Dr hab. Agnieszka Piekiełko-Witkowska Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej Centrum Medyczne Kształcenia Podyplomowego Projekt pracy doktorskiej pt. Wpływ mikrorna na ekspresję genów regulujących metabolizm komórkowy w raku nerki typu jasnokomórkowego. Projekt będzie realizowany w ramach grantu NCN nr 2014/13/B/NZ5/00283 Cel/hipoteza: Celem projektu jest identyfikacja cząsteczek mikrorna, które mogą regulować ekspresję genów modulujących metabolizm komórkowy w raku nerki typu jasnokomórkowego (ang. clear cell renal cell carcinoma, ccrcc), a przez to wpływać na proliferację komórkową. Szczegółowe cele projektu obejmują: wytypowanie cząsteczek mikrorna potencjalnie regulujących ekspresję genów związanych z metabolizmem komórkowym, których ekspresja jest zaburzona w ccrcc (dane o ekspresji genów docelowych i mikrorna będą uzyskane w wyniku równolegle prowadzonych badań). zbadanie wpływu cząsteczek mikrorna na ekspresję wytypowanych genów związanych z metabolizmem komórkowym zbadanie wiązania mikrorna do rejonów 3'UTR transkryptów wytypowanych genów związanych z metabolizmem komórkowym zbadanie wpływu zidentyfikowanych mikrorna i zależnych od nich genów na proliferację komórek raka nerki typu jasnokomórkowego Hipoteza projektu: zaburzenia ekspresji mikrorna, które wpływają na ekspresję cząsteczek związanych z metabolizmem komórkowym, powodują zmiany w stanie metabolicznym komórek w ccrcc, a przez to wpływają na tempo podziałów komórkowych. 1
Materiał badawczy i metodyka: Materiał do badań będą stanowiły: a) pobrane za zgoda Komisji Bioetycznej (nr 75/PB-A/2014) próbki guzów ccrcc (n=30), scharakteryzowane pod względem histopatologicznym oraz odpowiadające im próbki kontrolne, nienacieczone nowotworowo; b) nerkowe linie komórkowe (HK- 2) oraz linie wyprowadzone z ccrcc (Caki-2, KIJ-308T, KIJ-256T). Ogólny schemat badawczy będzie wyglądał następująco: Na podstawie analizy danych uzyskanych z Roche Custom Panels zostaną wybrane 3 związane z regulacją metabolizmu komórkowego geny, których ekspresja różni się w ccrcc w porównaniu z prawidłowymi kanalikami proksymalnymi. mikrorna, potencjalnie wpływające na ekspresję wybranych genów, zostaną wytypowane na podstawie analizy bioinformatycznej (program mirsystem, integrujący analizę za pomocą siedmiu algorytmów (w tym TargetScan, miranda, mirbase i inne). Ekspresja wytypowanych mikrorna będzie analizowana w materiale tkankowym za pomocą real-time PCR, a ich odziaływanie na transkrypty docelowych genów zostanie zweryfikowane w liniach komórkowych za pomocą: a) ich wiązania z rejonem UTR wytypowanych genów (testy w systemie lucyferazowym); b) ich wpływu na ekspresję wytypowanych genów (analiza real-time PCR, Western-blot). Wpływ badanych mikrorna na proliferację zostanie przetestowany na liniach ccrcc za pomocą testów BrdU. Wyniki projektu będą prezentowane w postaci abstraktów konferencyjnych w Polsce i zagranicą, oraz w formie artykułów naukowych publikowanych w pismach o możliwie najwyższych współczynniku IF. Obecny stan wiedzy/założenia: Rak nerkowokomórkowy (RCC, ang. renal cell carcinoma) jest najczęstszym typem litych guzów nerki. Przeważająca większość przypadków RCC (około 80%) jest