Faculty of Biology Institute of Anthropology

Transkrypt

1 Faculty of Biology Institute of Anthropology Izabela Makałowska, prof. dr hab. Poznań, Zakład Genomiki Zintegrowanej Instytut Antropologii Wydział Biologii Uniwersytet im A. Mickiewicza w Poznaniu RECENZJA ROZPRAWY DOKTORSKIEJ PANI MGR ANNY ŁUKASIK POD TYTUŁEM PLANT mirnas APPLICATION IN TREATMENT OF HUMAN DISEASES IN SILICO STUDIES Rozprawa doktorska przedstawiona przez Panią Annę Łukasik wykonana została pod kierunkiem prof. dr hab. Piotra Zielenkiewicza z Instytutu Biochemii i Biofizyki Polskiej Akademii Nauk. Przedłożona praca składa się z obszernego wprowadzenia, trzech publikacji oraz międzynarodowej aplikacji patentowej. Do pracy dołączone są oświadczenia współautorów publikacji określające ich wkład w powstanie danego artykułu. Przedstawiona praca doktorska dotyczy niezwykle ciekawego problemu, a mianowicie poszukiwania roślinnych cząsteczek mkrorna (mirna) posiadających zdolność do międzygatunkowej regulacji ekspresji genów i które to cząsteczki mogą potencjalnie być wykorzystane w celach terapeutycznych. Doktorantka podjęła się zatem zadania nie tylko interesującego i nowatorskiego, ale także trudnego. Podstawowe analizy in silico cząsteczek mirna mogą nie być szczególnie dużym wyzwaniem dla wprawnego bioinformatyka, jednakże wykazanie terapeutycznego potencjału cząsteczki to zadanie pionierskie, wymagające szczególnej staranności, dużych umiejętności, sporej wiedzy i kreatywności. ul. Umultowska 89, Poznań, Poland tel , anthro@amu.edu.pl

2 Na początku rozprawy, w obszernym wstępie, Doktorantka przedstawiła biogenezę i funkcje cząsteczek mirna oraz obecny stan wiedzy odnośnie terapeutycznego wykorzystania cząsteczek mirna i możliwości zastosowania roślinnych mirna w leczeniu chorób człowieka. Szczególnie dużo uwagi autorka pracy poświęciła międzygatunkowemu transferowi cząsteczek mirna oraz regulacji ekpresji genów przez mirna pochodzące z żywności. Chciałabym tu podkreślić dużą staranność w przygotowaniu tego materiału i przedstawienie zarówno prac wskazujących na możliwość takiego wykorzystania cząsteczek mirna jak i prac wysoce krytycznych. Wstęp kończy rozdział poświęcony bioinformatycznym analizom cząsteczek mirna, przede wszystkim istniejącym narzędziom i bazom danych. Kolejną część rozprawy stanowi krótki opis uzyskanych przez Doktorantkę wyników. Ten syntetyczny opis doskonale spaja wszystkie prace stanowiące rozprawę doktorską. Doktorantka przedstawia tutaj główne założenia pracy i jej wyniki koncentrując się na zadaniach stanowiących podstawę rozprawy. Opracowanie to jest niezwykle pomocne w przypadku prac mających kilku autorów, tak jak jest to w przypadku recenzowanej rozprawy. Pozwala to recenzentowi na skoncentrowanie się na tych elementach, w których wykonaniu i opracowaniu uczestniczyła Doktorantka. Cała część wstępna, a więc wprowadzenie i omówienie wyników, jest przejrzyście napisana i niezwykle bogato, szczególnie jak na wstęp do rozprawy, wsparta źródłami literaturowymi. Pierwsza z prac będących podstawą rozprawy doktorskiej opublikowana została w czasopiśmie BMC Bioinformatics. Praca dotyczy identyfikacji, z wykorzystaniem narzędzi bioinformatycznych, cząsteczek mirna pochodzących z liści kapusty głowiastej (Brassica oleacera). Proces identyfikacji przeprowadzony został w kilku etapach i obejmował kilka kroków filtrowania danych, porównanie odczytów do zidentyfikowanych przez inna grupę cząsteczek mirna z kapusty, porównanie do cząsteczek mirna pochodzących ze 162 gatunków roślin oraz mapowanie odczytów do dostępnych fragmentów genomu kapusty i identyfikację nowych mirna metodami modelowymi. W wyniku przeprowadzonych analiz doktorantka zidentyfikowała 261 zachowanych ewolucyjnie i 26 nowych cząsteczek mirna. 13 ze znalezionych nowych cząsteczek zostało potwierdzonych eksperymentalnie przez współpracujący zespół z Uniwersytetu im. Adama Mickiewicza w Poznaniu. Przeprowadzona analiza obejmowała także wyszukiwanie tasirna, których to Doktorantka zidentyfikowała 202

