RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 202590 (21) Numer zgłoszenia: 355683 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: 09.11.2001 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 09.11.2001, PCT/EP01/12982 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: 06.06.2002, WO02/44162 PCT Gazette nr 23/02 (51) Int.Cl. C07D 305/14 (2006.01) C07B 63/00 (2006.01) A61P 35/00 (2006.01) (54) Sposób chromatograficznego rozdzielania paclitaxelu i cefalomanniny (30) Pierwszeństwo: 28.11.2000,US,09/724504 (43) Zgłoszenie ogłoszono: 17.05.2004 BUP 10/04 (73) Uprawniony z patentu: INDENA S.p.A.,Mediolan,IT (72) Twórca(y) wynalazku: Bruno Gabetta,Mediolan,IT Gianfranco Zini,Mediolan,IT (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 31.07.2009 WUP 07/09 (74) Pełnomocnik: Barbara Bogdan, POLSERVICE, Kancelaria Rzeczników Patentowych Sp. z o.o. PL 202590 B1
2 PL 202 590 B1 Opis wynalazku Obszar wynalazku Niniejszy wynalazek ma na celu oddzielenie paclitaxelu od jego analogu, cefalomanniny, w wyciągach z roślin rodzaju Taxus lub w ich hodowlach komórkowych. W szczególności, paclitaxel oddziela się od cefalomanniny na drodze chromatografii w kolumnach z żelem krzemionkowym, z fazą bezpośrednią. Dotychczasowy stan techniki Paclitaxel, zwany również Taxol jest wyjątkowo obiecującym środkiem przeciwnowotworowym. Wydzielono go z kory Taxus brevifolia przez Wani i in. W 1971r. (J. Am. Chem. Soc. 93, 2325, 1971), a jego budowę określono stosując metody chemiczne i rentgenowską analizę krystalograficzną. Paclitaxel został zatwierdzony przez Food and Drug Administration do leczenia raka piersi i jajników, a obecnie trwają kliniczne wykorzystania go w leczeniu raka płuc i okrężnicy (na przykład, patrz W.P. Mc Guire i E.K. Rowinsky, Paclitaxel w leczeniu raka, M. Dekker, New York 1995, strony 1 do 337). Pierwotnym naturalnym źródłem paclitaxelu jest kora drzewa cisu pacyficznego Taxus brevifolia. Stwierdzono też, że paclitaxel występuje w nadziemnych częściach i korzeniach innych gatunków cisu, włącznie z cisem Europejskim (Taxus baccata), cisami Azjatyckimi (Taxus wallichiana i Taxus chinensis) i drzewami cisów hodowanymi dla celów ozdobnych (na przykład Taxus media). Sposób wydzielania paclitaxelu z dowolnego źródła naturalnego jest złożony i kosztowny, częściowo z powodu stosunkowo małych stężeń w materiałach roślinnych lecz także z powodu obecności jednej z jego substancji pokrewnych, cefalomanniny. Zawartości i stosunki pomiędzy paclitaxelem i cefalomanniną różnią się w materiałach roślinnych zależnie od gatunku i części rośliny, o których mowa. Stwierdzono, że zazwyczaj zawartość paclitaxelu i cefalomanniny mieści się w zakresie, odpowiednio od 0,001% do 0,08% i od 0,001% do 0,22%. (K.M. Witherup i inni, J.Nat. Prod., 55,432, 1992). W szczególności, gatunek Taxus media, stanowiący odnawialny materiał roślinny, jest najczęściej stosowanym surowcem do pozyskiwania paclitaxelu i zawiera średnio największe stężenie cefalomanniny w porównaniu z innymi gatunkami. Nawet techniki wytwarzania paclitaxelu oparte na hodowli komórek cisa, które ostatnio przyczyniły się znacząco do unikania typowej ekstrakcji kosztownego materiału roślinnego, dają znaczącą ilość cefalomanniny oprócz paclitaxelu. Jedyna różnica w budowie pomiędzy paclitaxelem i cefalomanniną dotyczy części bocznego łańcucha związku, co powoduje podobne właściwości chemiczne. Oba związki odznaczają się, więc bardzo podobnymi właściwościami chromatograficznymi i dokładne rozdzielenie tych pokrewnych związków jest trudne. Proponowano szereg metod chromatograficznych, opartych głównie na zastosowaniu chromatografii z fazą odwróconą lub kosztownych kolumn z fazą związaną (J.H. Cardellina, J. Liq. Chromatogr., 14, 659, 1991; S.L. Richheimer i in., Anal. Chem. 64, 2323, 1992; E.R.M. Wickremesinhe i in., J. Liq. Chromatogr., 16, 3263, 1993; K.M. Witherup i in., J. Liq. Chromatogr., 12, 2117, 1989), lecz tych metod nie można łatwo dostosować do operacji w dużej skali handlowej. Z tego
