MAGNETYZNY REZONANS JĄDROWY WODORU 1 NMR, ( 2 NMR, 3 NMR) Trzy aktywne izotopy wodoru: 1 99.98% spin ½ 500.000 Mz (11.744 T) 2 0.02% spin 1 76.753 Mz (11.744 T) 3 0 spin ½ 533.317 Mz (11.744 T)
Przykładowe widmo 1 NMR wykonane w roztworze: Widmo protonowe, 1 NMR ( 1 MRJ): Położenie sygnałów (przesunięcie chemiczne, ppm) Wzorzec: tetrametylosilan, Si( 3 ) 4 0 ppm Typowy zakres przesunięć chemicznych: 0 15 ppm Struktura sygnałów (krotność lub multipletowość, sprzężenie spin-spin) Intensywność sygnałów, intensywność integralna ( całka ) Skala ( przesunięć chemicznych ), skala = 10 -
Równocenność (nierównocenność) atomów: równocenność/nierównocenność chemiczna równocenność/nierównocenność magnetyczna Ilość nierównocennych chemicznie atomów (grup atomów) = ilość sygnałów Nierównocenne atomy (grupy atomów) oznacza się różnymi literami alfabetu Duża różnica przesunięć chemicznych = litery odległe w alfabecie Przykłady: układ AB układ AMX układ A 3 X 2 FAZA IEKŁA ILOŚĆ SYGNAŁÓW Protony (grupy protonów) homotopowe = równocenne chemicznie Protony (grupy protonów) enancjotopowe = równocenne chemicznie Protony (grupy protonów) diastereotopowe = nierównocenne chemicznie Metody spektroskopowe i ich zastosowania do identyfikacji związków organicznych Praca zbiorowa pod redakcją W. Zielińskiego i A. Rajcy, Wydawnictwa Naukowo-Techniczne, Warszawa, 2000 Spektroskopowe metody identyfikacji związków organicznych R.M.Silverstein, F.X.Webster, D.J.Kiemle, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2007
Równocenność / nierównocenność chemiczna atomów l l Br F Br R* równocenne chemicznie (homotopowe) nierównocenne chemicznie (diastereotopowe) równocenne chemicznie (enancjotopowe) nierównocenne chemicznie (!) l Br ax Br eq???
Równocenność / nierównocenność chemiczna atomów Br 2 l 3 Br 2 l 2 R FBrl 2 R l Br l Br l R Br l Br Br Br R Br F R Układ A 3 (A 2 B??) Układ A 2 Układ A 2 (AB??) Układ AB!! Atomy wodorów w grupach 3 i 2 w związkach łańcuchowych są chemicznie równocenne ( uśrednienie przesunięć chemicznych) Wyjątek: centrum chiralne obok grupy!!! Spektroskopia MRJ w fazie ciekłej, w achiralnym środowisku, nie rozróżnia enancjomerów, a rozróżnia diastereoizomery. (R)(S) = (S)(R), (R)(R) = (S)(S), (R)(S) (S)(S),...
