Grzybowy enteogen Pomiar grzyba (The Mushroom Entheogen - The Measure of the Mushroom) by C.B. Gold zaczerpnięte z PM&E Wolumin piąty (Psychedelic Monographs and Essays) wersja ang. www.en.psilosophy.info/pxoaqoqvbojabxcdcpafblgb original text: http://www.erowid.org/plants/mushrooms/mushrooms_article2.shtml Spis Tresci: [ tłumaczenie: cjuchu ] Streszczenie Testowanie subiektywne i obiektywne Testowanie subiektywne Testowanie obiektywne Ogólna teoria i różne schematy wykrywania i mierzenia Co jest w grzybie? Co mierzymy? Test bibułowy p-dmab Teoria testu kolorymetrycznego referencyjnego Inne potencjalne chromofory Właściwa długość fali do pomiaru chromoforu DMAB Światło przyspiesza reakcję testu Określenie rozpuszczalnika ekstrakcyjnego Waga próbki Inne oddziaływania na test Interpretacja testu DMAB Test kolorymetryczny Wyposażenie Chemikalia dla testu kolorymetrycznego Artykuły Kolorymetry Waga Duże probówki borokrzemianowe Dobrane kuwety Uchwyt do probówki Chemikalia Plastikowy arkusz Przygotowanie roztworów testowych Wywoływacz koloru Roztwór ekstrakcyjny z kwasu octowego Para-dimetylobenzaldehydowy test kolorymetryczny Zakończenie Bibliografia soma rights re-served 1 od 26.03.2015 na http://www.psilosophy.info/
Streszczenie Grzybowy Enteogen bada relacje między twardą chemią mikologiczną a doznaniami wizjonerskimi związanymi z zastosowaniem psilocybiny. W PM & E wol.1 zaprezentowano optymalne techniki zbierania/przechowywania. Przedstawiono badanie reakcji niebieszczenia ze sposobami powstrzymania jej początku. W PM & E wol. 2 zostały zaprezentowane związki między środkami obróbki wstępnej grzyba a różnymi formami odwadniania, ze szczególnym uwzględnieniem optymalnej psychoaktywności. W PM & E wol. 4 podane są instrukcje do skonstruowania próżniowego systemu odwadniania. Porównania HPTLC (high performance thin layer chromatography) (wysokowydajna chromatografia cienkowarstwowa) odnotowano na próbkach. Kontynuujemy tę serię ogólnym zarysem testowania mocy psilocybiny - zarówno w laboratorium jak i poprzez medytację i psychologiczną/fizjologiczną obserwację. PM & E jest wyjątkowo dumne z możliwości przedstawienia naszym czytelnikom tego odcinka Grzybowego Enteogenu. Dlaczego więc trzeba sprawdzić moc grzybów psychedelicznych? Istnieją dwa dobre powody: albo by sprawdzić wpływ jakichś metod eksperymentalnych na końcowe stężenie aktywnych tryptamin (tj. psilocybiny i psylocyny) w grzybach (o czym praktycznie jest ten artykuł) lub co ważniejsze, by poznać subiektywne natężenie dawki, którą planowałbyś przyjąć. Może pamiętasz anegdotę z poprzedniego artykułu o moim przyjacielu, który przez pomyłkę przyjął zbyt dużą ilość proszku grzybowego. Bardzo się zbliżył do konieczności jakiejś pomocy medycznej, ponieważ myślał, że traci rozum. Żaden z nas nie miał pojęcia, że źle zmierzyliśmy dawkę grzybów i wziął on podwójną dawkę tego, co normalnie byłoby dużą dawką. Ja zakończyłem z około połową dużej dawki. Ze mną było w porządku, lecz on spanikował, a świadomość tego, że wziąłem, co myślałem, że było taką samą dawką, jeszcze to pogorszyła, ponieważ moim zdaniem był całkowicie irracjonalny. Ten krańcowy przykład przedawkowania jest prawdopodobnie rzadkością. To co bardziej powszechne i frustrujące to niedodawkowanie. Jeśli jesteś taki jak ja, grzybowy trip jest wyjątkowym wydarzeniem, dla którego muszę zaplanować czas. Przy obowiązkach rodzinnych i pracy nie mogę już, kiedy chcę, wziąć dnia wolnego podczas weekendu. Zbyt dużo razy zaplanowałem dzień tripu jedynie by zakończyć z łagodnym brzęczeniem i podwyższonym odczuwaniem, zamiast z odmienionym stanem przytomności i świadomości, charakterystycznym dla pełnego tripu grzybowego. Potrzebowałem metody testującej grzyba. Wiedząc jakie jest aktywne stężenie tryptamin przed przyjęciem grzybów można uniknąć potencjalnego problemu przedawkowania lub niedodawkowania. Jednym z celów moich badań, poza zmniejszeniem toksyczności grzybów, jest zmaksymalizowanie zawartości psilocybiny w wyhodowanych grzybach oraz ustabilizowanie jej biosyntetyzowanej ilości z rzutu na rzut w konkretnej odmianie Psilocybe cubensis, poprzez kontrolę czynników środowiskowych i odżywczych. We soma rights re-served 2 od 26.03.2015 na http://www.psilosophy.info/
własnych badaniach odkryłem, że gdy eksperymentalnie zmieniłem te wpływające na wzrost czynniki, konkretne stężenia w odmianie, zmierzone metodą testową opisaną pod koniec tego artykułu, wzrosły o współczynnik cztery lub pięć. W swych badaniach, Bigwood i Beung zgadzają się z tym wahaniem w stężeniu psilocybiny w kontrolowanej uprawie Psilocybe cubensis. Ale ze względu na ich duże zróżnicowanie w tym, co uważali za ściśle kontrolowane środowisko wzrostu, jestem skłonny stwierdzić, że nie nadzorowali wszystkich możliwych czynników, wpływających na wzrost i biosyntezę psilocybiny. Stwierdzili, że w ich własnej hodowli, stężenia różniły się o współczynnik cztery, a co gorsza okazy z innych źródeł różniły się aż dziesięć razy 4. Nadchodzący artykuł, stosujący wyniki testowania próbki grzyba ukaże w jaki sposób, poprzez staranną kontrolę żywieniowych i środowiskowych czynników wzrostu grzyba, można zminimalizować te duże wahania, z rzutu na rzut, stężenia tryptaminy (głównego ugrupowania molekularnego w psilocybinie/psylocynie i innych spokrewnionych związkach). Jeśli zbierzesz próbki ze środowiska naturalnego, wahania z próbki na próbkę będą bardziej pogorszone ze względu na jeszcze mniejszą kontrolę środowiska i związków odżywczych. Poza różnicami w odmianach (tj. różnicami genetycznymi), mikrośrodowiskowe i odżywkowe różnice podłoża do wzrostu przyczyniają się do dużych wahań między okazami, nawet zgromadzonymi blisko siebie. Christiansen et al., odkryli w swych badaniach stężenia psilocybiny w wielu różnych próbkach Psilocybe semilanceata w Norwegii, że zawartość różniła się o czynnik nieco wyższy niż dziesięć 7. Jeśli między grzybami tego samego gatunku istnieje dziesięciokrotna różnica, wyobraź sobie wahania między odmiennymi psychedelicznymi rodzajami. Grzyby, które zawierają halucynogenne tryptaminy obejmują następujące rodzaje: Conocybe, Panaeolus, Psilocybe, oraz Stropharia 12. Jeśli zbierasz któryś z tych rodzajów do celów psychedelicznych, możesz chcieć przetestować ich względną moc nim je przyjmiesz. Jeśli planujesz przyjąć grzyby na świeżo, wówczas przy odrobinie doświadczenia w jednym z testów polowych opisanych później będziesz w stanie oszacować ich względne stężenie. Można to stwierdzić nie tylko z końcowej intensywności koloru reakcji lecz również z szybkości z jaką próbka nabiera koloru. Ostatnia uwaga odnośnie potrzeby testu: jeśli jesteś osobą, której zdarzy się kupić