3 cząsteczki. Ostatnim etapem opisanego w publikacji projektu było znalezienie sekwencji docelowych dla mirna oraz funkcjonalna ich charakterystyka. Analizy wykonane zostały poprawnie i zgodnie z przyjętymi zasadami. Mam jednak pytanie odnośnie filtrowania danych otrzymanych w wyniku porównywania odczytów ze znanymi cząsteczkami mirna za pomocą programu BLASTN. Doktorantka dopuszczała, w zależności od wykorzystanej do porównania bazy, odpowiednio jedną lub trzy niezgodności pomiędzy odczytem a znaną cząsteczką mirna. Niezgodności te mogły wystąpić na całej długości mirna z wyjątkiem tzw. rejonu seed. Chciałabym zapytać jakie były podstawy założenia, iż obszar ten, w odróżnieniu od pozostałej części, musi być w 100% zgodny? Czy znane są Doktorantce prace, które wskazywałyby na dużo większe zakonserwowanie ewolucyjne rejonu seed u roślin i czy jest to typowe dla wszystkich mirna roślin czy jedynie dla cząsteczek hamują translację, w odróżnieniu od tych, które tną transkrypty? Druga z załączonych prac opublikowana została w czasopiśmie PloS One i dotyczy identyfikacji cząsteczek mirna w exosomach mleka kobiecego i mleka świni. Analiza oparta była na publicznie dostępnych danych z sekwencjonowania bibliotek małych RNA. Na podstawie porównania sekwencji Doktorantka zidentyfikowała 17 roślinnych mirna obecnych w mleku świni i 23 w mleku kobiecym. Doktorantka, porównując poszczególne biblioteki, sprawdziła czy znalezione cząsteczki mogą stanowić zanieczyszczenie. Wiele z nich pojawiło się w kilku bibliotekach co czyniło zanieczyszczenie mało prawdopodobnym. Następnie przeprowadzone zostały poszukiwania potencjalnych sekwencji docelowych tychże mirna. Wykorzystując kilka narzędzi bioinformatycznych Doktorantka zidentyfikowała 1282 cząsteczki mrna człowieka będące potencjalnymi cząsteczkami docelowymi dla wyszukanych roślinnych mirna. Z zestawu tego wybranych zostało 25 cząsteczek o najlepszych współczynnikach podobieństwa i parowania z cząsteczkami mirna. Wybrane mrna zostały poddane szczegółowej analizie funkcjonalnej, która wykazała, iż są one istotne dla ważnych procesów życiowych takich jak regulacja ekspresji genów, odpowiedź immunologiczna czy też transport. Przeprowadzona w pracy analiza wykonana była bardzo rzetelnie, a wnioski wyciągnięte z dużą ostrożnością i należytym krytycyzmem. Mam jednakże pytanie odnośnie trzech z listy najbardziej interesujących mirna znalezionych w mleku kobiecym i wymienionych w tabeli 2. O ile mirna z pomarańczy czy też ryżu nie są zaskakujące, o tyle jedzenie rzodkiewnika jest mało prawdopodobne,