Równocenność / nierównocenność chemiczna atomów l l równocenne (układ A 2 ) l Br nierównocenne (układ AB lub AX) N OR 3 3 Ukryte wiązanie podwójne N O N 3 3 O N 3 3 O R2 N R1 O R1 N R2 R X Y R
Rozpuszczalniki stosowane w 1 NMR Aceton-d 6 2.2 ppm Acetonitryl-d 3 2.0 ppm Benzen-d 6 7.4 ppm hlorek metylenu-d 2 5.3 ppm hloroform-d 7.3 ppm Dimetyloformamid-d 6 (DMF) 2.9 ppm, 8.0 ppm Dimetylosulfotlenek-d 6 (DMSO) 2.6 ppm Metanol-d 4 3.5 ppm Woda (D 2 O) 4.8 ppm (Wg materiałów firmy BRUKER) 3 3 3 Si 3 Wzorzec: tetrametylosilan (TMS), ( 3 ) 4 Si DSS Wzorzec zewnętrzny (external reference) Wzorzec wewnętrzny (internal reference) Wzorzec wtórny (secondary reference) 0.00 ppm 0.015 ppm TMS 3 3 3 Si 2 2 2 SO 3 Na DSS
Kilka przesunięć chemicznych 1 NMR (ppm) Elektroujemność podstawnika: 3-0.23 F 3 -F 4.26 3 -l 3.05 3 -Br 2.68 3 -I 2.16 3 -O 3 3.24 3 -N( 3 ) 2 2.12 3 -S 3 2.08 3 -Li -1.30 ( 3 ) 4 Si 0.00 Rząd wiązania: 3 3 0.86 2 2 5.32 1.49 6 6 7.40 Ilość grup metylowych: 4 0.23 3 3 0.86 3 2 3 1.33 3 2 ( 3 ) 2 1.47 Ilość heteroatomów: 4 0.23 3 l 3.05 2 l 2 5.35 l 3 7.24 Atom wodoru przy heteroatomie: O (alif.) 1 5 O (Ar) 4 10 O (kwas) 9 12 S 3 4 N 2 3 5
Kilka przesunięć chemicznych 1 NMR (ppm) 7.3 7.6 7.3 X 6.5-8.2 N 8.6 6.8-7.6 7.0-7.5 1.9 4.8 O 3.8 O 6.2 O 6.3 7.4 2-0.5 9.3 11-14 7.3 7.0 N N N N 10-11 - 4 N ca. 8 6.1 6.6-3.0 4-7 18 elektronów 20 elektronów haitanya S.Wannere, Paul von Ragué Schleyer, Organic Letters, 2003, 5(5), 605
Zmiany przesunięcia chemicznego 1 NMR wywołane metalem przejściowym: do ± 600 ppm l N N Fe 3+ N N 1 NMR (Dl 3 ) protony pirolowe: 78.5 81.1 ppm proton mezo: -72.4 ppm protony Ar: 5.1 13.5 ppm (J.Wojaczyński, Praca Doktorska, Wrocław, 1998)
Sprzężenie pośrednie (skalarne) J sprzężenie geminalne 2 J gem sprzężenie wicynalne 3 J vic sprzężenie dalekiego zasięgu n J 2 J gem 2 J( 1-1 ) 1 J( 13-1 ) 3 J(5-6) Stała sprzężenia J ma znak Określenie znaku stałej sprzężenia wymaga dodatkowych eksperymentów Nazwy sprzężeń dotyczą dwóch dowolnych jąder, nie tylko protonów Sprzężenia pomiędzy jądrami równocennymi chemicznie nie wpływają na strukturę multipletów (w widmach I rzędu!!)
Geminalna stała sprzężenia 2 J gem (atom sp 3 ) 2 J gem = (+ 6) (- 20) z (- 12) (- 14) 4-12.4 (- 11) (- 18) 3 N N 2 N -16.9-20.3 X (- 3) (- 9) (+ 6) (- 1.4) - 12.9-11.2 O O -6.1 (X = NR, J 0 z)
Geminalna stała sprzężenia 2 J gem (atom sp 2 ) R X X = F - 3.2 N 2 0 + 2.5 Li + 7.1 3 R O O N 3 +42 9.0 15.8 7 17
Nietypowe sprzężenia 2 J( 1, 1 ) w wodorkach niektórych metali Me Me + + Me Ph 3 P Me Ir Me Ph 3 P Ir 2 J(,) = 36.6 z (125 K) 99.0 z (201 K) 2 J(,) = 160 z (125 K) 533 z (201 K) Quantum Mechanical Exchange oupling M.einekey, A.inkle, J.lose, J. Am. hem. Soc., 1996, 118, 5353
Wicynalna stała sprzężenia 3 J vic Zależność Karplusa 3 J = 8.5 cos 2 0.3 (0 90 o ) 3 J = 9.5 cos 2 0.3 (90 180 o ) 3 J [z] 10 5 0 0 50 100 150 kąt [ o ] O 2 9 z 6 14 z 11 18 z 4 10 z 3 7 z