PL 202 590 B1 3 powodu, dostępność sposobów umożliwiających rozdzielanie paclitaxelu i cefalomanniny pozostaje celem o dużym znaczeniu praktycznym. W przeszłości, proponowano sposoby rozdzielania paclitaxelu i cefalomanniny oparte na różnej reaktywności tych związków wobec utleniaczy. Stwierdzono, że podwójne wiązanie olefinowe istniejące w tyglinowej reszcie cefalomanniny można utlenić w reakcji z tetratlenkiem osmu (D.G.I. Kingston i in., J. Nat. Prod., 55, 259 1992) lub ozonem (J. T. Beckvermit i in., J. Org. Chem., 61, 9038, 1996), podczas gdy paclitaxel nie ulega żadnemu chemicznemu przekształceniu podczas reakcji utleniania. Inny sposób polega na działaniu bromem na mieszaniny paclitaxelu i cefalomanniny (J.M. Rimoldi i in., J. Nat. Prod., 59, 167, 1996). Działanie bromem wykonywane w warunkach kontrolowanej temperatury i czasu reakcji powoduje powstanie dibromocefalomanniny, podczas gdy paclitaxel nie ulega działaniu tego chemicznego reagentu. Sposoby te jednak mają wadę w postaci stosowania takich toksycznych reagentów jak tetratlenek osmu i w każdym przypadku prowadzą do rozkładu lub przekształcenia cefalomanniny w jej pochodna, z których cefalomanninę można odzyskać przez trudne procesy syntetyczne. Istnieje, więc wciąż potrzeba niedrogiego, prostego, bezpiecznego i skutecznego oddzielania cefalomanniny od paclitaxelu. Zgodnie z powyższym, pierwszym celem niniejszego wynalazku jest przedstawienie prostego sposobu rozdzielania paclitaxelu i cefalomanniny z ich mieszanin lub wyciągów cisowych. Streszczenie wynalazku Niniejszy wynalazek przedstawia sposób oddzielania paclitaxelu od cefalomanniny i innych pokrewnych związków. W szczególności, sposób ten obejmuje otrzymanie materiału wyjściowego, który zawiera paclitaxel i cefalomanninę; rozpuszczenie materiału wyjściowego w dowolnym z szeregu szczególnie określonych rozpuszczalników tworząc mieszaninę; poddanie mieszaniny chromatografii kolumnowej otrzymując wymytą frakcję paclitaxelu, wymytą frakcję cefalomanniny i pozostałość; i oddzielnie suszenie frakcji paclitaxelu i frakcji cefalomanniny uzyskując odpowiednio oddzielne postacie krystaliczne paclitaxelu i cefalomanniny. Rozpuszczalnikiem jest korzystnie mrówczan butylu lub octan butylu lub benzylu. Szczegółowy opis wynalazku Nieoczekiwanie stwierdzono, że paclitaxel i cefalomanninę o dużej czystości można otrzymać z dużymi wydajnościami przez chromatograficzne rozdzielenie na jednej kolumnie z żelem krzemionkowym, z fazą bezpośrednią, stosując jeden rozpuszczalnik jako eluent. Korzystnie, rozpuszczalnik ten ma następujący wzór ogólny: w którym R 1 oznacza atom wodoru lub grupę metylową i R 2 zawiera korzystnie cztery atomy węgla, to jest może być grupą n-butylową, izobutylową, sec-butylową lub t-butylową. Tych rozpuszczalników nie stosuje się często w zwykłym oczyszczaniu chromatograficznym na kolumnie lecz zapewniają one nieoczekiwanie dobre wyniki praktyczne w szczególnym przypadku rozdzielania paclitaxelu i cefalomanniny. Materiałem wyjściowym w niniejszym wynalazku może być mieszanina tylko cefalomanniny i paclitaxelu w dowolnym stosunku lub wyciąg ze świeżych lub suszonych korzeni, liści, gałęzi, nasion Taxus lub ich mieszanin. Sposób według niniejszego wynalazku może też dotyczyć wyciągu otrzymanego z hodowli komórek cisu. Te materiały wyjściowe są na ogół znane zwykłemu specjaliście w tej dziedzinie techniki, a więc nie trzeba ich tutaj dalej omawiać. Wspomniany wyciąg może być surowy lub oczyszczony, ten ostatni poddawano działaniu typowych rozpuszczalników i wstępnemu chromatograficznemu oczyszczaniu. I znów, te techniki są dobrze znane specjalistom, a więc nie trzeba ich tutaj dalej omawiać. Materiał wyjściowy może być w postaci stałej, syropu lub półstałej substancji gumowatej, zależnie od warunków doświadczalnych zastosowanych do jego wytwarzania. Materiał można po prostu poddać chromatografii kolumnowej po jego rozpuszczeniu w jednym z opisanych tutaj rozpuszczalników. Chromatograficzne oczyszczanie według wynalazku przewiduje stosowanie prostego żelu krzemionkowego w fazie bezpośredniej w ilości około 50 do 100 części wagowych materiału wyjściowego, zależnie od jego składu.
