem może być histydyna, chociaż korzystny jest cytrynian. Zgłoszenie ujawnia korzystny preparat zawierający cytrynian jako bufor, i chlorek sodu i polisorbat 20 (Tween 20) dla stabilizacji. To połączenie stabilizuje wspomniany wodny preparat przeciwko agregacji, lecz nie przyczynia się do znaczących ilości deamidowanego hormonu wzrostu. Opis międzynarodowego zgłoszenia patentowego nr WO 95/35116 ujawnia trwały liofilizowany preparat zawierający sacharozę i, ewentualnie, mannitol. Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest wodny preparat farmaceutyczny, który obejmuje: - ludzki hormon wzrostu (GH) w ilości od 1 mg/ml do 15 mg/ml; - histydynę w ilości od 0,05 do 0,5 mg/mg hgh; - poloksamer 188 w ilości od 0,1 do 2 mg/mg hgh; - mannitol w ilości nadającej izotoniczność, oraz - fenol jako konserwant; przy czym preparat ma ph od 6.0 do 6.3, korzystnie w przybliżeniu 6.1. Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania preparatu określonego wyżej, który obejmuje rozpuszczanie takiej ilości ludzkiego hormonu wzrostu, by jego ilość w końcowym preparacie wodnym sięgała od 1 do 15 mg w roztworze wodnym zawierającym wodę dejonizowaną/histydynę w ilości od 0,05 do 0,5 mg/mg hgh; poloksamer 188 w ilości od 0,1 do 2 mg/mg hgh; mannitol w ilości nadającej izotoniczność, oraz fenol; przy czym ph preparatu doprowadza się do wartości H od 6,0 do 6,3, korzystnie w przybliżeniu 6,1. Nieoczekiwanie stwierdzono, że preparat farmaceutyczny obejmujący hormon wzrostu, lub pochodną hormonu wzrostu, i aminokwas wybrany z grupy obejmującej: Asp, Ile, Val, Leu, histydynę, lub pochodną histydyny, lub peptyd obejmujący co najmniej jedną zasadową resztę aminokwasową i co najmniej jedną kwasową resztę aminokwasową i niejonowy detergent, w której ilość peptydu lub Asp, Ile, Val, Leu lub His, lub pochodnej histydyny wynosi od około 0,01 do około 10 mg na mg GH, wykazuje wysoką trwałość względem deamidowania i agregacji. Trwałość produktu pozwala na jego przechowywanie i przesyłanie w stanie liofilizowanym lub w formie rozpuszczonej lub powtórnie rozpuszczonego preparatu. Peptyd obejmujący co najmniej jedną zasadową resztę aminokwasową i co najmniej jedną kwasową resztę aminokwasową stosowany zgodnie z niniejszym wynalazkiem może być peptydem obejmującym do 20 reszt aminokwasowych, korzystnie od 3 do 10 reszt aminokwasowych, zwłaszcza od 3 do 6 reszt aminokwasowych, takich jak 3 lub 4 reszty aminokwasowe (np. Lys-Gly-Asp-Ser). Zgodnie z jednym aspektem wynalazku, zasadowe i kwasowe reszty aminokwasowe krótszych peptydów są rozdzielone przez 1 lub 2 reszty aminokwasowe. Peptydy korzystnie obejmują naturalnie występujące reszty aminokwasowe alfa. Aminokwas^) może (mogą) być aminokwasem (aminokwasami) 1 lub d lub ich mieszaniną. Kwasowymi resztami aminokwasowymi są np. Glu lub Asp, a zasadowymi resztami aminokwasowymi są np. Lys lub Arg. Pochodnymi histydyny stosowanymi zgodnie z niniejszym wynalazkiem mogą być amidy i estry histydyny, takie jak ester metylowy lub etylowy, dipeptydy o sekwencji His-X lub X- His, gdzie X oznacza naturalnie występującą resztę a-aminokwasową, i analogi lub pochodne His, takie jak imidazol, des-amino-his lub poli-his. W korzystnym aspekcie, wynalazek dotyczy preparatu farmaceutycznej obejmującej hormon wzrostu (GH) lub pochodną hormonu wzrostu i aminokwas wybrany z grupy obejmu-