OO N 2 R OO N 2 R N 2 R OO R O N N R N O R O N R N O R O N R N O R O N R N O R O N R N O R O N R N O R O 3 J( 1-1 ) 3 J( 13-1 ) 3 J( 15 N- 1 ) 3 J( 15 N- 15 N) 3 J( 13-13 ) 3 J( 13-1 ) 3 J = Acos 2 ( + ) + Bcos( + ) +
3 J = Acos 2 ( + ) + Bcos( + ) + 3 J [z] kąt [ o ] A.Ejchart, Scalar ouplings in Structure Determination of Proteins Bulletin of the Polish Academy of Sciences; hemistry, 1999, 47(1) 1
O O O O OMe 3 J(,) = A + Bcos( ) + cos (2 ) Parametryzacja równania: na podstawie 90 konformerów. A. Taha, N. astillo, D.N. Sears, R. E. Wasylishen, T. L. Lowary, P.-N. Roy, Journal of hemical Theory and omputation, 2010, 6, 212 O O O O O O O O O O OMe 3 J(,) = 0.8 0.7cos( ) + 5.3cos 2 ( ) N. J. hristensen, P. I. ansen, F.. Larsen, T. Folkerman, M. S. Motawia, S. B. Engelsen, arbohydrate Research, 2010, 345, 464
(- 3) (- 1) z 2 3 z 3 J orto = 10 13 z 4 J 5 meta = 2 3 z J para = 0.1 1 z 2 2 3 J( 1-1 ) 0 z 4 J( 1-1 ) 0 z 2 J ax-eq = (- 11) (- 13) z 3 J ax-ax = 11 13 z 3 J ax-eq = 2 5 z 3 J eq-eq = 2 5 z Sprzężenie W ok. 1 z
Konstrukcja multipletów Widma NMR dzielą się na widma pierwszego i drugiego rzędu. W widmach pierwszego rzędu: >> J brak atomów magnetycznie nierównocennych sprzężenia pomiędzy atomami chemicznie równocennymi nie wpływają na krotność (multipletowość) sygnałów; np. sygnał grupy 3 jest singletem, znak stałej sprzężenia nie wpływanastrukturęmultipletu, ijmożna odczytać wprost z widma W widmach drugiego rzędu: J, i / lub są atomy nierównocenne magnetycznie sprzężenia pomiędzy atomami chemicznie równocennymi i znak stałej sprzężenia wpływają na strukturę sygnałów Trudna analiza multipletów
Praca domowa: konstrukcja multipletów w widmach I rzędu ilość sygnałów vs. struktura związku przesunięcie chemiczne vs. struktura związku
1 1 1 2 1 1 1 1 2 1 1 1 1 1 2 1 3 1 3 3 1 3 1 1 1 1 2 1 1 3 3 1 1 4 6 4 1
3 3 3 Praca domowa: jak wygląda sygnał czerwonego atomu wodoru
Nierównocenność protonów w grupie 2 (widmo w Dl 3 ) Układ A 3 MNX 2 3 3 N N( 3 ) 2 2 3 3 N 2 ppm
Widma protonowe drugiego rzędu
J widmo drugiego rzędu AX AM AB
X 2-2 Y A 2 X 2 A 2 M 2 A 2 B 2
- 2 3 A 2 X 3 A 2 B 3
J widmo drugiego rzędu J J AX x y AM b AB a J a*b x = 0 /2 y = 0 + /2
X J = 7 z Układ spinowy AX 2 AB 2 A = 1 ppm (500 z) 5 = 0.1 ppm (50 z) 8 7 6 4 3 2 1 6 = 0.02 ppm (10 z) 5 4 A B = ( 5 + 7 ) / 2! dla = 0 ppm pozostanie tylko jedna linia (układ A 3 ) 8 7 B 3 2 J AB = ( 1-4 ) + ( 6 8 ) / 3 1
NIERÓWNOENNOŚĆ MAGNETYZNA* Równocenność / nierównocenność magnetyczna: dotyczy atomów równocennych chemicznie Dwa atomy są równocenne magnetycznie, kiedy: są równocenne chemicznie stałe sprzężenia tych atomów z dowolnym innym atomem w cząsteczce są identyczne = = A 2 X 2?? X 3 J() 4 J() AA XX (AA BB ) * próbka w roztworze
Z Z Z Y Z Układ spinowy AA XX (AA BB )