grzyby psychodeliczne, chciałbyś się dowiedzieć co dostajesz za pieniądze. Najlepiej, jeśli byłyby legalne w sprzedaży, wtedy grzybowy handlarz powinien znać względną moc różnych partii swych grzybów i powinien sprzedawać suszone grzyby nie wagowo lecz pod względem ilości potrzebnej na umiarkowany trip. Spis Tresci Testowanie subiektywne i obiektywne "Okej", mówisz, "Więc może warto byłoby przetestować grzyby, które kupuję lub uprawiam, lecz nie jestem chemikiem i chcę czegoś prostego." Istnieją dwa proste typy testowania: subiektywne i obiektywne. Subiektywne testowanie grzybów jest opisowe. Jest łatwe i tanie i wymaga jedynie skupienia uwagi na własnym umyśle, ale zajmuje dużo czasu. Z drugiej strony, testowanie obiektywne, jest ilościowe. Jest proste, zazwyczaj szybkie, powtarzalne, lecz w niektórych procedurach może wymagać złożonego i drogiego sprzętu. Mimo że określiłem dwie formy testowania, trzeba znać skuteczność psychedeliku nieznanej partii grzybów lub zakomunikować komuś innemu, jaka będzie nasza partia grzybów. Problemem z testowaniem subiektywnym jest znormalizowanie metody. Ze względu na kaprysy umysłu, trzeba kontrolować nastawienie i otoczenie (set&setting), w których przeprowadza się test subiektywny. Poprzez kontrolę tych dwóch czynników, choć bardzo trudną, można ustalić wspólną reakcję (np. poziom energii, ilość halucynacji, ich kolory i kształty, łatwość odczuwania jedności z obiektami zewnętrznymi lub pojęciami, itd.) na znormalizowaną dawkę. Reakcja ta może być wskaźnikiem, którego używa się do porównania wszystkich innych testów subiektywnych. Ta subiektywna reakcja na znormalizowaną dawkę pomoże dowiedzieć się, ile będzie można wziąć później. soma rights re-served 3 od 26.03.2015 na http://www.psilosophy.info/
Problemem z testowaniem obiektywnym jest to, że nie ważne jaką wartość stężenia (zazwyczaj wyrażanego w mg psilocybiny/gr. grzyba) ustali się ostatecznie w teście, nie wskaże ona jakie będzie doznanie subiektywne. By dowiedzieć się, jakie będzie doznanie subiektywne, nadal trzeba wziąć psychedelik. Zrobiwszy to kilkukrotnie dla różnych poziomów stężenia, z nieznanej wartości testu obiektywnego można wywnioskować subiektywną wartość intensywności, obywając się tym samym bez potrzeby testowania subiektywnego. Zaletą posiadania wartości stężenia z testu obiektywnego jest to, że może powiedzieć jakie będzie osobiste doznanie temu, kto poświęci czas by subiektywnie porównać kilka partii grzybów po znalezieniu wartości stężenia testu obiektywnego dla każdej partii. Przez porównanie swych doświadczeń z kilkoma odpowiadającymi wartościami liczbowymi, można z nowej obiektywnej wartości testu wywnioskować intensywność osobistego doświadczenia podczas przyjmowania nieznanej partii grzybów. Efekty subiektywne mogą znacznie się różnić w zależności od osoby, lecz wraz ze wzrostem wartości testu obiektywnego zmieni się liniowo intensywność i czas trwania. Testy subiektywne trzeba zrobić tylko kilka razy (i odnotować dla przyszłych porównań), gdy porównuje się różne poziomy stężeń grzybowej mocy, po których, do ocenienia nowych próbek grzybów, można polegać wyłącznie na teście obiektywnym. Natomiast jeśli ktoś decyduje się stosować wyłącznie test subiektywny, wówczas będzie potrzebował sprawdzać każdą partię poprzez faktyczne wzięcie małej, standaryzowanej dawki. Następnie z tej żmudnej oceny można określić ilość potrzebną do jakiegokolwiek poziomu tripowania, jaki chce się później osiągnąć. Poza problemem pobrania przykładowej dawki z dokładnie każdej partii grzybów, test subiektywny zawiera kolejną komplikację gdy jest stosowany osobno. Jego wyniki mogą być trudne do zakomunikowania komuś innemu, ponieważ wyjątkowe doznanie może różnić się radykalnie pomiędzy poszczególnymi osobami. Na przykład, ktoś może opisać reakcję na trip po pięciu gramach grzybów jako dający poczucie silnej energii seksualnej z przejmującą świadomością fizycznego ja. Zważywszy na to, że możesz wziąć dokładnie ten sam proszek grzybowy, a nawet oczekiwać i może liczyć na podobną reakcję, doświadczysz jedynie bardzo introspekcyjnego tripu, w którym ostatnią rzeczą przychodzącą na myśl jest seks. Wartość z testu obiektywnego pozwala zakomunikować intensywność tripu grzybowego bez opisywania wywołanego doznania. Same testowanie subiektywne jest problemowe, lecz uzupełnione obiektywnym testowaniem ilościowym może stać się dla nas przewidującym narzędziem. Również samo testowanie obiektywne nie dostarcza nam żadnego realnego znaczenia o subiektywnej naturze tripu. Ponieważ test obiektywny nie zdradza nam żadnej ważnej osobiście informacji, można wywnioskować, że założeniem każdego testu ilościowego jest nasze własne testowanie subiektywne. Przy własnym testowaniu subiektywnym wykorzystałem następujące procedury i wskazówki. Zastosuj swe własne wskazówki, lecz główną zasadą jest obserwowanie efektów psychedeliku na ciało i umysł. Przed określeniem zmian spowodowanych przez psychedelik dobrze jest poznać swój umysł. Najlepszym sposobem na zrozumienie własnego umysłu jest regularne praktykowanie jakiejś formy medytacji umysłowej, w której nacisk kładziony jest na świadomość uważności w coraz spokojniejszym umyśle. Spis Tresci Testowanie subiektywne 1. Można spierać się na temat wpływu nastawienia i otoczenia na doznanie psychedeliczne, ale bez względu na wynik dyskusji, przy coraz większych dawkach psychedelików ma się zwykle więcej efektów fizycznych, dłuższy czas trwania i głębokość tripu. Zaobserwuj różnice w długości i głębokości tripu przy różnych ilościach grzybów, najlepiej z tej samej mieszanki proszku grzybowego (właściwie przechowywanego tak, by przerwa między testami nie spowodowała degradacji jakości grzybów). 2. Podczas tripu obserwuj swój umysł z niewielkimi lub bez żadnych doznań zmysłowych. Najlepiej to zrobić zamykając oczy lub będąc w zupełnej ciemności, zatkaj uszy lub znajdź całkowicie ciche otoczenie i połóż się lub usiądź całkowicie nieruchomo. Po takim kilkuminutowym siedzeniu lub leżeniu, zwróć uwagę na intensywność kolorów w myślach lub wyprojektowanych w ciemności. Zaobserwuj ostrość soma rights re-served 4 od 26.03.2015 na http://www.psilosophy.info/