6 188 222 jącej: Asp, Ile, Val lub Leu, i niejonowy detergent, w którym ilość aminokwasu wybranego z grupy Asp, Ile, Val lub Leu wynosi od 0,01 do 10 mg na mg GH. W innym korzystnym aspekcie, wynalazek dotyczy preparatu farmaceutycznego obejmującego hormon wzrostu (GH) lub pochodną hormonu wzrostu i histydynę, lub pochodną histydyny, lub peptyd obejmujący co najmniej jedną zasadową resztę aminokwasową i co najmniej jedną kwasową resztę aminokwasową, i niejonowy detergent, w której ilość peptydu lub histydyny lub pochodnej histydyny wynosi od 0,01 do 10 mg na mg GH. W korzystnym wykonaniu powyższego aspektu, ilość peptydu lub wybranego aminokwasu lub histydyny lub pochodnej histydyny, wynosi od 0,05 do 5 mg na mg GH, korzystniej od 0,05 do 1 mg na mg GH, zwłaszcza od 0,05 do 0,7 mg na mg GH, a w szczególności od około 0,05 do 0,5 mg na mg GH. W korzystnym wykonaniu powyższego aspektu, niejonowy detergent jest wybrany spośród polisorbatu lub poloksameru, np. polisorbatu 20, poloksameru 188 lub poloksameru 407 (np. Pluronic F68, Lutrol 127, Tween 20), korzystniej poloksameru 188. W innym aspekcie, wynalazek dotyczy preparatu farmaceutycznego hormonu wzrostu, lub pochodnej hormonu wzrostu, obejmującego aminokwas wybrany z grupy obejmującej: Asp, Ile, Val, Leu, His, pochodną histydyny, lub peptyd obejmujący co najmniej jedną zasadową resztę aminokwasową i co najmniej jedną kwasową resztę aminokwasową, i niejonowy de tergent, w którym ilość niejonowego detergentu wynosi od 0,01 do 10 mg na mg GH. W korzystnym aspekcie, wynalazek dotyczy preparatu farmaceutycznego obejmującego hormon wzrostu (GH) lub pochodną hormonu wzrostu; i aminokwas wybrany z grupy obejmującej : Asp, Ile, Val i Leu, i niejonowy detergent, w którym ilość niejonowego detergentu wynosi od 0,01 do 10 mg na mg GH. W innym korzystnym aspekcie, wynalazek dotyczy preparatu farmaceutycznego obejmującego hormon wzrostu (GH), lub pochodną hormonu wzrostu i histydynę, lub pochodną histydyny, lub peptyd obejmujący co najmniej jedną zasadową resztę aminokwasową i co najmniej jedną kwasową resztę aminokwasową, i niejonowy detergent, w którym ilość niejonowego detergentu wynosi od 0,01 do 10 mg na mg GH. W korzystnym wykonaniu powyższego aspektu, ilość nie jonowego detergentu wynosi od 0,01 do 10 mg na mg GH, korzystniej od 0,05 do 5 mg na mg GH, zwłaszcza od 0,1 do 3 mg na mg GH, w szczególności od 0,1 do 2 mg na mg GH. W korzystnym wykonaniu powyższego aspektu, niejonowy detergent jest wybrany spośród polisorbatu lub poloksameru, np. polisorbatu 20, poloksameru 188, lub poloksameru 407 (np. Pluronic F68, Lutrol 127, Tween 20), korzystniej poloksameru 188. Innym aspektem wynalazku jest preparat farmaceutyczny obejmujący hormon wzrostu, lub pochodną hormonu wzrostu i aminokwas wybrany z grupy obejmującej: Asp, Ile, Val, Leu i His, i pochodną histydyny, lub peptyd obejmujący co najmniej jeden zasadowy aminokwas i co najmniej jeden kwasowy aminokwas, i niejonowy detergent, w której ilość peptydu, lub Asp, Ile, Val, Leu lub His, lub pochodnej histydyny, wynosi od 0,01 do 10 mg na mg GH, a ilość niejonowego detergentu wynosi od 0,1 do 2 mg na mg GH. W korzystnym aspekcie, wynalazek odnosi się do preparatu farmaceutycznego obejmującego hormon wzrostu lub po chodną hormonu wzrostu, i aminokwas wybrany z grupy obejmującej: Asp, Ile, Val i Leu, i niejonowy detergent, w której ilość Asp, Ile, Val lub Leu wynosi od 0,01 do 10 mg na mg GH, a ilość niejonowego detergentu wynosi od 0,1 do 2 mg na mg GH. W innym korzystnym aspekcie, wynalazek dotyczy preparatu farmaceutycznego obejmującej hormon wzrostu, lub po chodną hormonu wzrostu, i histydynę, lub pochodną histydyny, lub peptyd obejmujący co najmniej jedną zasadową resztę aminokwasową i co najmniej jedną kwasową resztę aminokwasową, i niejonowy detergent, w której ilość peptydu lub histydyny lub pochodnej histydyny wynosi od 0,01 do 10 mg na mg GH, a ilość niejonowego detergentu wynosi od 0,1 do 2 mg na mg GH. W korzystnym wykonaniu powyższego aspektu, ilość peptydu, lub Asp, Ile, Val, Leu lub His, lub pochodnej histydyny, wynosi od 0,05 do 5 mg na mg GH, korzystniej od 0,05 do 1 mg na mg GH, jeszcze korzystniej od 0,05 do 0,7 mg na mg GH, a zwłaszcza od 0,05 do 0,5 mg na mg GH.