A A' N = 1,2 7,8 K = 3 4 = 5 6 M = 9 10 = 11 12 (2O) 2 = ( 3 5 ) 2 = ( 4 6 ) 2 (2P) 2 = ( 9 11 2 = ( 10 12 ) 2 X X X' 1,2 7,8 L = [(2O) 2 K 2 ] 0.5 = [(2P) 2 M 2 ] 0.5 10 11 N = J AX + J AX L = J AX J AX K = J AA + J XX M = J AA J XX 4 5 3 9 12 6 E. W. Garbisch, Journal of hemical Education, 1968, 45(5), 311 320 1968, 45(6), 402 416 1968, 45(7), 480 492
Układ AA MM X A 2 M 2 X
INNE SPRZĘŻENIA NA WIDMIE 1 NMR Izotop spin zawartość obecność naturalna sprzężeń 19 F, 31 P 1/2 100% + 13, 15 N 1/2 ~ 1% (-) 17 O, 33 S 5/2, 3/2 < 1% - 14 N 1 > 99% +/- -D 2 2 1 < 1% +/- 29 Si 1/2 5% +/- 35 l, 37 l 3/2 100% - 79 Br, 81 Br 3/2 100% - 127 I 5/2 100% - 12 l 3 TMS 2 J( 29 Si, 1 ) 6.4 z 29 Si 5% 13 l 3 1% 1 J( 13, 1 ) 209 z 1 J( 13, 1 ) 118 z Si 13 1% 29 Si 13 0.05%
WIDMO SATELITARNE: POMIAR J(,) 13 13 12 * * * * 12 ~1% 1 J( 13, 1 ) 1 ~1% J( 13, 1 ) * 3 J( 1, 1 ) układ ABX dwa atomy 13 obok siebie: ~0.01% * układ AA BB X
2 J( 13, 1 ) 3 J( 1, 1 ) 13 3 J( 1, 1 ) 12 1 J( 13, 1 ) efekt izotopowy!!
POMIAR 1 NMR I PRZYZYNY BŁĘDÓW
Przygotowanie próbki Próbka o odpowiednim stężeniu, rozpuszczona w odpowiedniej ilości deuterowanego rozpuszczalnika, bez osadu i stałych zanieczyszczeń. zy można użyć rozpuszczalnika nie deuterowanego? Brak sygnału deuteru; brak sygnału używanego do regulacji jednorodności pola i do stabilizacji pola. Można ewentualnie użyć sygnału FID-u. l 3, 2 l 2... konieczność usuwania sygnału rozpuszczalnika. l 4, S 2, freon... można użyć; ew. zastosować rozpuszczalnik deuterowany w kapilarze. Wzorzec: zewnętrzny lub wewnętrzny. Można użyć sygnału resztkowego rozpuszczalnika.
Przykładowe widmo 1 NMR wykonane w roztworze: stała sprzężenia J (z) położenie sygnału (przesunięcie chemiczne) intensywność integralna całka
BŁĘDY I I PRZYZYNY Przesunięcie chemiczne niedoskonałość wzorca ( wewnętrzny TMS) błąd do ± 0.5 ppm (!!). W precyzyjnych pomiarach należy stosować wzorzec zewnętrzny. efekty stężeniowe, temperatura próbki, asocjacja związku, itp. rozdzielczość spektralna (0.3 0.8 z) typowa dokładność ( 1 ): nie więcej niż ± 0.01 ppm Wartość stałej sprzężenia J rozdzielczość spektralna (0.3 0.8 z) (!!!) nakładanie się sygnałów typowa dokładność J: nie więcej niż ±0.3 z dokładność można zwiększyć poprzez optymalizację pomiaru Intensywność integralna: niepełna relaksacja próbki rozdzielczość spektralna zaburzenia linii podstawowej widma, nieprawidłowa faza widma typowy błąd: do 10%
Niepełna relaksacja próbki d1(d1) pw at(aq)
Widmo pochodnej metioniny w Dl 3 integracja sygnałów d1 pw at AQ (at) = 2.34 s d1 = 1 ms d1 = 5 s d1 = 10 s 2.9 3.7 4.0 O N O 2.94 2.8 2.3 4 df. S OOMe 2.6 2.9 3.0 0.7 0.8 0.95