klasyfikowana jako rak nerki typu jasnokomórkowego (ang. clear cell renal cell carcinoma, ccrcc). Zgodnie z danymi epidemiologicznymi w 2000 roku odnotowano w Polsce ponad 2000 przypadków zachorowań na raka nerki u mężczyzn i ponad 1300 u kobiet. Z powodu raka nerki zmarło w 2000 roku 1400 mężczyzn i ponad 800 kobiet (Krzakowski i wsp., 2004). Wśród wszystkich typów raka nerki ccrcc jest formą najbardziej agresywną, charakteryzuje się najszybszym wzrostem i tworzeniem przerzutów 2
(wykrywanych u prawie 25% pacjentów w momencie diagnozy nowotworu, a u kolejnych 50% pojawiających się w okresie obserwacji poszpitalnej). Podstawowym sposobem leczenia jest chirurgiczne usunięcie guza. Wprowadzenie terapii celowanych pozwala na zwiększenie przeżycia pacjentów z zaawansowaną formą choroby do 40 miesięcy (Sun i wsp. 2010). Ponieważ możliwości skutecznego leczenia ccrcc w zaawansowanej postaci są ograniczone, główny nacisk kładzie się na poszukiwanie sposobów wczesnego wykrywania choroby, ze szczególnym uwzględnieniem markerów molekularnych. Metabolizm komórek nowotworowych jest poważnie zaburzony. Zaburzenia te obejmują zmiany w metabolizmie glukozy, tłuszczów, aminokwasów i innych cząsteczek. Zmiany te powodują przeprogramowanie metabolizmu komórkowego w kierunku wydajnej produkcji związkówelementów budulcowych, wykorzystywanych w procesie intensywnej proliferacji; ułatwiają również przeżycie komórek nowotworowych w niekorzystnych warunkach, takich jak hipoksja. Zmiany w metabolizmie komórkowym są indukowane przez różne czynniki, wśród których kluczową rolę odgrywają zaburzenia ekspresji genów kodujących białka biorące udział w szlakach metabolicznych. Uniwersalną właściwością komórek nowotworowych jest efekt Warburga, polegający na zwiększonym zużyciu glukozy, które jednak nie prowadzi do zwiększonej produkcji ATP w cyklu Krebsa, lecz do zwiększonej syntezy mleczanu, nawet w warunkach normoksji (Vander Heiden i wsp., 2009, Pinthus i wsp., 2011). Dzięki takiej zmianie w metabolizmie komórkowym możliwa jest m.in. produkcja acetylo-coa, potrzebnego do syntezy kwasów tłuszczowych, oraz rybozy, potrzebnej do syntezy nukleotydów. Zgodnie z ostatnimi doniesieniami, ccrcc charakteryzuje się specyficznymi zmianami metabolizmu komórkowego, odmiennymi od tych, które obserwuje się w przypadku innych typów nowotworów (Gatto i wsp. 2014, Cancer Genome Atlas Network, 2013, Ganti i wsp. 2012, Perroud i wsp., 2006, Jones i wsp., 2012, Catchpole i wsp., 2011). Geny kodujące białka wpływające na metabolizm komórkowy mogą być potencjalnie dobrym celem działań zmierzających do zahamowania proliferacji komórkowej (Vander Heiden i wsp., 2009, Vander Heiden i Matthew 2011, Linehan i wsp., 2010). Wśród potencjalnych celów takich terapii wymienia się HK-2, syntazę kwasów tłuszczowych, transporter mleczanowy MCT4, LDH-A, enzym jabłczanowy i wiele innych (Mathupala i wsp. 2009, Kim i wsp., 2011, Salani i wsp., 2013, Vander Heiden i wsp., 2011). Co więcej, wiele stosowanych od dawna chemioterapeutyków, takich jak 5- fluorouracyl, gemcytabina, fludarabina, hydroksymocznik, wpływa na metabolizm komórkowy (np. na reduktazę dihydrofolianową i syntazę tymidylanową), co dodatkowo wspiera ideę wykorzystania szlaków metabolicznych jako celów terapeutycznych. Związki między procesem nowotworzenia a metabolizmem komórkowym podkreśla też fakt, że lek stosowany w terapii cukrzycy, metformina, 3