188 222 7 W korzystnym wykonaniu powyższego aspektu, niejonowy detergent jest wybrany spośród polisorbatu lub poloksameru, np. polisorbatu 20, poloksameru 188, lub poloksamer 407 (np. Pluronic F68, Lutrol 127, Tween 20), korzystniej poloksameru 188. Inny aspekt wynalazku dotyczy preparatu farmaceutycznego obejmującego hormon wzrostu, lub aminokwas wybrany z grupy obejmującej: Asp, Ile, Val, Leu, His lub pochodną histydyny, lub peptyd obejmujący co najmniej jedną zasadową resztę aminokwasową i co najmniej jedną kwasową resztę aminokwasową, i poloksamer. W korzystnym aspekcie, wynalazek dotyczy preparatu farmaceutycznego obejmującego hormon wzrostu (GH) lub pochodną hormonu wzrostu, i aminokwas wybrany z grupy obejmującej : Asp, Ile, Val i Leu, i poloksamer. W innym korzystnym aspekcie, wynalazek dotyczy preparatu farmaceutycznego obejmującego hormon wzrostu, lub pochodną hormonu wzrostu, i histydynę, lub pochodną histydyny, lub peptyd obejmujący co najmniej jedną zasadową resztę aminokwasową i co najmniej jedną kwasową resztę aminokwasową, i poloksamer. W korzystnym wykonaniu powyższego aspektu, poloksamer jest wybrany spośród poloksameru 188, lub poloksameru 407, korzystniej poloksameru 188 (np. Pluronic F68). W innym korzystnym wykonaniu, preparat obejmuje histydynę, lub pochodną histydyny. W korzystnym wykonaniu, ilość peptydu, lub Asp, Ile, Val, Leu lub His, lub pochodnej histydyny wynosi od około 0,05 do około 5 mg na mg GH, korzystniej od 0,05 do 1 mg na mg GH, zwłaszcza od 0,05 do 0,7 mg na mg GH, a w szczególności od 0,05 do 0,5 mg na mg GH. W korzystnym wykonaniu, ilość niejonowego detergentu wynosi od 0,05 do 5 mg na mg GH, korzystniej od 0,1 mg do 3 mg na mg GH, a najkorzystniej od 0,1 do 2 mg na mg GH. Preparat według wynalazku może być w formie liofilizowanego proszku do rekonstytuowania później przy zastosowaniu typowych zarobek takich jak woda destylowana, lub woda do iniekcji, lub może być w formie roztworu wodnego obejmującego hormon wzrostu. Takie zarobki mogą obejmować typowe środki konserwujące, takie jak m-krezol, fenol, i alkohol benzylowy. Jako środek pęczniejący (środki pęczniejące) dla liofilizacji, można wybrać jeden lub więcej składników z grupy obejmującej: alkohole cukrowe, np. mannitol, i disacharydy, np. sacharozę. Korzystne są liofilizowane preparaty obejmujące sacharozę wskutek bardzo wysokiej trwałości, a preparaty obejmujące sacharozę oraz mannitol są szczególnie korzystne łącząc bardzo wysoką trwałość z bardzo dobrą przetwarzalnością dając zwarte liofilizowane produkty łatwo rozpuszczalne i bardzo trwałe w roztworze przez dłuższy okres czasu po rozpuszczeniu. Ponadto korzystnymi preparatami według wynalazku są preparaty obejmujące mannitol i sacharozę lub trehalozę jako środek pęczniejący dla liofilizacji. Preparaty według wynalazku obejmujące mannitol i disacharyd w normalnym przypadku obejmują w przybliżeniu równą ilość dwóch składników w kategoriach wagowych. Ilość sacharozy obecna w preparatach