Utlenianie glukozy z udziałem komórek drożdży Instrukcja do zajęć laboratoryjnych z przedmiotu Biotechnologia Dla studentów kierunku Chemia specjalność Chemia Bioorganiczna Materiały zostały wykonane w ramach realizowanego na Politechnice Śląskiej projektu nr UDA-POKL.04.01.01-00-114/09-01 pt.: Unowocześnienie i rozszerzenie oferty edukacyjnej na kierunku Chemia na Wydziale Chemicznym Politechniki Śląskiej otwarcie specjalności Chemia Bioorganiczna współfinansowanego ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego.
CEL ĆWICZENIA Celem ćwiczenia jest: Zapoznanie się z hodowlą drożdży w bioreaktorze, Zapoznanie się z procesem utleniania glukozy i innych cukrów, w obecności enzymów z drożdży dostępnych handlowo oraz hodowanych w warunkach laboratoryjnych (Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis ) oraz ich ilościowym oznaczeniem. PODSTAWY TEORETYCZNE Każda komórka dąży do wytworzenia potrzebnej do życia energii. Jedną z form pozyskania tej energii jest oddychanie komórkowe. Proces ten rozpoczyna się glikolizą, czyli przekształceniem monosacharydów w kwas pirogronowy. Schemat 1 Pierwsza faza glikolizy (Schemat 1) wymaga dostarczenia energii przez komórkę w postaci 2 cząsteczek ATP. Glukoza, która trafia do cytoplazmy zostaje wychwycona przez enzym zwany heksokinazą i ulega fosforylacji dzięki pierwszej cząsteczce ATP. Powstały glukozo-6-fosforan izomeryzuje do fruktozo-6-fosforanu dzięki izomerazie fosfoglukozowej. Pierścień piranozowy otwiera się do formy łańcuchowej, następuje izomeryzacja grupy karbonylowej z atomu C-1 do atomu C-2, aby ostatecznie ulec cyklizacji do formy furanozowej. W ostatnim etapie pierwszej fazy glikolizy druga cząsteczka ATP przy obecności enzymu fosfofruktokinazy fosforyluje fruktozo-6-fosforan do fruktozo-1,6-bisfosforanu. W drugiej fazie glikolizy (Schemat 2) szcześciowęglowy fruktozo-1,,6-bisfosforan ulega lizie na dwa produkty trójwęglowe: fosfodihydroksyaceton i aldehyd 3-fosfoglicerynowy które pozostają ze sobą w równowadze chemicznej. Reakcję tą katalizuje enzym aldolaza. 1
Schemat 2 Bezpośrednio do kolejnego etapu glikolizy wchodzi jedynie aldehyd 3-fosfoglicerynowy, którego jest znacznie mniej niż fosfodihydroksyacetonu. Równowaga reakcji katalizowanej przez izomerazę triozofosforanową jest mocno przesunięta w stronę fosfodihydroksyacetonu, jednak na skutek biegnącej reakcji aldehydu do 1,3- bisfosfoglicerynianu obie cząsteczki trójwęglowe zostają wykorzystane w kolejnych etapach glikolizy. Trzecia faza glikolizy (Schemat 2) to odzyskiwanie energii włożonej przez komórkę w proces w pierwszej fazie (Schemat 1). Cząsteczka aldehydu 3-fosfoglicerynowego pod wpływem dehydrogenazy ulega przekształceniu w 1,3-bisfosfoglicerynian. W rzeczywistości etap ten zachodzi dwustopniowo: utlenianie pod wpływem NAD+ oraz fosforylacja grupy karbonylowej. W kolejnym etapie komórka odzyskuje dwie cząsteczki ATP dzięki kinazie fosfoglicerynianowej. Każda z dwóch powstałych cząsteczek 1,3-bisfosfoglicerynianiu oddaje resztę fosforanową ADP. Grupa fosforanowa w powstałym 3-fosfoglicerynianie zostaje przeniesiona na atom C-2 pod wpływem fosfogliceromutazy i powstaje 2-fosfoglicerynian. 2