3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. krawędzi i form. Czy natura form jest łagodna czy złowroga? Czy doznajesz sennych halucynacji czy wzorów? Czy twój umysł jest czysty, czy senny lub śpiący? Zaobserwuj naturę swoich postrzeżeń przy otwartych oczach w dobrze oświetlonym otoczeniu. Zwróć uwagę na efekt falowania wokół przedmiotów. Czy masz kolorowe wzory lub halucynacje rzutowane na otoczenie. Jest to pewna wskazówka, że wziąłeś silną dawkę. Posłuchaj dźwięków lub muzyki i poczuj ich wpływ na twoje emocje, a także zaobserwuj jak zmieniają je halucynacje lub wzory. Zaobserwuj charakter swej świadomości. Czy jesteś pochmurny, śpiący, ponury, uparty, komunikatywny, uważny? Zwróć uwagę na wszystkie fizyczne efekty uboczne, takie jak nudności, bóle głowy, bóle mięśni, skurcze żołądka, zbolałe stawy i inne niekomfortowe objawy. Wiele dolegliwości i bólów może być rezultatem objawów psychosomatycznych podczas tripu psychedelicznego. Jednak często również zanieczyszczenia w grzybach mogą zapoczątkować efekty uboczne. Wszystkie powyższe rzeczy są wskazówkami jakości tripu a w konsekwencji jakości grzybów. Generalnie, ponieważ moją uprawę i metody przechowywania doprowadziłem do perfekcji, powyższe objawy fizyczne zmalały. Zaobserwuj jak reagujesz fizycznie. Jaka jest twoja koordynacja, jaka zdolność chodzenia i mówienia? Zauważyłem, że funkcje lewej półkuli mózgu - związane zazwyczaj z konkretnymi, analitycznymi procesami myślenia - stają się trudniejsze do przeprowadzenia wraz z rosnącymi dawkami psychedelików. Czy możesz przeprowadzić proste zadania matematyczne? Czy masz kłopoty w wyrażaniu pomysłów za pomocą mowy? Czy możesz udzielić wskazówek jak trafić do znajomego miejsca? Jak szybko wszedł trip? Jak długi jest "natłok"? Ile minęło przed rozpoczęciem schodzenia psychedelicznej części tripu? Uważam, że efekty dragu trwają nie dłużej jak sześć do ośmiu godzin, lecz jak zwiększyłem dawkę lub moc grzybów, trip nadszedł szybciej, natłok trwał nieco dłużej a psychedeliczna część rosła stopniowo od zaledwie 30 minut aż do pięciu lub sześciu godzin. Przez ponowne ocenienie swego tripu w miarę postępu, stosując pewne kryteria oceny, jak opisano w powyższych punktach, możesz dokładnie zaobserwować przebieg tripu i przewidzieć jego długość oraz intensywność. Przy ustalaniu subiektywnego punktu odniesienia dla twych tripów, ważne by znormalizować nastawienie i otoczenie (set and setting) swego tripu, tak by zminimalizować skutki takich zmiennych na trip. Spróbuj badać go w tym samym otoczeniu, najlepiej o tej samej porze dnia. Nie badaj tripu klasyfikacyjnego jeśli jesteś w negatywnym nastroju. Mój przyjaciel poleca jogging, lub inne ćwiczenia aerobikowe, pomagające uwznioślić i ustabilizować nastrój. Grzyby podczas oceniania najlepiej przyjąć na pusty żołądek, ponieważ różne pokarmy wpłyną na naturę tripu. Pokarm w żołądku spowolni również wchłanianie psilocybiny i sprawi wrażenie, że wzięło się mniej. Jeśli korelujesz informację o stężeniu z testu obiektywnego z intensywnościami subiektywnymi, upewnij się, że zawsze stosujesz tę samą ilość grzybów. Przekonałem się, że do testu wystarczył jeden gram. Zazwyczaj nie wystarczyło to by wysłać mnie na pełnoobjawowy trip, lecz wystarczyło by zaobserwować wszystkie psychedeliczne przejawy, zwłaszcza jeśli zamknąłem oczy i wetknąłem słuchawki i ćwiczyłem techniki medytacyjne, które znam. Określiwszy subiektywnie swe próbki grzybowe jesteś na dobrej drodze do zaplanowania enteogenicznego, lub ekstatycznego tripu, ponieważ wiesz ile wziąć na pożądane doznanie. Nacisk tych artykułów celowo jest ograniczony na wykorzystanie grzybów do bardziej introwertycznych i duchowo rozwijających doznań psychedelicznych. To prawda, że wiele przygotowań, technik uprawy a nawet pewnych sugestii na kierowanie energii doznania (późniejszy artykuł) może stosować się do tripów, które skupiają się na relacjach międzyludzkich, a nawet dla tych, którzy chcą jedynie zabawy na popołudnie, lecz dla tych nieenteogenicznych doświadczeń nie będziesz musiał tak ciężko pracować. Moja przeszłość z psychedelikami, a przede wszystkim z "magicznymi grzybami", pokazała mi, że najwyższej jakości doznanie grzybowe i stany świadomości przychodzą z trudem i planowaniem między tripami a także z olbrzymim przypływem tęsknoty podczas aktualnego tripu. Zmiana w świadomości wymaga najwidoczniej wysiłku i czasu. Im intensywniejsza koncentracja wysiłku i pragnienia takiej zmiany, tym szybsza jest zmiana w świadomości. Następna część może być zbędna dla twych potrzeb jeśli nie skłaniasz się ku tej obiektywnej ocenie swych grzybów. Lecz nawet jeśli zdecydowałeś nie robić żadnych testów chemicznych grzybów, omówienie to może pomóc ci zrozumieć znaczenie wartości, które opiszę w nadchodzących artykułach o środowiskowych i odżywieniowych wpływach na wzrost i produkcję psychedelicznej tryptaminy w Psilocybe cubensis. Więc zachęcam do przeczytania przynajmniej ogólnej teorii i soma rights re-served 5 od 26.03.2015 na http://www.psilosophy.info/
interpretacji wyników testu. Dla tych, którzy chcą wykonać swe własne oceny chemiczne, faktyczna procedura testowa znajduje się pod koniec artykułu. Testowanie obiektywne Ogólna teoria i różne schematy wykrywania i mierzenia Wyniki testu obiektywnego mogą dać wartość liczbową mówiącą ile, a w przypadku niektórych testów, co, jest w grzybie. Można znaleźć wartość względnego stężenia lub wartość stężenia absolutnego. Jeśli ma się dostęp do czystych tryptamin psychedelicznych wówczas można wywieść stężenie absolutne przez zmierzenie dokładnie odważonych ilości czystej próbki a następnie porównanie tego wyniku z wartością otrzymaną z próbki nieznanej. Jeśli nie ma się czystej próbki to nie ma znaczenia, ponieważ wyniki testu liczbowego wskażą, że jedna próbka posiada więcej mierzonej tryptaminy niż inna, oraz w jakim stopniu ma większe stężenie. Te liczbowe lub obiektywne wyniki testu bardzo pomagają przekazać względną moc różnych partii grzybów temu, kto może mieć odmienną interpretację subiektywną niż ty. Każdy pojedynczy związek chemiczny zachowuje się inaczej od pozostałych związków, ze względu na swą unikalną strukturę. Na podstawie unikalności każdego związku, możliwe są testy obiektywne. Jeden z rodzajów testowania obiektywnego opiera się na unikalnym pochłanianiu określonych długości fal światła pochłanianego przez każdy związek chemiczny. Innymi słowy, każde chemikalium posiada inny kolor, choć "kolor" zazwyczaj nie znajduje się w spektrum widzialnym. Kolejnym aspektem każdego związku chemicznego stosowanego często w opracowywaniu procedury testowej jest to, że będzie on oddziaływał lub reagował z innymi związkami zupełnie inaczej. Rycina 1 - ukazuje pochodne indolu-tryptaminy. Podobieństwa między związkami naturalnie występującymi w ciele a związkami halucynogennymi dają efekt psychedeliczny. soma rights re-served 6 od 26.03.2015 na http://www.psilosophy.info/