Optymalizacja pomiaru 1 NMR T1: dla 1 0.2 2 s lub dłużej (!) A sygnał szum Typowe parametry: 1 : d1 = 0 s, at = 3 5 s, pw = 30 90 o t (sek) d1 (D1) pw at (AQ) A t (sek) Parametry do optymalizacji: D1(D1) można wydłużyć do kilkunastu sek. = bardziej wiarygodna intensywność integralna at (AQ) powinien być optymalny (zazwyczaj nie trzeba zmieniać) zmiana powoduje zmianę np. (TD) np (TD) ilość punktów FID-u; zmiana powoduje zmianę at (AQ) fn (SI) ilość punktów widma (2 n ); zazwyczaj 32K lub 64K; można zwiększyć do 128 K. Poprawia rozdzielczość spektralną widma; parametr ważny przy pomiarze stałej sprzężenia J i dokładnym całkowaniu.!! Rozdzielczość jest ograniczona naturalną szerokością linii!! sw (SW) zakres występowania sygnałów; za duży = gorsza rozdzielczość; za mały = sygnały zawinięte (lub zgubione ). Krótki sw (SW) = długi czas at (AQ) pw (PW) raczej nie zmieniać, ew. skrócić (zbyt długi puls = możliwość uszkodzenia aparatu!!) gain (RG) szczególnie ważny przy pomiarach protonowych (za duży = deformacja widma)
Przypomnienie: dobór czułości odbiornika ( receiver gain ) gain gain = n lub 0 39 za mała wartość źle wykorzystana czułość aparatu za duża wartość obcięcie sygnału A t (sek) Jeśli gain = 0 za duży, należy zmniejszyć pw (np. o 50%)
Przypomnienie: funkcje ważące stosowane w 1 NMR (1D) A FT Mnożenie przez funkcję wykładniczą (Exponential Multiplication, EM) y = exp(-at/t a ) t (sek) EM, FT LB = 1 y A t (sek) t (sek) Mnożenie przez funkcję Gaussa (Lorentzian-to-Gauss Transformation) y = exp(at/t a -bt 2 /t a2 )) y A FT GM, EM, FT LB = -1.2 GB = 0.5 t (sek) t (sek) LB = 0.1 0.3 dla 1 A LB = -1.2; GB = 0.1 1 (Bruker) t (sek)
Tematy związane nie tylko z 1 NMR wpływ temperatury na widmo efekt Overhausera presaturacja sygnału (usuwanie sygnału rozpuszczalnika) echo spinowe rezonans podwójny ( homodecoupling )
Wpływ temperatury na widmo Ph N Ph N N 2 3 N + N- + N N O 2 N - 3 O 2 3 318 K 303 K 253 K
Wpływ temperatury na widmo 3 N 1 2 + 4 1 3 2 4 2 Dl 3 2 3 303 K 233 K 1 2 1, 3 2 2 3
JĄDROWY EFEKT OVERAUSERA (Nuclear Overhauser Effect, NOE) Efekt Overhausera zmiana intensywności sygnału atomu położonego w pobliżu innego atomu naświetlanego jego częstością rezonansową J(,) = 0 z (duża odległość liczona po wiązaniach) D(,) 0 z (mała odległość liczona poprzez przestrzeń) 0 D.Neuhaus, M.Williamson The Nuclear Overhauser Effect (V 1989)
0 I o widmo odniesienia naśw. widmo zaburzone I naśw. I intensywność integralna sygnału niezaburzonego I o intensywność integralna sygnału zaburzonego widmo różnicowe I - I o współczynnik wzmocnienia = (I I o )/I o
Przykład pomiaru efektu Overhausera Widmo odniesienia Widmo naświetlone Widmo naświetlone - widmo odniesienia O (B.Furman et al.)
A AX AMX W widmie NMR obserwowane są bezpośrednio wyłącznie przejścia jednokwantowe
3 4 3 4 1 2 1 6 5 2 2,3 1,4 2,3 1,4 1 4 przejścia jednokwantowe 5 przejście dwukwantowe 6 przejście zerokwantowe
Szybkość narastania NOE: 0 50% maksymalna wartość dla układu 1 1 : 50% duża odległość między atomami mała odległość między atomami czas naświetlania [s] Zależność od czasu korelacji cząsteczki: 1 { 1 } 0.5 - + + - ruch molekuły = = fluktuacje B 0 częstość rezonansowa 1 c czas korelacji cząsteczki -1 log c!! Brak NOE nie jest potwierdzeniem struktury!!