Następnie pod wpływem enzymu enolazy zachodzi dehydratacja i utworzenie enolu (fosfoenolopirogronianu), który jest niezwykle stabilny w tej formie dzięki grupie fosforanowej. Ostatni etap trzeciej fazy glikolizy to przeniesienie grupy fosforanowej z enolu na cząsteczkę ADP. Ponieważ nadal mamy do czynienia z dwoma takimi samymi cząsteczkami uzyskanymi z jednej cząsteczki glukozy, ogólny zysk energetyczny całego szlaku metabolicznego glikolizy to dwie cząsteczki ATP. Uzyskana forma enolowa pirogronianiu przekształca się w bardziej trwałą formę ketonową. Tak otrzymany kwas pirogronowy w procesie glikolizy może ulec 3 różnym przemianą zgodnie ze Schematem 3: Schemat 3 Pierwszy możliwy szlak przemian to tlenowy proces spalania substancji organicznej zachodzący w mitochondriach komórkowych. Proces uzyskiwania energii może również zachodzić beztlenowo. Pirogronian może przekształcić się w mleczan lub alkohol etylowy. Pierwszy przypadek dotyczy zarówno bakterii jak i przekształcania glukozy w mięśniach, gdy zabraknie tlenu w komórkach podczas wysiłku fizycznego. Drugi związany jest z metabolizmem mikroorganizmów głównie drożdży, ale i niektórych bakterii.[2] Każdy organizm dąży do regeneracji cząsteczki NAD+, aby cykl glikolizy mógł się powtarzać (Schemat 4). Fermentacja alkoholowa jest jedną z metod beztlenowej regeneracji tego koenzymu. Schemat 4 3
Powstały w procesie glikolizy pirogronian ulega dekarboksylacji pod wpływem działania odpowiedniego enzymu, zwanego dekarboksylazą piogronianową. Powstały aldehyd octowy ulega następnie redukcji do etanolu, dzięki czemu odtwarza się koenzym NAD+. Ostatni etap jest katalizowany przez dehydrogenazę alkoholową. Drożdże w podczas dostępu tlenu prowadzą tlenowy proces spalania substancji organicznych (cukrów). Dopiero kiedy w roztworze zabraknie tlenu całkowicie przekształcają formę zdobywania energii na proces beztlenowy, czyli fermentację alkoholową. Stężenie cukru w roztworze można oznaczyć: metodą Somogyi i Nelsona wykorzystującej, właściwości redukujące sacharydów, które w środowisku zasadowym redukują jony miedzi(ii) do jonów miedzi(i) w obecności winianu sodowo-potasowego (odczynnik Somogyi) z wytworzeniem tlenku miedzi CuO (ceglasty osad). W momencie dodania kwasu arsenomolibdenowego (odczynnik Nelsona) do powstałego tlenku miedzi obserwuje się redukcję tego kwasu co objawia się kolorem błękitnym, intensywność barwy można zmierzyć w zakresie długości fali od 500-620 nm i jest ona proporcjonalna do ilości cukrów redukujących, metodą polegającą w oparciu o pomiar intensywności zabarwienia alkalicznego roztworu heksacyjanożelazianu(iii) potasu, cukry redukujące reagują z alkalicznym roztworem heksacyjanożelazianu(iii) potasu (barwa intensywnie żółta) który przeprowadzany jest w bezbarwny heksacyjanożelazian(ii) potasu, metodą Bernfelda, w której kwasem 3,5-dinitrosalicylowym utlenianiane są grupy redukujące. Grupa 3-nitrowa soli sodowej kwasu 3,5-dinitrosalicylowego (DNS) zostaje zredukowana w środowisku zasadowym do grupy aminowej, w wyniku czego pojawia się pomarańczowe zabarwienie roztworu, który silnie absorbuje światło przy długości fali 530 nm. Intensywność barwy jest pochodną ilości cukrów. Drożdże są istotnym źródłem enzymów i mają szerokie zastosowanie w przemyśle spożywczym i farmaceutycznym. W celu zwiększenia produkcji enzymów przez drożdże zazwyczaj dodaje się do pożywki hodowlanej wodorofosforan amonu, siarczan amonu lub siarczan potasu. Enzymy drożdży wykazują najwyższą aktywność w środowisku obojętnym i lekko kwaśnym (ph=4 7.3). Optymalna temperatura działania zależy od konkretnego szczepu drożdży. Enzymy drożdżowe aktywne są w szerokim zakresie temperaturowym od 40 C do 85 C. Obecność jonów metali jedno- i dwuwartościowych wpływa na stabilizację ich struktury i aktywność (enzymy drożdży Kluyveromyces lactis i Kluyveromyces fragilis są silnie aktywowane przez jony manganu i kobaltu). Biokatalizatory z drożdży wykazują szeroki zakres działania. 4