Testy mogą być rozwijane, co także oparte jest na podobieństwie różnych związków przy zrozumieniu, że powiązana część cząsteczki będzie reagować podobnie. Na przykład, w grzybach enteogennych istnieje kilka aktywnych składników cząsteczkowych, lecz najważniejszy składnik obejmuje ogólną rodzinę cząsteczek zwanych tryptaminami. Wszystkie te tryptaminy mają w swym układzie cząsteczkowym wspólny pierścień indolowy. Testy zostały opracowane by pokazać, czy ten pierścień indolowy (jako część większej cząsteczki tryptaminowej) obecny jest w roztworze i w jakim stopniu. Kilka rodzajów testów dostępnych naukowcom obejmuje spektrofotometrię, kolorymetrię oraz chromatografię. Spektrofotometria mierzy stopień do jakiego badana cząsteczka pochłania światło o określonych długościach fal. Lecz ponieważ większość cząsteczek organicznych najlepiej pochłania w paśmie podczerwonym lub ultrafioletowym a przyrządy te są drogie dla przeciętnego hobbysty, nie zająłem się tymi technikami. Chromatografia jest techniką, która oddziela mieszaniny związków poprzez przepuszczenie mieszaniny w roztworze przez specjalnie przygotowane podłoże (sorbent) z wysokorafinowanego piasku, zwanego "żel krzemionkowy" ("silica gel"). Żel krzemionkowy jest najpowszechniej stosowanym sorbentem, lecz można zastosować inne, mniej powszechne sorbenty. Mieszanina różnych cząsteczek różnie oddziałuje z cząsteczkami na powierzchni żelu krzemionkowego podczas przechodzenia, zmniejszając tym samym ich ruch w większym lub mniejszym stopniu. Po przemieszczeniu się przez żel krzemionkowy na pewną odległość, mieszanina związków rozdziela się na oddzielne pasma czystych związków. Chromatografia obejmuje ogólnie dwie metody, w zależności od przyrządu stosowanego z żelem krzemionkowym do oddzielenia próbki - chromatografia cienkowarstwowa (TLC - thin layer chromatography), oraz chromatografia kolumnowa, z której kolejną techniką tej podgrupy, powszechnie stosowaną w laboratoriach jest wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa (HPLC - high pressure liquid chromatography). Jak nazwa wskazuje, w TLC, cienka warstwa żelu krzemionkowego nakładana jest na szklaną lub plastikową płytkę po czym przy spodzie płytki nasmuża się lub nakrapia próbkę. Płytka jest następnie wkładana do szklanego pojemnika, do którego zostaje wlana niewielka ilość określonej mieszanki rozpuszczalnika, ustalonego eksperymentalnie. Żel krzemionkowy, będąc porowatym, pozwala działaniu kapilarnemu podciągnąć rozpuszczalnik, co również wciąga próbkę. W miarę poruszania się próbki, każdy czysty związek chemiczny w mieszaninie porusza się w różnym stopniu powodując tym samym rozdzielenie na smugi cząsteczek czystego składnika mieszaniny próbki. Różne techniki umożliwiają uwidocznienie każdego z czystych pasm chemicznych. soma rights re-served 7 od 26.03.2015 na http://www.psilosophy.info/
Rycina 2 - ukazuje odwzorowanie procesu TLC (Chromatografia cienkowarstwowa). Ta metoda analizy wzrokowej pozwala na porównanie ze sobą związków chemicznych obecnych w grzybie. Dla danego sorbentu lub rozpuszczalnika, konkretny związek (np. tryptamina psychedeliczna) zawsze przemieści się w górę płytki TLC o tę samą względną odległość w porównaniu do odległości, na jaką wespnie się na płytce rozpuszczalnik. Na przykład pewnego razu, badacz pozwolił rozpuszczalnikowi na płytce TLC powstawać przez godzinę a rozpuszczalnik przemieścił się wzwyż o 10 cm. Po zastosowaniu chemicznego barwnika albo lampy UV do wykrycia chromatograficznych plamek, stwierdził, że plamka, którą był najbardziej zainteresowany przemieściła się wzwyż płytki o 5 cm lub o połowę drogi między punktem startu a frontem rozpuszczalnika. Kolejnym razem, pozostawił płytkę jedynie na 45 minut a rozpuszczalnik przesunął się jedynie 8 cm. Ponieważ wiedział, że Rf (skrót odnoszący się do względnej odległości przemieszczenia czystego związku wzwyż płytki TLC) wynosi 0,5, więc w tych samych warunkach dla tego samego związku, obszar zainteresowania przesunie się o połowę drogi wzwyż płytki lub o 4 cm. I tak było w praktyce. Dla większości związków, literatura doświadczalna będzie zazwyczaj posiadać wartości tej względnej odległości, które zazwyczaj są mniejsze niż 1,0 (Rf wynoszące 1,0 wskazuje, że związek pokonał z rozpuszczalnikiem całą drogę wzdłuż płytki; dlatego jego względna odległość, porównana do odległości, którą pokonał rozpuszczalnik wyniesie 1,0). Po separacji TLC łatwo zauważyć, czy określony związek jest obecny poprzez odszukanie pasma, które występuje na właściwej odległości wzwyż płytki. Intensywność koloru pasma wskaże stężenie związku, lub można tak naprawdę zeskrobać pasmo z płytki i pomierzyć niemal czysty związek jakimiś innymi dostępnymi technikami. HPLC (lub wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa) jest formą chromatografii kolumnowej. Próbka jest nakładana na wierzch kolumny z sorbentem mającej wysokie ciśnienie, następnie poprzez kolumnę pompowany jest rozpuszczalnik pod wysokim ciśnieniem (zazwyczaj 1000 psi lub większym). Na drugim końcu kolumny spektrofotometr monitoruje rozpuszczalnik na rzecz absorpcji wskazującej wychodzenie z kolumny związku organicznego. Eksperymentator może odczytać wynik z fotometru widmowego na wykresie wyjściowym lub na ekranie video. Obszary pod szczytami, które reprezentują każdą odrębną cząsteczkę są proporcjonalne do stężenia. Mając próbki czystych tryptamin, można obliczyć całkowite stężenie badanych związków. Rozpuszczalnik HPLC jest pompowany przez kolumnę dopóki większość próbki nie zostanie wymyta. Zamiast odległości pokonywanej poprzez żel krzemionkowy, tak jak w TLC, do określenia cząsteczki, stosowany jest czas potrzebny do wymycia związku z kolumny nim zostanie wykryty przez spektrofotometr. Jeśli poczytasz literaturę techniczną zauważysz, że często wspomina się o HPLC. Jego przewagą jest o wiele większa czułość i zdolność do przeanalizowania o wiele większej ilości związków, które mogą być obecne w nieznanej próbce. Jego wadą jest koszt. Przeciętny zestaw HPLC może kosztować 10.000$. Podczas gdy do wykonania TLC, prawie wszystko, czego potrzeba, można kupić za około 100$ do 200$. Co prowadzi nas do ostatniej powszechnej techniki wykrywania, a wybranej do większości mych badań - kolorymetrii. Kolorymetria jest podobna do spektrofotometrii pod tym względem, że roztwór próbki pochłania światło o określonej długości fal a długość fali i stopień pochłaniania może wiele powiedzieć o próbce. Lecz w kolorymetrii, światło absorbowane i wynikający kolor mierzony roztworu leży w spektrum widzialnym. Także, ponieważ punkty szczytowe absorpcji pokrywają znacznie szerszy zakres długości fal niż tylko regiony ultrafioletowe (UV) lub podczerwone (IR), stosowany spektrofotometr może być o wiele mniej czuły i może wykorzystywać zgrubniejsze metody rozszczepiania spektrum światła do naświetlenia próbki. Przyrząd stosowany w kolorymetrii nie nazywa się "spektrofotometr", lecz "kolorymetr", i może wykorzystywać filtry, zamiast o wiele droższego monochromatoru z siatką dyfrakcyjną, stosowanego w spektrofotometrach. Sztuczką w kolorymetrii jest wyraźne pokolorowanie próbkowanej cząsteczki, która normalnie nie pochłania spektrum widzialnego (tj. 400 do 700 nanometrów, co jest długością fali światła od najgłębszych czerwieni do najsłabszych fioletów). Chemicy odkryli, że istnieją cząsteczki, które same w sobie są bezbarwne lecz połączone z niektórymi innymi cząsteczkami tworzą kolor. Związki te nazywają się "chromoforami", obecność koloru wskazuje, że testowana cząsteczka obecna jest w roztworze a intensywność koloru mówi ile znajduje się w nim związku chemicznego. soma rights re-served 8 od 26.03.2015 na http://www.psilosophy.info/