4 PL 202 590 B1 Chromatografia kolumnowa z rozpuszczalnikami według wynalazku jest szybka, nie wymaga wysokich ciśnień i prowadzi się ją w zwykłych warunkach grawitacji. Tablica 1 przedstawia zachowanie się cefalomanniny i paclitaxelu podczas analizy chromatografii cienkowarstwowej przy stosowaniu płytek żelu krzemionkowego i serii rozpuszczalników według wynalazku, umożliwiającej zadawalające rozdzielenie dwóch związków. Tablica 1 - Wartości Rf dla paclitaxelu i cefalomanniny na płytkach żelu krzemionkowego Rozpuszczalnik R 1 R 2 Paclitaxel Cefalomannina Mrówczan n-butylu H n-c 4 H 9 0,17 0,12 Mrówczan i-butylu H i-c 4 H 9 0,20 0,15 Mrówczan t-butylu H t-c 4 H 9 0,20 0,13 Octan n-butylu CH 3 n-c 4 H 9 0,36 0,28 Octan s-butylu CH 3 s-c 4 H 9 0,35 0,24 Octan i-butylu CH 3 i-c 4 H 9 0,31 0,19 Octan t-butylu CH 3 t-c 4 H 9 0,19 0,09 Octan benzylu CH 3 PhCH 2 0,28 0,16 Zastosowanie rozpuszczalników opisanych w niniejszym wynalazku dla wydzielenia paclitaxelu i cefalomanniny przez chromatografię na kolumnie z żelem krzemionkowym, z fazą bezpośrednią, zapewnia szereg korzyści. Po pierwsze, chromatografia kolumnowa daje faktycznie paclitaxel pozbawiony cefalomanniny i odwrotnie, cefalomanninę prawie bez paclitaxelu. Po drugie, zastosowanie żelu krzemionkowego w fazie bezpośredniej daje znaczne korzyści ekonomiczne w porównaniu z zastosowaniem żeli krzemionkowych w fazie odwróconej, opisanych w powyższej literaturze i po trzecie, zastosowanie jednego rozpuszczalnika do wymywania z kolumny pozwala na jego błyskawiczny obieg bez uciekania się do destylacji frakcyjnej w operacjach związanych z ciągłymi procesami wytwarzania przemysłowego. Wszelkie inne składniki obecne w materiale wyjściowym razem z paclitaxelem i cefalomanniną zostają usunięte na drodze chromatograficznego oczyszczania. Wymyte frakcje odparowuje się do sucha pod próżnią, a pozostałości krystalizuje się przy pomocy odpowiedniego rozpuszczalnika otrzymując paclitaxel i cefalomanninę w pożądanej postaci krystalicznej. Sposób opisany w niniejszym wynalazku przedstawia proste rozwiązanie wytwarzania znaczących ilości paclitaxelu pozbawionego cefalomanniny przez zwiększenie wydajności otrzymywanych ilości i zapewnienie tańszego sposobu wytwarzania tego leku przeciwnowotworowego. P r z y k ł a d y Następujące przykłady objaśniają wynalazek lecz nie ograniczają go. P r z y k ł a d 1 Wydzielanie paclitaxelu z wyciągu Taxus media zawierającego cefalomanninę. 290 g wyciągu, wytworzonego z 620 kg Taxus media (cała roślina) zgodnie ze sposobem opisanym przez V. Senilh i in. (J. Nat. Prod. 47, 131, 1984), zawierało 183 g paclitaxelu i 81 g cefalomanniny, według analizy HPLC. Wyciąg rozpuszcza się w 3,5 l octanu t-butylu i umieszcza się w kolumnie zawierającej 60 kg żelu krzemionkowego. Łącznie wymyto 1200 l t-butylu. Otrzymuje się frakcję 400 l zawierającą paclitaxel i mniej niż 3% cefalomanniny i inną frakcję 200 1 zawierającą cefalomanninę i mniej niż 3% paclitaxelu, po wymywaniu 350 1 rozpuszczalnika. Dwie frakcje zatężano oddzielnie pod próżnią do sucha, a pozostałości krystalizowano przy pomocy heksanu-acetonu. 