według wynalazku może się zmieniać w szerokich granicach. Stosunek ilościowy hormonu wzrostu do sacharozy może się zmieniać od 0,005 do 1,5 w kategoriach wagowych. Zatem ilość sacharozy może wynosić od 0,67 do 200 mg na mg hormonu wzrostu, przy czym korzystna jest ilość od 1,1 do 50 mg na mg hormonu wzrostu. W korzystnym wykonaniu wynalazku, hormon wzrostu jest ludzkim hormonem wzrostu (hgh) i kompozycja farmaceutyczna ponadto obejmuje nośnik w formie buforu wodnego. Taki preparat wodny jest w postaci gotowej do użycia i może być przechowywany i przesyłany jako taki bez jakiejkolwiek znaczącej degradacji. Bufor stosowany w roztworze hormonu wzrostu może być np. buforem histydynowym, cytrynianowym, winianowym lub fosforanowym. L-histydyna ma pka 6,0 i jest, stosownie do tego, odpowiednia sama jako bufor w zakresie ph od 5 do 7. W dalszym aspekcie wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania preparatu farmaceutycznego obejmującego hormon wzrostu, lub pochodną hormonu wzrostu i aminokwas wybrany z grupy obejmującej: Asp, Ile, Val, Leu i His, i pochodną histydyny lub peptyd obejmujący co najmniej jedną zasadową resztę aminokwasową i co najmniej jedną kwasową resztę aminokwasową, i niejonowy detergent, w którym odpowiednia ilość hormonu wzrostu, lub pochodnej hormonu wzrostu, jest rozpuszczana w roztworze obejmującym aminokwas wybrany z grupy obejmującej: Asp, Ile, Val, Leu i His, i pochodną histydyny, lub peptyd obejmujący co
8 188 222 najmniej jedną zasadową resztę aminokwasową i co najmniej jedną kwasową resztę aminokwasową w wodzie demineralizowanej, i niejonowy detergent, np. polisorbat lub poloksamer, ewentualnie zawierający środek konserwujący, i ewentualnie zawierający środek dla dobrania toniczności, i ewentualnie dobrania ph do wartości od 6,0 do 8,8; przy czym odpowiednią ilością GH jest taka, która daje ilość peptydu, Asp, Ile, Val, Leu lub His, lub pochodnej histydyny sięgającą od 0,01 do 10 mg na mg GH. W dalszym aspekcie, wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania preparatu farmaceutycznego obejmującego hormon wzrostu, lub pochodną hormonu wzrostu, i, aminokwas wybrany z grupy obejmującej: Asp, Ile, Val, Leu i His, i pochodną histydyny lub peptyd obejmujący co najmniej jedną zasadową resztę aminokwasową i co najmniej jedną kwasową resztę aminokwasową i niejonowy detergent, w której hormon wzrostu, lub pochodna hormonu wzrostu, jest rozpuszczana w roztworze obejmującym aminokwas wybrany z grupy obejmującej: Asp, Ile, Val, Leu i His, i pochodną histydyny lub peptyd obejmujący co najmniej jedną zasadową resztę aminokwasową i co najmniej jedną kwasową resztę aminokwasową w wodzie demineralizowanej, i odpowiednią ilość niejonowego detergentu, np. polisorbatu lub poloksameru, ewentualnie zawierając środek konserwujący, i ewentualnie zawierającej środek dla dobrania toniczności, i ewentualnie dobrania ph do wartości od 6,0 do 8,8; przy czym odpowiednią ilością niejonowego detergentu jest