Problemem przy kolorymetrii jest to, że większość chromoforów nie łączy się konkretnie z unikalną cząsteczką lecz z częścią cząsteczki poddanej testowi. Na przykład, w teście, który stosowałem w moich badaniach, chromofor reagował z pierścieniem indolowym tryptamin psychedelicznych, tworząc kolor niebieski lub fioletowawy. Pierścienie indolowe nie są specyficzne dla tryptamin psychedelicznych. Istnieje wiele cząsteczek innych niż tryptaminy psychedeliczne, które posiadają pierścienie indolowe. I by dalej pokomplikować sprawy, chromofor zareaguje z innymi skupiskami zawierającymi azot, choć bez zwyczajowego zabarwienia niebieskiego lub purpurowego. Wynik netto może być mieszaniną koloru, który w mniejszym lub większym stopniu pokrywa się z konkretną długością fali, lub kolorem, który postrzega kolorymetr. Kolorymetr jest niemy; nie zna różnicy między wchłanianiem przy 570 nanometrach, które powodowane jest przez mocz albo psilocybinę albo przez oba po trochu. Ogólnie, nieaktywne związki posiadają absorbancje wystarczająco oddalone w widmie świetlnym, tak że nie kolidują z odczytami tryptaminy psychedelicznej, lecz nie zawsze tak jest. W późniejszej części omówię tę interferencję i jak to się ma do interpretacji wyników testu. Teoria spektrofotometryczna mówi nam, że mierzona absorbancja związku jest bezpośrednio związana z jego stężeniem w roztworze. Innymi słowy, gdy wzrasta absorbancja tak i stężenie. Jeśli przetestujemy jednego grzyba pod kątem aktywnych tryptamin i stwierdzimy, że ma absorbancję 0,6 a następnie przetestujemy kolejnego i stwierdzimy, że ma absorbancję 0,9, możemy powiedzieć, że ten drugi posiada większe stężenie tryptamin niż ten pierwszy. Pewnie, że nie znamy całkowitego stężenia w mg/gram psilocybiny/psylocyny, ale co tam? W naszym własnym doznaniu subiektywnym spokojnie możemy odnosić się do A 0,6 jak do 2 mg/gram. Spis Tresci Co jest w grzybie? Co mierzymy? Ze względu na możliwość wystąpienia niejasności w wynikach testu przez wielorakie reakcje barwne chromoforu, wskazanym może być przejrzenie literatury w celu zobaczenia jakie składniki Psilocybe cubensis inni stwierdzili w swych badaniach. Niektóre z tych innych związków naturalnych zareagują z testem i nadłożą wartość testu chociaż nie są tryptaminami aktywnymi. A pozostałe są tryptaminami aktywnymi, które ze względu na swą nieco odmienną aktywność psychologiczną mogą znacznie zmodyfikować trip na lepsze lub na gorsze. Także musimy się dowiedzieć czym one są. Jeśli chodzi o aktywne tryptaminy w grzybie, dwoma o największym stężeniu w Psilocybe cubensis są oczywiście psilocybina i psylocyna 13 str. 109. "Pochodne tryptaminy" nazywane są tak ze względu na ich podobieństwo do serotoniny. Klasa ta posiada grupę INDOLOWĄ oraz grupę DIMETYLAMINOWĄ. Pochodne tryptaminy obejmują substancję przekaźnika mózgu, serotoninę, niezbędny aminokwas, tryptofan, szybko działający lecz krótko trwający psychedelik, DMT, i oczywiście psylocynę i psilocybinę. "Tryptaminy aktywne" odnoszą się do różnych tryptamin psychedelicznych, wliczając psilocybinę, psylocynę oraz wszystkie ich analogi. Zobacz przykłady różnych tryptamin na rysunku 1. Repke wskazuje, że jakiekolwiek wykrycie psylocyny w próbkach grzyba, może być w rzeczywistości spowodowane hydrolitycznym oddzieleniem grupy fosfatowej od cząsteczki psilocybiny podczas obchodzenia się z próbką i przy jej przygotowywaniu 14. W rzeczywistości, z łatwością mogą powstać inne analogi poprzez różne układy enzymów i przez obecność tlenu. Próbowałem zwrócić na to uwagę w pierwszym artykule gdzie podkreśliłem ważność niskiej temperatury przy suszeniu próżniowym podczas przygotowywania grzybów do przechowywania lub ostrożności wymaganej przy przygotowywaniu grzybów do spożycia, gdyż to te analogi i produkty rozpadu powodują najprawdopodobniej bóle głowy, zachmurzenie mentalne oraz obolałość, nie będące normalnymi efektami ubocznymi psilocybiny syntetycznej. Większość wzmianek w literaturze, które czytałem stwierdzało, że w grzybach było mało psylocyny. Mogli nie być w stanie znaleźć żadnej psylocyny przez psilocybinę, ponieważ jest to artefakt lub być może ze względu na łatwość, z jaką psylocyna się utlenia. Jednak w pracy Bigwooda i Beuga stwierdzono, że po drugim płukaniu poziomy psylocyny są znacząco wysokie. W rzeczywistości, wahają się od około dziesięciu do trzydziestu procent całkowitego stężenia (psilocybiny i psylocyny w tej pracy) aktywnych tryptamin 4. soma rights re-served 9 od 26.03.2015 na http://www.psilosophy.info/
Baeocystyna, będąca kolejnym psychedelicznym analogiem psilocybiny i psylocyny, odgrywa najwyraźniej ważną rolę w naturalnej biosyntezie psylocyny i psilocybiny w grzybach, i obecna jest w małych, lecz istotnych ilościach w Psilocybe cubensis. W oparciu o różne próbki, badane w przytaczanej literaturze, zakres waha się od 0,001% do 0,02% baeocystyny w suchej próbce grzyba. Repke i inni stwierdzili, że baeocystyna nigdy nie była znajdowana w grzybach, które nie zawierały już także psilocybiny. Wyjaśniając to w odpowiedniej perspektywie, psilocybina składa się zazwyczaj na jeden procent suchej masy grzyba. (W obecności odczynnika Ehrlich'a, który podobny jest do odczynnika testowego, który opisuję pod koniec tego artykułu, baeocystyna tworzy reakcję kolorystyczną od różowego poprzez fioletowy do niebieskiego.) 14 Badacze Beung i Bigwood stwierdzili dzięki swej pracy z TLC, że mogą wyizolować na płytce żelu krzemionkowego 12 odrębnych miejsc (tj. różnych związków). Poza psilocybiną, psylocyną i baeocystyną, ich wstępny wniosek mówi, że inne miejsca reprezentują N-metylowe i tryptaminowe analogi psylocyny i psilocybiny 3. Kolejną tryptaminą znalezioną w grzybach jest tryptofan 9. Zareaguje on z odczynnikami testowymi w podobnym kolorze, co psylocyna i wskutek tego przyda niewielką ilość absorbancji każdemu wynikowi testu, dając nieco błędnie podwyższony odczyt. Test, który wykorzystywałem do określenia ilości psilocybiny i psylocyny w grzybach Psilocybe cubensis reaguje z innymi związkami zawierającymi azot, choć najbardziej wyczulony jest na związki zawierające indol, gdy odczytywany jest przy zalecanych długościach fali 10. Jednym z takich związków zawierających azot, obficie występującym w grzybach jest powszechny aminokwas, glicyna. 