4 choć oczywiście nie jest niemożliwe. Zrozumiałym jest, że mirna rzodkiewnika zostały wyselekcjonowane w wyniku analizy podobieństwa odczytów, ale nie są to najprawdopodobniej cząsteczki specyficzne jedynie dla rzodkiewnika. Chciałabym więc zapytać czy Doktorantka spróbowała zidentyfikować rośliny jadalne, z których mirna te mogłyby w rzeczywistości pochodzić? Trzecia z publikacji ukazała się w czasopiśmie Bioinformatics i poświęcona jest serwisowi Tools4miRs będącemu kolekcją 180 narzędzi bioinformatycznych służących do różnorodnych analiz cząsteczek mikrorna. Zgromadzone narzędzia zostały przetestowane i sklasyfikowane w zależności od rodzaju analiz, którym służą. Dodatkowo serwis zaopatrzono w system filtrowania w celu ułatwienia użytkownikom wyboru narzędzi odpowiednio do potrzeb analitycznych i typu danych jakimi dysponuje. Tools4miRs zawiera także meta-serwer integrujący 10 narzędzi do przewidywania sekwencji docelowych cząsteczek mirna. Do artykułu załączony jest bogaty suplement z przykładami wykorzystania serwisu. W dobie tak dużego zainteresowania cząsteczkami mirna i lawinowym wzrostem narzędzi służącym ich analizom, takie zebranie tychże narzędzi w jednym miejscu wraz z intuicyjnym systemem filtrowania i jednorodnym, krótkim opisem jest niewątpliwie bardzo cenne. Rozprawę zamyka międzynarodowy wniosek patentowy, który stanowi wspaniałe zwieńczenie pracy Doktorantki. W wyniku realizacji projektu doktorantka zebrała wiele narzędzi bioinformatycznych, przeprowadziła identyfikację mirna w liściach kapusty, wykazała obecność roślinnych mirna w mleku kobiecym i mleku świni, wskazała ich potencjalne sekwencje docelowe i, co jest przedmiotem wniosku patentowego, zaproponowała wykorzystanie dwóch cząsteczek mirna kapusty, bol-mir172a i bolmir172b, w zwalczaniu skutków reakcji zapalnej w różnego rodzaju chorobach. W wyniku analiz bioinformatycznych Doktorantka wykazała, że mir172a może oddziaływać na białko FAN, które jest istotne w regulacji ekspresji białek odpowiedzialnych za reakcje zapalne. Ten końcowy rezultat pracy Doktorantki został potwierdzony eksperymentalnie przez współpracowników. Zademonstrowano, iż cząsteczki mir172a i mir172b pochodzące z kapusty wpływają na proces proliferacji limfocytów T i B oraz na poziom białka FAN w ludzkich fibroblastach oraz limfocytach i monocytach. Podsumowując stwierdzam, że rozprawa doktorska Pani Mgr Anny Łukasik jest nie tylko poprawna i spełnia wszelkie wymagania, ale przede wszystkim jest wspaniałym

5 przykładem pracy bioinformatycznej, której wyniki nie tylko zostały eksperymentalnie potwierdzone, ale doprowadziły także do wniosku patentowego i konkretnej propozycji praktycznego ich wykorzystania. Tak kompletny, logiczny i świetnie wykonany ciąg zadań wykonanych w ramach pracy doktorskiej nie należy, choć bardzo szkoda, do powszechnych. Dlatego też stwierdzam, że praca ta nie tylko spełnia wszystkie ustawowe i zwyczajowe wymogi, ale także, ze względu na swoją jakość, oryginalność i istotność odkryć, zasługuje na szczególną uwagę. Stawiam więc wniosek o dopuszczenie Doktorantki do dalszych etapów przewodu oraz o wyróżnienie rozprawy.