taka, która daje ilość niejonowego detergentu sięgającą od 0,01 do 10 mg na mg GH. W dalszym aspekcie wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania preparatu farmaceutycznego obejmującego hormon wzrostu, lub pochodną hormonu wzrostu, i aminokwas wybrany z grupy obejmującej: Asp, Ile, Val, Leu, His i pochodną histydyny, lub peptyd obejmujący co najmniej jedną zasadową resztę aminokwasową i co najmniej jedną kwasową resztę aminokwasową i niejonowy detergent, obejmującego rozpuszczanie takiej ilości hormonu wzrostu, lub pochodnej hormonu wzrostu, że ilość peptydu, lub Asp, Ile, Val, Leu lub His, lub pochodnej histydyny sięga od 0,05 do 0,5 mg na mg GH, w roztworze obejmującym aminokwas wybrany z gnipy obejmującej: Asp, Ile, Val, Leu, His i pochodną histydyny, lub peptyd obejmujący co najmniej jedną zasadową resztę aminokwasową i co najmniej jedna kwasową resztę aminokwasową, i takiej ilości niejonowego detergentu, np. polisorbatu lub poloksameru, że ilość niejonowego detergentu wynosi od 0,1 do 2 mg na mg GH, w wodzie demineralizowanej, ewentualnie zawierającej środek konserwujący, i ewentualnie zawierającej środek dla dobrania toniczności, i ewentualnie dobrania ph do wartości od 6,0 do 8,8. W dalszym aspekcie wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania preparatu farmaceutycznego obejmującego hormon wzrostu, lub pochodną hormonu wzrostu, i aminokwas wybrany z grupy obejmującej: Asp, Ile, Val, Leu, His i pochodną histydyny, lub peptyd obejmujący co najmniej jedną zasadową resztę aminokwasową i co najmniej jedną kwasową resztę aminokwasową i poloksamer, w której hormon wzrostu, lub pochodna hormonu wzrostu, jest rozpuszczona w roztworze obejmującym aminokwas wybrany z grupy obejmującej: Asp, Ile, Val, Leu, His i pochodną histydyny, lub peptyd obejmujący co najmniej jedną zasadową resztę aminokwasową i co najmniej jedną kwa sową resztę aminokwasową w wodzie demineralizowanej i poloksamer, ewentualnie zawierający środek konserwujący i ewentualnie zawierający środek dla dobrania toniczności i ewentualnie dobrania ph do wartości od 6,0 do 8,8. Stężenie aminokwasu wybranego z grupy obejmującej: Asp, Ile, Val, Leu, His i pochodną histydyny, lub peptydu obejmującego co najmniej jeden zasadowy aminokwas i co najmniej jeden kwasowy aminokwas wynosi korzystnie od około 1 mm do około 100 mm. Korzystniej, stężenie Asp, Ile, Val, Leu lub His, lub pochodnej histydyny, lub peptydu obejmującego co najmniej jeden zasadowy aminokwas i co najmniej jeden kwasowy aminokwas wynosi od 2 mm do 20 mm, korzystniej od 5 mm do 15 mm. Preparaty farmaceutyczne wynalazku mogą być sformułowane do podawania jakimkolwiek dogodnym sposobem, np. przez podawanie pozajelitowe lub doustne lub podawanie do błony śluzowej, np. podawanie donosowe. Preparat farmaceutyczny można wykonać w formie dawki zawartej w fiolce lub naboju lub jakiegokolwiek innego odpowiedniego pojemnika takiego jak uprzednio napełniona strzykawka lub urządzenie typu pióra.