154 g paclitaxelu i 70 g cefalomanniny, otrzymane w ten sposób, miały czystość HPLC ponad 99%, a ich zawartości fizykochemiczne i spektroskopowe były zgodne z informacjami z literatury (G.N. Chmurny i in., J. Nat. Prod. 55, 414, 1992; C.J. Falzone i in., Tetrahedron Letters, 33, 1169, 1992; V. Senilh i in. J. Nat. Prod. 47, 131, 1984). P r z y k ł a d 2 Wydzielanie paclitaxelu i cefalomanniny z mieszaniny zawierającej oba związki. Mieszaninę zawierającą 70 g paclitaxelu i 30 g cefalomanniny rozpuszcza się w 1,5 l mrówczanu t-butylu i umieszcza w kolumnie zawierającej 10 kg żelu krzemionkowego zawieszonego w takim samym rozpuszczalniku. Kolumnę wymywa się mrówczanem t-butylu, a frakcje łączy po analizie HPLC/TLC. Frakcje zawierające paclitaxel i cefalomanninę zatęża się do sucha oddzielnie, a pozostałości krystalizuje z acetonu i heptanu w odpowiednich stosunkach otrzymując paclitaxel i cefalomanninę o czystości HPLC ponad 99%.
PL 202 590 B1 5 Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób chromatograficznego oddzielania paclitaxelu od cefalomanniny, znamienny tym, że obejmuje: otrzymanie materiału wyjściowego zawierającego paclitaxel i cefalomanninę; rozpuszczanie materiału wyjściowego w rozpuszczalniku o wzorze ogólnym: w którym R 1 oznacza atom wodoru lub grupę metylową i R 2 oznacza grupę alkilową lub aryloalkilową zawierającą cztery do siedmiu atomów węgla, tworząc mieszaninę; poddawanie mieszaniny chromatografii kolumnowej otrzymując wymytą frakcję paclitaxelu, wymytą frakcję cefalomanniny i pozostałość; i oddzielne suszenie frakcji paclitaxelu i cefalomanniny otrzymując oddzielne postacie krystaliczne, odpowiednio paclitaxelu i cefalomanniny. 2. Sposób według zastrzeżenia 1, znamienny tym, że poddaje się mieszaninę chromatografii kolumnowej stosując kolumnę z żelem krzemionkowym w fazie bezpośredniej z użyciem pojedynczego rozpuszczalnika o wzorze podanym powyżej, jako eluentu. 3. Sposób według zastrzeżenia 1, albo 2, znamienny tym, że wymieniony materiał wyjściowy zawiera dowolny stosunek cefalomanniny i paclitaxelu. 4. Sposób według zastrzeżenia 1, albo 2, znamienny tym, że wymieniony materiał wyjściowy jest wyciągiem ze świeżych lub suchych korzeni, liści, gałęzi, nasion Taxus lub ich mieszanin. 5. Sposób według zastrzeżenia 1, albo 2, znamienny tym, że wymieniony materiał wyjściowy jest wyciągiem otrzymanym z hodowli komórek materiału Taxus. 6. Sposób według zastrzeżenia 1, albo 2, znamienny tym, że materiał wyjściowy jest w postaci stałej, syropu lub półstałego materiału gumowatego. 7. Sposób według zastrzeżenia 1, albo 2, znamienny tym, że budowa rozpuszczalnika obejmuje R 1 jako atom wodoru lub grupę metylową i R 2 jako grupę n-butylową, izobutylową, sec-butylową lub t-butylową. 8. Sposób według zastrzeżenia 2, znamienny tym, że żel krzemionkowy stosuje się w ilości około 50 do 100 części wagowych materiału wyjściowego.
6 PL 202 590 B1 Departament Wydawnictw UP RP Cena 2,00 zł.