może obniżać ryzyko rozwoju nowotworu i jest obecnie obiektem badań klinicznych nad wykorzystaniem w terapii antynowotworowej (Quinn i wsp. 2013). Cząsteczki mikrorna są małymi, niekodującymi cząsteczkami RNA, które regulują ekspresję genów wiążąc się do rejonów UTR (ang. UnTranslated Region) docelowych transkryptów i hamując translację bądź indukując degradację mrna. Ekspresja mikrorna jest bardzo często zaburzona w nowotworach, a cząsteczki te są często proponowane jako molekularne markery diagnostyczne. Z drugiej strony, z uwagi na to, że celem działania mikrorna są geny bezpośrednio związane z neogenezą i progresją nowotworową, mikrorna są obiektem badań klinicznych testujących je jako cząsteczki terapeutyczne (Wahid et al., 2010). Podsumowanie: Biorąc pod uwagę rolę zaburzeń metabolizmu komórkowego w patologii ccrcc identyfikacja narzędzi pozwalających na odwracanie zmian w szlakach metabolicznym jest sprawą kluczową. Cząsteczki mikrorna wydają się być idealnym narzędziem do indukowania tego typu zmian w komórce. Proponowany do realizacji projekt może w związku z tym stanowić źródło nowych informacji na temat molekularnego podłoża ccrcc. W związku z trwającymi obecnie badaniami klinicznymi testującymi wykorzystanie mikrorna w terapii nowotworów, informacje uzyskane w toku realizacji projektu mogą też potencjalnie stanowić punkt wyjścia do dalszych badań, już o charakterze aplikacyjnym. Piśmiennictwo: Ahn KJ, Hwang HS, Park JH, Bang SH, Kang WJ, Yun M, Lee JD. Evaluation of the role of hexokinase type II in cellular proliferation and apoptosis using human hepatocellular carcinoma cell lines. J Nucl Med. 2009 Sep;50(9):1525-32. Bensaad K, Tsuruta A, Selak MA, Vidal MN, Nakano K, Bartrons R, Gottlieb E, Vousden KH. TIGAR, a p53- inducible regulator of glycolysis and apoptosis. Cell. 2006 Jul 14;126(1):107-20. Boguslawska J, Piekielko-Witkowska A, Wojcicka A, Kedzierska H, Poplawski P, Nauman A. Regulatory feedback loop between T3 and micrornas in renal cancer. Mol Cell Endocrinol. 2014 Mar 25;384(1-2):61-70. Boguslawska J, Wojcicka A, Piekielko-Witkowska A, Master A, Nauman A. MiR-224 targets the 3'UTR of type 1 5'-iodothyronine deiodinase possibly contributing to tissue hypothyroidism in renal cancer. PLoS One. 2011;6(9):e24541. Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive molecular characterization of clear cell renal cell carcinoma. Nature. 2013 Jul 4;499(7456):43-9. Catchpole G, Platzer A, Weikert C, Kempkensteffen C, Johannsen M, Krause H, Jung K, Miller K, Chen J, Zhang S, Li Y, Tang Z, Kong W. Hexokinase 2 overexpression promotes the proliferation and survival of laryngeal squamous cell carcinoma. Tumour Biol. 2014 Apr;35(4):3743-53. 4