188 222 9 Farmaceutyczny preparat według wynalazku może ponadto obejmować sole stosowane w typowym przypadku, aby ułatwić jego przetwarzanie, np. liofilizację lub rekonstytuowanie. Z punktu widzenia trwałości, ph roztworu korzystnie jest doprowadzone do wartości w przedziale od 6,0 do 8,8, w szczególności od 6,0 do 7,0, korzystniej od 6,0 do 6,8, jeszcze korzystniej od 6,0 to 6,3, a najkorzystniej od 6,0 do 6, 2 (np. 6, 1). ph może być dobrane przez dodanie kwasu, który nie wywiera ujemnego wpływu na hormon wzrostu, korzystnie fizjologicznie dopuszczalnego kwasu np. kwasu nieorganicznego takiego jak kwas solny, kwas siarkowy lub kwas azotowy lub kwasu organicznego takiego jak kwas octowy lub kwas cytrynowy. Preparat farmaceutyczny według wynalazku może ponadto obejmować sole dla dobrania toniczności i ewentualnie zaróbkę, aby ułatwić jej przetwarzanie, np. liofilizację oraz szybkie i zupełne rozpuszczenie liofilizowanej formulacji przy rekonstytuowaniu formulacji przed użyciem. Takie sole mogą być wybrane spośród typowych dodatków, takich jak sole metali alkalicznych, metali ziem alkalicznych lub soli amonowych kwasów organicznych, takich jak kwas cytrynowy, kwas winowy lub kwas octowy, np. cytrynian sodu, winian sodu lub octan sodu, lub kwasów nieorganicznych takich jak kwas solny, np. chlorek sodu. Zaróbka może być wybrana spośród disacharydów, takich jak laktoza, trehaloza i sacharoza, alkoholi cukrowych, takich jak mannitol, ksylitol, erytrytol, treitol, sorbitol lub gliceryna, polisacharydów, takich jak polimery dostępne handlowo jako produkty Dextran, takie jak Dextran 40, Dextran 70 lub Dextran 75, i Ficoll i wielowartościowe alkohole, takie jak glikol polietylenowy lub alkohol poliwinylowy łub kombinacja dwóch lub więcej spośród nich. W niniejszym kontekście hormon wzrostu lub GH może być hormonem wzrostu jakiegokolwiek pochodzenia, takiego jak ptasiego, bydlęcego, końskiego, ludzkiego, owczego, wieprzowego, łososiowego hormonu wzrostu, hormonu wzrostu z pstrąga lub tuńczyka, korzystnie bydlęcego, ludzkiego lub wieprzowego hormonu wzrostu, zwłaszcza ludzkiego hormonu wzrostu. Hormon wzrostu użyty zgodnie z wynalazkiem może być rodzimym hormonem wzrostu wyizolowanym z naturalnego źródła, np. przez wyekstrahowanie gruczołów przysadki w typowy sposób, lub hormonem wzrostu wytwarzanym przez techniki rekombinacyjne, np. jak opisano w: E.B. Jensen i S. Carlsen, Biotech and Bioeng., 36 1-11 (1990). Pochodna hormonu wzrostu może być okrojoną formą hormonu wzrostu, w której jedną lub więcej reszt aminokwasowych usunięto; jej analog, w której jedna lub więcej reszt aminokwasowych w rodzimej cząsteczce podstawiono przez inną resztę aminokwasową, korzystnie resztę naturalnie występującego amino kwasu, dopóki podstawienie nie wywiera niekorzystnego wpływu, takiego jak antygenowość lub obniżone działanie; lub jej pochodna, np. deamidowane lub sulfoksydowane formy hormonu wzrostu lub formy o rozszerzeniu N- lub C-końcowym, takim jak Met-hGH, Met-Glu-AIa-Glu-hGH lub Ala-Glu-hGH. Korzystnym hormonem wzrostu jest hgh. Hormon wzrostu może być koncentratem otrzymanym bezpośrednio z pożywki fermentacyjnej lub typowym preparatem liofilizowanym, który jest rozpuszczony w odpowiednim rozpuszczalniku. Termin pochodne histydyny stosuje się, w obecnym przypadku, do oznaczenia amidów i estrów histydyny, takich jak ester metylowy lub etylowy, dipeptydy, takie jak His-Gly, His-Ala, His-Leu, His-Lys, His-Ser, His-Phe, i dipeptydy, takie jak Ala-His, Gly-His, Val-His, Glu-His, Met-His, Arg-His, Asp-His, Leu-His, Ser-His i analogi lub pochodne His, takie jak imidazole, des-amino-his lub poli-his. W niniejszym kontekście niejonowy detergent lub niejonowy środek powierzchniowo czynny może oznaczać polisorbaty, takie jak polisorbat 20 lub 80, itp. i poloksamery, takie jak poloksamer 188 lub 407, alkohole wielowodorotlenowe Pluronic, i inne polimery etylen/polipropylen itp. Będą stosowane ilości skuteczne dla zapewnienia trwałego, wodnego preparatu, zwykle w zakresie od 0,01 do 10 mg detergentu na mg hormonu wzrostu, korzystnie od 0,05 do 5 mg detergentu na mg hormonu wzrostu, a zwłaszcza od 0,1 do 2 mg detergentu na mg hormonu wzrostu. Użycie niejonowych detergentów umożliwia poddawanie preparatu napięciu ścinającemu i powierzchniowemu bez wywołania denaturacji proteiny.