PRZEBIEG ĆWICZENIA Utlenianie glukozy i innych cukrów z udziałem komórek drożdży Odczynniki: Pepton, Kwas bursztynowy, Chlorek wapnia, Wodorofosforan dipotasu, Siarczan amonu, Siarczan magnezu, Laktoza, 0,5% roztwór środka powierzchniowo-czynnego Triton X-100, Drożdże piwne, piekarskie, winne, hodowane w warunkach laboratoryjnych, 0,1 M NaHCO 3, Chloroform, 0,1 M r-ry glukozy, galaktozy, maltozy, sacharozy, 0,1 M Bufor fosforanowy ph = 7, 2mM r-ry glukozy, galaktozy, maltozy, sacharozy, Odczynnik miedziowy, Odczynnik arsenomolibdenowy, Heksacyjanożelazian(III) potasu, Roztwór siarczanu cynku, Roztwór jodku potasu, 0,1M Tiosiarczan sodu. Szkło i inne materiały oraz potrzebny sprzęt laboratoryjny: Kolba stożkowa 1l, Kolby płaskodenne 100ml, Biureta, Probówki wirówkowe, Probówki szklane, Wirówka, Pipety automatyczne, Spektofotometr UV/VIS, Łaźnia wodna, Mieszadło magnetyczne, Bioreaktor. 5
Wykonanie ćwiczenia 1. Hodowla drożdży Tabela 1. Skład pożywki Lp. Składnik Masa [g/l] 1. Ekstrakt drożdżowy 2,5 2. Pepton 5,0 3. Kwas bursztynowy (CH 2 COOH) 2 6,0 4. Chlorek wapnia CaCl 2 0,3 5. Wodorofosforan dipotasu K 2 HPO 4 8,7 6. Siarczan amonu (NH 4 ) 2 SO 4 4,0 7. Siarczan magnezu MgSO 4 0,5 8. Laktoza C 12 H 22 O 11 20 Do kolby stożkowej o pojemności 1000 ml dodać składniki pożywki (patrz Tabela 1) i 1000 ml wody destylowanej. Następnie sterylizować pożywkę i elementy aparatury bioreaktora w temperaturze 121 C przez 30 minut. Ostudzoną pożywkę przelać do szklanego zbiornika bioreaktora. Do szklanej probówki zawierającej skos agarowy z wyhodowanymi drożdżami dodać 8 ml 0,5% roztworu środka powierzchniowo-czynnego Triton X-100. Roztwór drożdży wprowadzić do zbiornika bioreaktora. Hodowlę drożdży prowadzić przez 24 h w bioreaktorze BIOSTAT B PLUS w odpowiednio ustalonych warunkach (Tabela 2). Tabela 2. Warunki fermentacji w bioreaktorze Parametr Ustalona wartość Temperatura 30 C ph 6.7 Obroty mieszadła 400 obr/min Natlenienie 24% Koncentrację drożdży sprawdzić na podstawie pomiaru absorbcji przy długości fali λ=650 nm. Po zakończonej hodowli otrzymane roztwory zwirować (6000 obr/min, 10 min, 40 C) w celu uzyskania osadu drożdży. 2. Liza komórek 2.5g osadu drożdży ( zwykłe ) zawiesić w 15ml 0,1M NaHCO 3 i sonifikować w łaźni ultradźwiękowej w temperaturze do 50 C przez 30 min. Zawiesinę odwirować przez 60min. przy 18 000 x g. 2.5g osadu drożdży (hodowlane) zawiesić w 15ml chloroformu i mieszać na mieszadle magnetycznym przez 30min. Zawiesinę odwirować przez 60min. przy 18 000 x g. 3. Przygotowanie mieszanin do analizy Przygotować 10 probówek ponumerowanych kolejno i napełnić je 1ml buforu oraz 1ml ekstraktu drożdżowego. Umieścić w łaźni wodnej ogrzanej do temperatury 40 C i po 10 minutach dodawać po kolei do nich w przerwach 45 sekundowych 1 ml 0,1M cukru. Mieszaniny inkubować przez 20 min. 6
Po 20 min. inkubacji przenieść (również w odstępach 45 sekund) mieszaniny do wrzącej łaźni wodnej w celu denaturacji białka a następnie odwirować je przez 20 min. przy 5 tyś. obrotów/min. Analiza 0,1M Bufor fosforanowy ph = 7 0,1 M Cukru Ekstrakt drożdżowy 1. Analiza z cukrem 2. Analiza z ekstraktem 3. Analiza badana 1ml 1ml - 1ml - 1ml 1ml 1ml 1ml 4. Oznaczanie cukrów redukujących metodą Somogyi-Nelsona Przenieść po 0,5 ml supertanantu, otrzymanego po odwirowaniu roztworów z probówek wirówkowych, do wcześniej przygotowanych czystych probówek. Do probówki oznaczonej jako próba zerowa odmierzyć 0,5 ml wody destylowanej, a do probówki oznaczonej jako wzorzec cukru odmierzyć 0,5 ml roztworu wzorcowego cukru o stężeniu 2 mm. Do wszystkich probówek dodać 0,5 ml odczynnika miedziowego, zamieszać i ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez 15 min., a następnie ochłodzić i dodać po 0,5 ml odczynnika arsenomolibdenowego i wymieszać. Każdą próbkę rozcieńczyć przez dodanie 1ml wody destylowanej i po wymieszaniu zmierzyć absorbancję przy długości fali 660nm wobec próby ślepej. Sporządzić również wykres krzywej wzorcowej dla ilościowego oznaczania cukru. 