Doherty JR, Yang C, Scott KE, Cameron MD, Fallahi M, Li W, Hall MA, Amelio AL, Mishra JK, Li F, Tortosa M, Genau HM, Rounbehler RJ, Lu Y, Dang CV, Kumar KG, Butler AA, Bannister TD, Hooper AT, Unsal-Kacmaz K, Roush WR, Cleveland JL. Blocking lactate export by inhibiting the Myc target MCT1 Disables glycolysis and glutathione synthesis. Cancer Res. 2014 Feb 1;74(3):908-20. Ganti S, Taylor SL, Abu Aboud O, Yang J, Evans C, Osier MV, Alexander DC, Kim K, Weiss RH. Kidney tumor biomarkers revealed by simultaneous multiple matrix metabolomics analysis. Cancer Res. 2012 Jul 15;72(14):3471-9. Gatto F, Nookaew I, Nielsen J. Chromosome 3p loss of heterozygosity is associated with a unique metabolic network in clear cell renal carcinoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014 Mar 4;111(9):E866-75. Gregersen LH1, Jacobsen A, Frankel LB, Wen J, Krogh A, Lund AH. MicroRNA-143 down-regulates Hexokinase 2 in colon cancer cells.bmc Cancer. 2012 Jun 12;12:232.doi: 10.1186/1471-2407-12-232. Hatziapostolou M, Polytarchou C, Iliopoulos D. mirnas link metabolic reprogramming to oncogenesis. Trends Endocrinol Metab. 2013 Jul;24(7):361-73. Jiang S, Zhang LF, Zhang HW, Hu S, Lu MH, Liang S, Li B, Li Y, Li D, Wang ED, Liu MF. A novel mir- 155/miR-143 cascade controls glycolysis by regulating hexokinase 2 in breast cancer cells. EMBO J. 2012 Apr 18;31(8):1985-98. Jiang X, Sun Q, Li H, Li K, Ren X. The role of phosphoglycerate mutase 1 in tumor aerobic glycolysis and its potential therapeutic implications. Int J Cancer. 2013 Nov 28. doi: 10.1002/ijc.28637. Jones EE, Powers TW, Neely BA, Cazares LH, Troyer DA, Parker AS, Drake RR. MALDI imaging mass spectrometry profiling of proteins and lipids in clear cell renal cell carcinoma. Proteomics. 2014 Apr;14(7-8):924-35 Kaplon J, Zheng L, Meissl K, Chaneton B, Selivanov VA, Mackay G, van der Burg SH, Verdegaal EM, Cascante M, Shlomi T, Gottlieb E, Peeper DS. A key role for mitochondrial gatekeeper pyruvate dehydrogenase in oncogene-induced senescence. Nature. 2013 Jun 6;498(7452):109-12. Kim JE, Ahn BC, Hwang MH, Jeon YH, Jeong SY, Lee SW, Lee J. Combined RNA interference of hexokinase II and (131)I-sodium iodide symporter gene therapy for anaplastic thyroid carcinoma. J Nucl Med. 2011 Nov;52(11):1756-63. Krzakowski M (ed.). Zalecenia postępowania diagnostyczno-terapeutycznego w nowotworach złożliwych u dorosłych, rozdział "Nowotwory układu moczowo-płciowego", Polska Unia Onkologii, 2004 Linehan WM, Srinivasan R, Schmidt LS. The genetic basis of kidney cancer: a metabolic disease. Nat Rev Urol. 2010 May;7(5):277-85. Master A, Wójcicka A, Piekiełko-Witkowska A, Bogusławska J, Popławski P, Tański Z, Darras VM, Williams GR, Nauman A. Untranslated regions of thyroid hormone receptor beta 1 mrna are impaired in human clear cell renal cell carcinoma. Biochim Biophys Acta. 2010 Nov;1802(11):995-1005 Mathupala SP, Ko YH, Pedersen PL. Hexokinase-2 bound to mitochondria: cancer's stygian link to the "Warburg Effect" and a pivotal target for effective therapy. Semin Cancer Biol. 2009 Feb;19(1):17-24. Peng Q, Zhou Q, Zhou J, Zhong D, Pan F, Liang H. Stable RNA interference of hexokinase II gene inhibits human colon cancer LoVo cell growth in vitro and in vivo. Cancer Biol Ther. 2008 Jul;7(7):1128-35. Perroud B, Lee J, Valkova N, Dhirapong A, Lin PY, Fiehn O, Kültz D, Weiss RH. Pathway analysis of kidney cancer using proteomics and metabolic profiling. Mol Cancer. 