10 188 222 Ilość niejonowego detergentu w preparatach może być w zakresie od 0,01 do 10 mg detergentu na mg hormonu wzrostu, korzystnie od 0,05 do 5 mg detergentu na mg hormonu wzrostu, a zwłaszcza od 0,1 do 2 mg detergentu na mg hormonu wzrostu. W niniejszym kontekście disacharyd stosuje się do oznaczenia naturalnie występujących disacharydów, takich przy zamierzonym leczeniu. Zakres stężenia nie jest krytyczny dla wynalazku i może być zmieniany przez lekarza nadzorującego podawanie. Inny aspekt wynalazku dotyczy sposobu leczenia pacjenta, na którego działa hormon wzrostu obejmującego działanie na pacjenta ilością preparatu farmaceutycznego według wynalazku skutecznego do leczenia wspomnianych zaburzeń. Wynalazek objaśniono bardziej szczegółowo poprzez poniższe przykłady ilustrujące wynalazek. Nie są one zamierzone jako ograniczenie zakresu wynalazku określonego przez załączone zastrzeżenia. Część eksperymentalna Przykład 1: Inhibitowanieagregacji Ciekłe preparaty hgh wytworzono przez rozpuszczenie hgh w roztworze zarobek i dobranie ph przy użyciu HCl/NaOH. Skład preparatu był następujący: hgh 5,0 mg/ml Mannitol 45 mglml L-histydyna 0,62 mg/ml Fenol 2,5 mg/ml Środek powierzchniowo czynny x mg/ml ph = y (od 6,1 do 6,8) Wygląd roztworów zbadano wizualnie po przechowywaniu roztworów przez 1 dzień w 8 C i rotacji przez 19 h (20 obr./min) w 25 Ć, odpowiednio: Środek powierzchniowo czynny X (mg/ ml) PH (y) Wygląd po 1 dniu w 8 C - 0 6,1 Wytrącanie Wytrącanie - 0 6,3 Wytrącanie Dużo płatków - 0 6,5 Płatki Dużo płatków Wygląd po 19h rotacji - 0 6,8 Płatki Pewna liczba płatków Pluronic L64 0,5 6,8 Klarowny, mało płatków Dużo małych płatków Pluronic L64 1 6,8 Klarowny, mało płatków Klarowny, pewna liczba płatków Pluronic F68 2 6,1 Klarowny Klarowny, pewna liczba płatków Pluronic F68 2 6,3 Klarowny Klarowny, mała liczba płatków Pluronic F68 2 6,5 Klarowny Klarowny, mała liczba płatków Pluronic F68 2 6,8 Klarowny Klarowny, pewna liczba płatków Lutrol F I27 1 6,1 Klarowny Klarowny, pewna liczba płatków Lutrol F I27 1 6,3 Klarowny Klarowny, pewna liczba płatków Lutrol F I27 1 6,5 Klarowny Klarowny, mała liczba płatków Lutrol F I27 1 13,8 Klarowny Nie analizowano Tween 20 2 6,1 Nieznaczne wytrącanie Dość klarowny, pewna liczba płatków Tween 20 2 6,3 Klarowny Klarowny, pewna liczba płatków Tween 20 2 6,5 Klarowny, pewna liczba płatków Klarowny, mała liczba płatków Tween 20 2 6,8 Klarowny Klarowny, pewna liczba płatków
188 222 11 Przykład2: Szybkość deamidowania Osiem podanych niżej preparatów wytworzono przez doda nie hgh do roztworu zawierającego zarobki. ph doprowadzono do 6,1. Preparaty następnie umieszczono na 28 dni w 25 C i na 14 dni w 37 C i poddano analizie na tworzenie deamidowanych form hgh. Stale szybkości deamidowania obliczono na podstawie danych trwałości. W tabeli poniżej zawartość hgh i zarobki podano w mg/ml a szybkości reakcji k25 c i k37 c podano w dniach -1. HGh Fenol Pluronic F68 Lutrom F127 L-histydyna Wodorocytrynian disodowy