5. Oznaczanie cukrów redukujących roztworem heksacyjanożelazianu(iii) potasu Przenieść po 0,5 ml supertanantu, otrzymanego po odwirowaniu roztworów z probówek wirówkowych, do wcześniej przygotowanych czystych kolb na 100ml. Następnie do kolb dodać 15ml roztworu heksacyjanożelazianu(iii) potasu, zatkać korkami, i umieścić we wrzącej łaźni wodnej ogrzewając przez 15 min. Kolby ochłodzić w zimnej wodzie, dodać 45ml roztworu siarczanu cynku a następnie po wymieszaniu dodać 10ml roztworu jodku potasu. Wydzielony jod zmiareczkować 0.1M tiosiarczanem sodu. Jednocześnie wykonać próbę zerową. Ilość grup aldehydowych w danej objętości próbki można obliczyć ze wzoru: R=[(V 0 -V A ) * C M *10]/V P V 0 objętość tiosiarczanu z miareczkowania próby ślepej, V A - objętość tiosiarczanu z miareczkowania próby analizowanej, C M stężenie molowe tiosiarczanu sodu, V P objętość próbki. 7
PRZYGOTOWANIE DO ZAJĘĆ 1. Przeczytaj uważnie instrukcję i dokładnie przeanalizuj czynności oraz techniki laboratoryjne opisane w części eksperymentalnej. Powtórz metodę sporządzania krzywej wzorcowej i oznaczania stężenia za jej pomocą. 2. Zapoznaj się z zagrożeniami związanymi z stosowanymi odczynnikami oraz poszczególnymi czynnościami wykonywanymi na zajęciach (karty charakterystyk). 3. Zwróć uwagę czy znasz następujące pojęcia: enzym, bioreaktor, reakcja enzymatyczna, reakcje utleniania-redukcji, prawo Lamberta-Beera, liczba redukcyjna, absorbancja. OPRACOWANIE WYNIKÓW W celu opracowania sprawozdania należy: a) Na podstawie zmierzonej wartości absorbancji roztworu wzorcowego cukru obliczyć stężenie cukru w badanych mieszaninach. b) Określić ilość grup aldehydowych w analizowanych mieszaninach. c) Jakie mogą wystąpić różnice w reakcji stosując jako substrat cukier prosty i disacharyd. d) Czy występują różnice między drożdżami zwykłymi a hodowlanymi. e) Sformułować obserwacje wynikające z przeprowadzonych doświadczeń. LITERATURA L. Kłyszejko-Stefanowicz, Ćwiczenia z Biochemii, PWN, Warszawa (1999) F. Nowotny, Biochemia węglowodanów, PWRiL, Warszawa (1968) Mohd R.Y., Saroj M., Subhash Ch., ß-Glucosidase catalyzed synthesis of octyl-ß-dglucopyranoside using whole cells of Pichia etchellsii in micro aqueous media, Journal of Biotechnology, 2010, 150, 490-496 L.Włodek, Biochemia, Ćwiczenia praktyczne dla studentów wydziału farmaceutycznego, Wydawnictwo Uniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków (2000) B. Filipowicz, W. Ostrowski, Ćwiczenia z chemii ogólnej i fizjologicznej, PZWL, Warszawa (1983) R. Dylewski, Technologia chemiczna-surowce, WPŚl., Gliwice (1997) S. M. Roberts, K. Wiggins, G. Casy, S. Phythian, C. Todd, Preparative Biotransformations Whole Cell and Isolated Enzymes in Organic Synthesis, John Wiley & Sons., (1996) J. M. Berg, J.L. Tymoczko, L. Stryer, Biochemia, PWN, Warszawa (2005) R.K. Murray, D.K. Granner, P.A. Mayes, V.W. Rodwell, Biochemia Harpera, PZWL, Warszawa (2012) K. Drauz, H. Waldman, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis, Weinheim: Wiley-VCH. (1995), U. T. Bornscheuer, R.J. Kazlauskas, Hydrolases in Organic Chemistry, Weinheim: Wiley-VCH. (1999). 8