18. Kolejnym stwierdzonym w grzybie związkiem na bazie azotu jest mocznik. Zmiana testu na kolor żółty wskazuje obecność jednego z tych wszechobecnych związków. Na szczęście, żółty przydaje jedynie niewielką ilość absorbancji do wartości tryptamin aktywnych gdy odczytywany jest przy 570 nm, testowej długości fali 3. Casale wspomina w przeglądzie literatury, że w metanolowych wyciągach z grzybów psilocybe znalezione także zostały, poza wspomnianymi już związkami, ergosterol, nadtlenek ergosterolu oraz a,a-trehaloza 5. Nie mogłem znaleźć żadnej innej wzmianki w literaturze o innych analogach tryptaminy, toksynach, enzymach lub hormonach, które mogą być obecne w Psilocybe cubensis i wpływać tym samym na doznanie subiektywne. Agurell, Blomkvist i Catalfomo 1 określili dość długą listę możliwych metabolitów tryptofanu, które mogą występować w grzybach psilocybe: 6-hydroksytryptofan; kinurenina; tryptofan; kwas kinureninowy; kwas ksanturenowy; psylocyna; tryptamina; metylotryptamina; dimetylotryptamina; kwas 3-hydroksyantranilowy; kwas antranilowy; N-acetylotryptofan; oraz kwas indolooctowy. Agurell i Nilsson 2 zademonstrowali w swej pracy wstępny szlak biosyntetyczny psilocybiny dla jakiego w grzybach mogą również występować dowolne ze związków pośrednich. Szlak syntetyczny postępuje od tryptofanu poprzez tryptaminę, N-metylotryptaminę, N,N-dimetylotryptaminę, psylocynę do psilocybiny. W tym samym lub w innym czasie w Psilocybe cubensis można znaleźć jakiekolwiek i chyba wszystkie prekursory psilocybiny. Niektóre mogą być przyczepione do białek lub enzymów, które mogą je związać dla jakiejkolwiek reakcji chemicznej lub asymilacji w ciele. Konsekwencją obecności wszystkich tych nieaktywnych tryptamin lub związków zawierających azot, które reagują z odczynnikiem testowym jest sztuczne podwyższenie absorbancji lub pozornej koncentracji. Przy testowaniu, zmiana w absorbancji zupełnie nie koniecznie oznacza zmianę w stężeniu aktywnej tryptaminy (tj. psilocybiny/psylocyny). W niektórych szybkich i łatwych testach na zakres, lub nie usposobionych technicznie. Prosty test opisany w High Times na określenie czy nie nabyło się przypadkowo grzybów zaprawianych LSD to rozgnieść grzyba w jakimś metanolu i dać mu poleżeć przez noc. Następnego dnia przelać metanol i potrzymać ekstrakt pod światło UV. Jeśli płyn świeci na niebiesko, wówczas masz grzyby zawierające LSD, które z tego, co wiem, nie istnieją 17 str. 252. Norland opisuje kilka testów kolorymetrycznych, które można zastosować do zidentyfikowania grzybów, które zawierają pochodne tryptaminy 13 str. 116. Możesz stwierdzić, że są bardziej użyteczne niż dłuższa i bardziej skomplikowana procedura testowa, opisana pod koniec tego artykułu. Nie potrzebujesz kolorymetru dla wyników testu i jeśli potrafisz przeżyć ze wzrokowym porównaniem koloru i swą pamięcią, możesz przynajmniej oszacować różnice stężeń między grzybowymi rzutami. 1. Prostym testem na związki zawierające indol i tryptaminy jest pokruszenie małego kawałka grzyba do 15 gram wódki lub alkoholu etylowego (dobry jest "spirytus denaturowany" lub rozcieńczalnik ze sklepu z art. metalowymi) i wymieszanie. Dodanie 3-4 kropli kwasu chlorowodorowego (lub rodzaju ze sklepu z art. metalowymi o nazwie "kwas solny"), następnie wkroplenie sosnowego płynu po goleniu zmieni, przy soma rights re-served 10 od 26.03.2015 na http://www.psilosophy.info/
obecności indoli, kolor na "fioletowo różowo czerwony" (ang. "cheny red"). 2. Kolejny test na indole stosuje mały pokruszony kawałek grzyba w 15 g albo metanolu albo etanolu (lub wódki). Jeśli zainteresowany jesteś testem na psilocybinę zastosuj metanol; jeśli psylocynę zastosuj etanol lub wódkę. Różnica w rozpuszczalności między tymi dwiema aktywnymi tryptaminami odpowiada różnicy w zastosowanych rozpuszczalnikach. Dobrze wymieszaj, następnie przefiltruj. Pozwól przez noc odparować lub zastosuj łaźnię parową lub suszarkę do włosów w celu osuszenia. Umieść pozostałość na bibule filtracyjnej i pozwól wyschnąć. Napryskaj lub nakropl poniższy wywoływacz. Aby test zadziałał skutecznie, wywoływacz musi być przygotowany na świeżo. By przygotować wywoływacz, dodaj jedną kroplę 37% formaldehydu do 15 kropli stężonego kwasu siarkowego. Psylocyna powinna zmienić kolor na zielony do czarnego podczas gdy psilocybina na żółty do zielonożółtego; zielony jest normalnie. Pomarańczowo-brązowy wskazuje amfetaminy lub LSD. 3. Odczynnik Ehrlich'a to nazwa mieszanki stosowanej do wykrywania związków indolowych, które zostały wyodrębnione na płytce TLC. Po napryskaniu testowanego roztworu na płytkę, w miejscu gdzie leży taki indolopodobny związek formują się kolorowe plamki. Odczynnik zrobiony jest z 5% dimetyloaminobenzaldehydu (w skrócie DMAB) w stężonym kwasie chlorowodorowym (HCl) 9. Kolejną odmianą odczynnika Ehrlich'a jest 2% DMAB w HCl-etanolu (1:1). Odczynnik ten nadał następujące zmiany koloru: psilocybina zmieniła kolor na czerwonawo-fioletowy następnie wyblakła do fioletowego podczas gdy psylocyna dała mocny kolor niebieski, który wyblakł do fioletu 18. 4. Jeśli zainteresowany jesteś wykonaniem testowej procedury TLC, zapoznaj się z różnymi układami rozpuszczalników u Leunga, Smitha i Paula, które można zastosować do wyodrębnienia składników grzyba. Będziesz mógł również wykorzystać informacje o oczekiwanych względnych odległościach (wartościach Rf), które pokona psylocyna i psilocybina wzwyż płytki dla każdego układu rozpuszczalnika. Informacja ta, plus odczynnik testowy w rodzaju Ehrlich'a, pomoże ustalić, czy w testowanych grzybach obecna jest psilocybina, psylocyna czy obie 9. Przekonałem się, że przy moim stosowaniu TLC najlepiej działał system rozpuszczalnika, którego używali w swych badaniach Beung i Bigwood. Okazało się, że mogli oni otrzymać największą rozdzielczość większości plamek dzięki zastosowaniu dla krzemowych płytek żelowych rozpuszczalnikowej mieszanki n-butanolu + kwasu octowego + kwaśnej wody (12:3:5) 3. Gdy stosowałem ten rozpuszczalnik przekonałem się, że jego proporcje dobrze się mieszają. W innej literaturze proponuje się mieszanki rozpuszczalników, które po wstrząśnięciu nie są jednorodne, lecz zamiast tego szybko separują się w dwie warstwy, czyniąc te mieszanki rozpuszczalników trudnymi do zastosowania w TLC. W mych własnych separacjach, do wykrywania stosowałem światło UV oraz fluorescencyjną wersję płytek TLC. Nie miałem dostępu do rozpylacza mgiełkowego, który jest wymagany przy stosowaniu odczynnika Ehrlich'a. Mogłem odróżnić jedynie sześć plamek, w przeciwieństwie do dwunastu, które stwierdzili Beung i Bigwood gdy stosowali oba schematy detekcji (tj. odczynnik Ehrlich'a i lampę UV). W kolejnej procedurze testowej przygotowałem papierek wskaźnikowy, który może wykryć obecność związków indolowych, poprzez zastosowanie p-dmab (para-dimetoksybenzaldehydu) jako odczynnika detekcji lub chromoforu. Chociaż papierek nie jest czuły na niskie poziomy indoli, stwierdziłem, że jest użyteczny do szybkich kontroli ekstraktów grzybowych na obecność psilocybiny/psylocyny. Spis Tresci Test bibułowy p-dmab 1. Dodaj 1,0 gram p-dmab do 28 ml etanolu (denaturowanego). Mieszaj aż się rozpuści. 