Mannitol Na-Cl k25 C k37 C 5 2,5 2 0,62 45 0,00180 0,00860 6,7 2,5 2 2,2 45 0,00221 0,0127 6,7 2,5 2 0,62 5,8 0,00244 0,0110 6,7 2,5 2 2,2 5,8 0,00263 0,0143 5 2,5 1 0,62 45 0,00178 0,00914 6,7 2,5 1 2,2 45 0,00221 0,0128 6,7 2,5 1 0,62 5,8 0,00236 0,0112 6,7 2,5 1 2,2 5,8 0,00259 0,0139 Przykład 3: Tworzenie form deamidowanych Podane niżej preparaty wytworzono przez dodanie hgh do roztworu zawierającego zarobki i dobranie ph. Następnie preparaty umieszczono na 3 miesiące w 8 C i 25 C i poddano analizie na tworzenie deamidowanych form hgh. HGH (mg/ml) Środek powierzchniowo czynny (mg/ml) Fenol (mg/ml) L-histydyna (mg/ml) Mannitol (mg/ml) PH t=0 Zawartość form deamidowanych 3 mieś. w 8 C 12 tyg. w 25 C 3 tyg. w 37 C 6,5 2(F68) 2,5 0,62 45 6,3 0,6 2,7 18.1 21,1 6,25 2(F68) 2,5 0,62 45 6,2 0,5 2,5 16,2 18,7 6,25 2(F68) 2,5 0,62 45 6,1 0,6 2,2 14,8 17,1 3,33 3(F68) 3,0 0,68 40 6,1 1,3 3,0 15,5 b.d. 6,67 3(F68) 3,0 0,68 40 6,1 1,0 3,2 16,6 b.d. 10,0 3(F68) 3,0 1,1 39 6,1 0,6 3,8 16,7 b.d. 6,25 1(L127) 2,5 0,62 45 6,1 0,6 2,5 15,4 18,2 6,25 2(T20) 2,5 0,62 45 6,1 0,6 b.d. b.d. 16,6 1) W nawiasach podano typ użytego środka powierzchniowo czynnego: F68 = Pluronic F68 = poloksamer 188 F 127 = Lutrol 127 = poloksamer 407 T20 = Tween 20 = polisorbat 20 Przykład 4: Z poniższej receptury wytworzono 24 preparaty: hgh = 3,33 do 13,1 mg/ml L-histydyna = 0,78 mg/ml Mannitol = 22 mg/ml
12 188 222 Sacharoza = 21 mg/ml Poloksamer 188 1,33-5,33 mg/ml Środek konserwujący: Benzyloalkohol (0-20 mg/ml) lub Fenol (0-5 mg/ml) Preparaty wytworzono przez dodanie hgh do roztworu zarobek. ph doprowadzono do 6,8. Preparaty utrzymywano w 25 C przez 4 tygodnie, a następnie zmierzono klarowność roztworów jako absorbancję przy 340 nm. Absorbancja przy 340 nm wskazuje stopień agregacji w roztworach. HGH (mg/ml) Poloksamer 188 (mg/ml) Alkohol benzylowy (mg/ml) Fenol (mg/ml) 0 15 18 20 2,5 5 3,33 1,33 0,009 0,019 0,045 0,016 0,015 0,020 6,67 2,66 0,046 0,022 0,041 1) 0,025 0,026 10,0 4,0 0,022 0,060 1) 1) 0,034 0,050 13,1 5,33 0,018 0,041 0,042 1) 0,054 0,071 1): Rozpuszczenie hgh niemożliwe. Odsyłacze literaturowe: 1. Y.-C. J. Wang i M. A. Hanson. Pozajelitowe Formulacje Protein i Peptydy: Trwałość i Stabilizatory. J. Parenteral Science and Technology 42 (Suppl.) (1988) 53-525. 2. M. C. Manning, K. Patel, R. T. Borchardt. Trwałość Proteinowych Środków Farmaceutycznych. Pharmaceutical Research 6 (11) (1989) 903-918. 3. B. A. Johnson, J. M. Shirokawa, W. S. Hancock, M. W. Spellman, L. J. Basa i D. W. Asward. J. Biol.Chem. 264,1462-71 (1989). 4. L. C. Teh et al J.Biol.Chem., 262, 785-794 (1987). 5. G. W. Becker et al.,biotech.appl.biochem. 10,326-337 (1988). 6. R. A. Houghten et al.,arch.biochem.biophys. 178, 350-355 (1977). 7. R. M. Riggin et al., Anal. Biochem., 167,199-209 (1987). 8. P. Gellerfors et al., Acta Paediatr. Scand (suppl), 370, 93-100 (1990). 9. M. J. Kaufman, Pharm. Res., 7 (3) 289-292 (1990). Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 4,00 zł.