50 % 50 % 28 % 50 % - 13 % 0 % 28 % - 13 % 0.1 1 10 100 log c -100 % 49 % 1 % -0.4 % 49 % 1 % -0.4 % 50 % 0 % 0.1 1 10 100 log c - 100 %
eksperyment NOE-build-up y = ax + b czas naświetlania [`s] 0 200 ms a 1, a 2, a 3 wzorzec r a 1 (1/r 1 ) 6 a 2 (1/r 2 ) 6 a 3 (1/r 3 ) 6 a ~ 1/r 6
Uśrednianie odległości wg NOE <r -6 > x y (x+y)/2 Odległość wg NOE: {[ (1/x 6 ) + (1/y 6 ) ] / 2} -1/6 x = 0.4, y = 0.6 (x + y)/2 = 0.5 {[ (1/x 6 ) + (1/y 6 ) ] / 2} -1/6 = 0.443
0 180 o 90 o krótki czas naświetlania: truncated driven NOE (TOE) długi czas naświetlania: steady state NOE selektywny impuls 180 o : transient NOE d /dt ~ 1/r 6 czas
transient NOE rotating-frame NOE (ROE) 180 o 90 o spin lock 0 steady state NOE od 0.5 do -1 transient NOE od 0.385 do -1 ROE od 0.385 do 0.675 log( c ) I.Bertini, oord. hem. Rev., 150 (1966) 163
NOE wykonanie eksperymentu Próbka: eliminacja zanieczyszczeń paramagnetycznych: kationów metali przejściowych (np. r 3+ z chromianki) tlenu atmosferycznego rozpuszczonego w roztworze Odgazowanie próbki: przepuszczanie gazu obojętnego mało skuteczne procedura zamrażanie próżnia rozmrażanie 3 5 razy zastosowanie specjalnej probówki NMR Pomiar: wykonać kilka pomiarów (co najmniej dwa) brak NOE nie jest potwierdzeniem struktury obecność NOE nie jest potwierdzeniem struktury
REZONANS PODWÓJNY
REZONANS PODWÓJNY (homodecoupling, odsprzęganie) o 0 3 4 3 4 1 2 1 2 0 2,3 1,4 1,4 2,3
PRESATURAJA SYGNAŁU
Uboczny skutek eksperymentu NOE: usunięcie sygnału z widma Widmo odniesienia 0 Widmo naświetlone Selektywne naświetlanie: wyrównanie obsadzeń poziomów energetycznych PRESATURAJA SYGNAŁU usuwanie sygnału rozpuszczalnika przez jego selektywne naświetlanie. ZASTOSOWANIE: usuwanie silnego sygnału rozpuszczalnika, np. w próbkach białek i DNA w środowisku 2 O (nie D 2 O!!)
PRESATURAJA SYGNAŁU (usuwanie sygnału rozpuszczalnika) 2 O
PRESATURAJA SYGNAŁU (usuwanie sygnału rozpuszczalnika) Problem: 1% związków organicznych w wodzie; nie można odparować wody ani wydzielić związku Sygnał wody ponad 100 razy silniejszy niż sygnały badane 2 O Próbka: 60% roztworu + 40 % D 2 O 9.0 ppm -1.0
USUWANIE SZEROKIEGO SYGNAŁU Szerokość sygnału zależy od czasu relaksacji T 2??? Szeroki sygnał = krótki T 2 Wąski sygnał = długi T 2 początek rejestracji sygnału
EO SPINOWE
exp(-t / T 2 ) 90 o 180 o Dwie przyczyny zaniku sygnału: czynniki aparaturowe (niejednorodność pola) relaksacja spin-spin t = 0 2 arr-purcell-meiboom-gill D1 90 o ( 180 o ) n -FID y x f s s f f s po impulsie 90 o po czasie po impulsie 180 o po czasie
Dwa zastosowania echa spinowego pomiar czasu T 2 y = I o exp(- / T 2 ) 90 o 180 o Usuwanie szerokich sygnałów 13-14 N ok. 99% 13-15 N ok. 1% 0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100