2006 Nov 24;5:64. Peschiaroli A, Giacobbe A, Formosa A, Markert EK, Bongiorno-Borbone L, Levine AJ, Candi E,D'Alessandro A, Zolla L, Finazzi Agrò A, Melino G. mir-143 regulates hexokinase 2 expression in cancer cells. Oncogene. 2013 Feb 7;32(6):797-802. Pinthus JH, Whelan KF, Gallino D, Lu JP, Rothschild N. Metabolic features of clear-cell renal cell carcinoma: mechanisms and clinical implications. Can Urol Assoc J. 2011 Aug;5(4):274-82. Quinn BJ, Kitagawa H, Memmott RM, Gills JJ, Dennis PA. Repositioning metformin for cancer prevention and treatment. Trends Endocrinol Metab. 2013 Sep;24(9):469-80. Salani B, Marini C, Rio AD, Ravera S, Massollo M, Orengo AM, Amaro A, Passalacqua M, Maffioli S, Pfeffer U, Cordera R, Maggi D, Sambuceti G. Metformin impairs glucose consumption and survival in Calu-1 cells by direct inhibition of hexokinase-ii. Sci Rep. 2013;3:2070. 5
Sun M, Lughezzani G, Perrotte P, Karakiewicz PI. Treatment of metastatic renal cell carcinoma Nat Rev Urol. 2010 ;7(6):327-38. Vander Heiden MG, Cantley LC, Thompson CB. Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science. 2009 May 22;324(5930):1029-33. Vander Heiden, Matthew G. Targeting cancer metabolism: a therapeutic window opens. Nature Reviews Drug Discovery 10.9 (2011): 671 684. Wahid F, Shehzad A, Khan T, Kim YY. MicroRNAs: synthesis, mechanism, function, and recent clinical trials. Biochim Biophys Acta. 2010; 1803(11):1231-43. Wang ZY, Loo TY, Shen JG, Wang N, Wang DM, Yang DP, Mo SL, Guan XY, Chen JP. LDH-A silencing suppresses breast cancer tumorigenicity through induction of oxidative stress mediated mitochondrial pathway apoptosis. Breast Cancer Res Treat. 2012 Feb;131(3):791-800. Willmitzer L, Selbig J, Weikert S. Metabolic profiling reveals key metabolic features of renal cell carcinoma. J Cell Mol Med. 2011 Jan;15(1):109-18. Wojcicka A, Piekielko-Witkowska A, Kedzierska H, Rybicka B, Poplawski P, Boguslawska J, Master A, Nauman A. Epigenetic regulation of thyroid hormone receptor beta in renal cancer. PLoS One. 2014 May 21;9(5):e97624. doi: 10.1371/journal.pone.0097624 Wolf A, Agnihotri S, Micallef J, Mukherjee J, Sabha N, Cairns R, Hawkins C, Guha A. Hexokinase 2 is a key mediator of aerobic glycolysis and promotes tumor growth in human glioblastoma multiforme. J Exp Med. 2011Feb 14;208(2):313-26. Xie H, Hanai J, Ren JG, Kats L, Burgess K, Bhargava P, Signoretti S, Billiard J, Duffy KJ, Grant A, Wang X, Lorkiewicz PK, Schatzman S, Bousamra M 2nd, Lane AN, Higashi RM, Fan TW, Pandolfi PP, Sukhatme VP, Seth P. Targeting lactate dehydrogenase--a inhibits tumorigenesis and tumor progression in mouse models of lung cancer and impacts tumor-initiating cells. Cell Metab. 2014 May 6;19(5):795-809. Yamasaki T, Seki N, Yoshino H, Itesako T, Yamada Y, Tatarano S, Hidaka H, Yonezawa T, Nakagawa M, Enokida H. Cancer Sci. 2013 Nov;104(11):1411-9. doi: 10.1111/cas.12240. Epub 2013 Aug 22. Tumorsuppressive microrna-1291 directly regulates glucose transporter 1 in renal cell carcinoma. Yoshino H, Enokida H, Itesako T, Kojima S, Kinoshita T, Tatarano S, Chiyomaru T, Nakagawa M, Seki N. Tumor-suppressive microrna-143/145 cluster targets hexokinase-2 in renal cell carcinoma. Cancer Sci. 2013 Dec;104(12):1567-74. 6