2. Do powyższej mieszanki dodaj wodę aż osiągniesz całkowitą objętość 60 ml. 3. Namocz w tym roztworze trochę bibuły filtracyjnej i pozwól całkowicie wyschnąć. By przyspieszyć suszenie można wykorzystać suszarkę do włosów, lecz nie stosuj zbyt gorącego powietrza. Gorąco zniszczy p-dmab i w konsekwencji przydatność papierka wskaźnikowego. Papierek przechowuj w szczelnym słoiku w lodówce. 4. W celu zastosowania papierka dodaj na niego kroplę wyekstrahowanej próbki i pozwól wyschnąć. Potrzymaj papierek wskaźnikowy nad wlotem butelki stężonego kwasu chlorowodorowego. Opary szybko wywołają kolor fioletowawy/niebieski. Jeśli opary nie wywołają koloru, spróbuj dodać na papierek soma rights re-served 11 od 26.03.2015 na http://www.psilosophy.info/
w pobliżu miejsca z próbką, kroplę kwasu chlorowodorowego. W miarę wnikania kwasu chlorowodorowego w papierek wskaźnikowy i zbliżania się do próbki, wytworzy się kolor fioletowy lub niebieski jeśli próbka jest pozytywna pod względem związków indolowych. Teoria testu kolorymetrycznego referencyjnego W poprzednich ustępach nakreśliłem generalne parametry testowania kolorymetrycznego a w ostatnim ustępie wymieniłem procedury dla kilku testów, które są łatwe do zorganizowania i odczytu. Test, który wybrałem do zmierzenia zawartości aktywnych tryptamin w różnych próbkach eksperymentalnych z ostatnich czterech lat oparty jest na reakcji kolorystycznej z paradimetyloaminobenzaldehydem (p-dmab). DMAB jest powszechnym składnikiem odczynnikowym w kilku innych testach wspomnianych powyżej, wliczając test Ehrlich'a. W celu ponownego przeglądu ogólnego testu kolorymetrycznego, indolowa część tryptamin reaguje z DMAB w roztworze sprzyjającym doprowadzeniu reakcji do końca, wytwarzając tym samym kompleks barwny, który może zostać zwizualizowany lub odczytany kolorymetrem lub spektrofotometrem. Intensywność koloru (tj. absorbancja) jest proporcjonalna do stężenia zawartości tryptamin w roztworze. W literaturze, zastosowanie tego testu jest powszechne w nieco innych formatach. Test, który opracowałem do mierzenia związków indolopodobnych, psilocybiny i psylocyny, był początkowo stosowany w nieco zmodyfikowanej formie do mierzenia alkaloidów sporyszu 16. Kwas lizergowy i winian ergotaminy są pochodnymi sporyszu - oba są prekursorami LSD i innych farmaceutyków i mogą być testowane za pomocą DMAB. Poza bardziej czułymi lecz bardziej złożonymi procedurami testowymi HPLC (wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa), różni badacze stosowali różne środki do ilościowego określenia psilocybiny i psylocyny. Leung i Paul stosowali ilościową metodę TLC (chromatografia cienkowarstwowa), w której najmniejsza ilość chemicznie czystej psilocybiny powodującej reakcję z odczynnikiem Ehrlich'a (5% roztworem p-dmab w kwasie chlorowodorowym) była porównywana z najmniejszą ilością próbki testowej z ekstraktowanej tkanki grzyba, potrzebną do wywołania zmiany koloru. Zakłada się, że w obu przypadkach stężenie psilocybiny jest równe, a następnie, znając ilość wyekstrahowanego grzyba, wylicza się procentowe stężenie psilocybiny w grzybie 11. Inne potencjalne chromofory Test nie musi być ograniczony do DMAB jako chromoforu. Chociaż w następującej procedurze testowej i w całej literaturze technicznej, jako środek wywołujący kolor stosowany był para-dimetyloaminobenzaldehyd, wykorzystany może być kolejny związek chemiczny, paradimetyloaminoaldehyd cynamonowy. Ten konkretnie środek wywołujący dostarczy o wiele bardziej intensywnego koloru niż DMAB i wskutek tego będzie bardziej czuły. Ta dodatkowa czułość może być konieczna jeśli stosujesz bardziej prymitywny kolorymetr z szerokim filtrem pasmowym (tj. więcej niż 30 NM). Zamiast akceptowalnego odczytu długości fali 570 nm stosowanego dla testu DMAB, powinieneś zastosować 625 nm dla para-dimetyloamino aldehydu cynamonowego 15. Lecz przy większości zastosowań ta zwiększona czułość spowoduje powstanie zbyt ciemnego koloru reakcji, dlatego będzie ciężka do odczytania na skali kolorymetru. Jeszcze jednym odczynnikiem stosowanym podobnie do DMAB (odczynnik Erlich'a) jest odczynnik Pauley'a. Odczynnik ten wykorzystuje diazotowy kwas sulfanilowy. Jest on bardziej szczegółowy niż DMAB w tym, że nie reaguje z psilocybiną lub mocznikiem, lecz tylko z psylocyną, dając głębszy kolor czerwono pomarańczowy 18. (Nie mam szczegółów w jakiej długości fali mierzyć kolor tej reakcji.) Właściwa długość fali do pomiaru chromoforu DMAB Kilku badaczy stosowało DMAB w swym teście kolorymetrycznym i generalnie długość fali, jaką zwykle odczytywali dla związków zawierających indol wynosiła 570 nm. Spektrofotometryczny szczyt zarówno psilocybiny jak i psylocyny po zareagowaniu z DMAB jest wystarczająco szeroki, że można zastosować inną długość fali bliską 570 nm bez wpływania na czułość testu. Może być to ważne jeśli stosuje się kolorymetr soma rights re-served 12 od 26.03.2015 na http://www.psilosophy.info/
filtrowy a dostępne filtry nie obejmują konkretnej długości fali 570 nm. Na rysunku 3 przedstawiłem wykres absorbancji spektralnej na pozytywny test DMAB dla jakiegoś proszku grzybowego. Odczyty transmitancji przyjąłem co każde 10 nm, od 400 nm do 610 nm a następnie przekonwertowałem wartości transmitancji na absorbancję, którą później wykreśliłem. Najlepsza długość fali do odczytu testu kolorymetrycznego leży zazwyczaj na jednym ze szczytów absorbancji. Jak widać, bazując na tym kryterium, test można odczytać na więcej niż jednej długości fali. Kolejne możliwe maksimum absorbancji prócz orientacyjnego szczytu 580 nm jest na szczycie 550 nm. Istnieje prawdopodobieństwo, że te dwa szczyty reprezentują psylocynę i psilocybinę. Duży szczyt w okolicy 410 nm może być drugim szczytem dla psilocybiny, który jest zazwyczaj widoczny jako fioletowy - kombinacja czerwonego i niebieskiego. Analizując wykres pamiętaj, że przedstawia on absorbancję spektralną a nie transmitancję. Dlatego dla koloru niebieskiego, szczytu absorbancji można szukać w obszarze czerwonym spektrum (tj. w pobliżu 600 nm). Rycina 3 - ukazuje spektrum p-dmab testowych reakcji. Test ten uwzględnia reakcje kolorowe, które przedstawiają ilości konkretnych związków chemicznych przy porównaniu. Światło przyspiesza reakcję testu Zarys zasady testu, który tu prezentuję, odkryłem w pracy Agurella, Blomkvista i Catalfomo 1. W pracy tej zasugerowali wykorzystanie światła UV, które przyśpieszy reakcję z chromoforem DMAB. Krok ten zastąpiłem dając reakcji rozwijać się w świetle fluorescencyjnym przez dłuższy okres czasu. Nawet po tym, reakcja kontynuuje rozwój przez 24 godziny po zapoczątkowaniu. Badacze wspomnieli również o stworzeniu krzywej kalibracyjnej, która może okazać się przydatna. Lecz badacze ci nie tylko ekstrahowali psilocybinę lecz przed przetestowaniem próbek oczyszczali ją także do pewnego stopnia. Poprzez wnioskowanie z tej krzywej i poprzez oczyszczenie swego ekstraktu grzybowego możesz być w stanie uzyskać "przybliżone" absolutne stężenie w mg/gram grzyba. Jeśli jesteś zainteresowany, sprawdź odnośnik po więcej szczegółów o oczyszczaniu. (Przyszły artykuł przedstawi procedurę oczyszczania). soma rights re-served 13 od 26.03.2015 na http://www.psilosophy.info/
Reakcja DMAB wymaga przynajmniej trzydziestu minut by osiągnąć plateau wywołania koloru w świetle fluorescencyjnym. Zobacz rysunek 4, który to pokazuje. Ponieważ reakcja faktycznie trwa aż do 24 godzin, będzie trzeba dokładnie zmierzyć czas wywoływania a następnie znormalizować go dla wszystkich testów. Ja stosuję 30 minut, ponieważ w tym czasie zaszły największe zmiany koloru i wolę nie czekać zbyt długo na wyniki. Kolejnym dobrym powodem dla stosowania krótszego czasu wywoływania jest to, że jeśli psylocyna i inne spokrewnione tryptaminy, które są obecne, pozostają w roztworze podczas wywoływania testu, stopniowo się rozkładają, zmieniając tym samym wartość stężenia aktywnych tryptamin. Rycina 4 - ukazuje skalę czasu absorpcji otaczającą test kolorymetryczny. Spis Tresci Określenie rozpuszczalnika ekstrakcyjnego Badacze, Agurell, et al. testowali wyekstraktowaną i trochę oczyszczoną psilocybinę. Nie robili testu na psylocynę. By uniknąć nużącego i długiego przygotowywania próbki, chciałem wyekstraktować, następnie odczytać próbkę grzybową bez oczyszczania. Najlepiej, to chciałem wykorzystać wodny roztwór by uniknąć rozpuszczalników organicznych i by podczas tego samego testu przetestować zarówno psilocybinę jak i psylocynę. Lecz w wodzie psylocyna trudno się rozpuszcza, a psilocybina jest w niej łatwo rozpuszczalna. Ponieważ psylocyna jest szczególnie niestabilna w roztworze zasadowym, uważałem, że jako rozpuszczalnik najlepszy byłby kwaśny roztwór wodny 19. Wiele testów TLC potwierdziło, że roztwór kwas octowy-woda, na który się ostatecznie zdecydowałem, w rzeczywistości, ekstraktuje zarówno psilocybinę jak i psylocynę. By dokładniej wyodrębnić psylocynę i psilocybinę a także, by obniżyć ph, tak by aktywne tryptaminy były soma rights re-served 14 od 26.03.2015 na http://www.psilosophy.info/
stabilniejsze, stosuję roztwór ekstrakcyjny kwasu octowego-wody. Bez kwasu octowego roztwór szybko zareaguje z tlenem atmosferycznym w obecności enzymów endogennych wytwarzając mocno niebieski produkt i niszcząc w tym procesie część psilocybiny/psylocyny. Sam kolor niebieski zaingeruje również w wyniki testu, gdyż reakcja nadaje tryptaminom kolor niebieski lub fioletowy. Konkretnie, psylocyna nada kolor ciemnobrązowo niebieski a psilocybina żółtozielony i fioletowy. Natomiast LSD zareaguje z DMAB tworząc kolor niebiesko fioletowy 17. Najwyraźniej inni również stwierdzili, że rozcieńczony roztwór kwasu octowego jest doskonałym rozpuszczalnikiem dla zarówno psylocyny jak i psilocybiny. Roztwór nie tylko kompletnie ekstraktuje obie tryptaminy lecz także w mniejszym stopniu wyodrębnia inne substancje zakłócające. Casale zauważa również, że jeśli roztwór ekstrakcji rozcieńczonego kwasu octowego podgrzeje się do 70 C przez dziesięć minut, wówczas psilocybina całkowicie przekształci się w psylocynę poprzez defosforylację 5. Przekonałem się na własną rękę, że rozgrzanie roztworu kwasu octowego wyeliminowało jakąkolwiek reakcję niebieszczenia w enzymowo denaturowanym środowisku roztworu ekstrakcji o niskim ph. To że psilocybina jest przekształcana w psylocynę również jest plusem. Oznacza to, że reakcja kolorystyczna utworzy czystszy kolor i dlatego będzie łatwiejsza do zinterpretowania w wynikach testu. Oprócz zmierzenia koloru wywołanego odczynnika gdy się nieco ustabilizuje, ważne jest również zmierzenie próbki ekstrakcji grzybowej tak szybko, jak się da. Rozcieńczony kwas octowy spowalnia rozpad psylocynopodobnych tryptamin lecz nie zatrzymuje całkowicie tego rozpadu. Im dłużej czekasz by wykonać test na swej próbce, tym niższa będzie wartość. Uważam, że rozpad ten wynosi po 20 godzinach średnio 10%. Co ciekawe, im większe stężenie aktywnych tryptamin, jak zmierzono na świeżej próbce, tym większy wpływ czasu na zmniejszenie pozornego stężenia. Waga próbki Do wagi próbki 0,5 grama sproszkowanych grzybów doszedłem poprzez przeprowadzenie testu na czterech masach próbki: 0,2 grama, 0,5 grama, 1,0 gram oraz 1,5 grama. Przy objętości ekstrakcji 20 mililitrów, najlepiej sprawdza się próbka 0,5 grama. Większe próbki grzybów mają tendencję do unoszenia się na powierzchni roztworu ekstrakcyjnego w dużej kolbie testowej i muszą być stale mieszane, tak by proszek pozostawał w roztworze ekstrakcyjnym. Mniejsze ilości proszku grzybowego coraz trudniej dokładnie i precyzyjnie odważyć. Mniejsze próbki dają również mniej koloru w wywołanej reakcji sprawiając, że trudniej je odczytać spektrofotometrem. Inne oddziaływania na test Interesujący, lecz niewyjaśniony wpływ na kolor testu pochodzi od nieznacznej, lecz najwyraźniej znaczącej, zmiany w mej procedurze standardowej. Jeśli przy przygotowaniu materiału grzybowego z jakiegoś powodu zastosowałem rozpuszczalniki i grzybów tych nie wyekstrahowałem, ale potem całkowicie odparowałem rozpuszczalnik pozostawiając początkowy proszek grzybowy pozornie niezmieniony, kolor testu przesunął się do koloru bardziej różowego i w związku z tym zmienił absorbancję z 570 nm. Tę zmianę koloru zauważyłem przede wszystkim gdy stosowałem metanol. Być może metanol reaguje z czymś w grzybie i produkt ten z kolei reaguje z DMAB. Chodzi o to, że z wynikami testu nie mogą być porównane inne wyniki testu, dla którego zmodyfikowało się procedury testowe. Zdrowy rozsądek może podpowiadać, że konkretna modyfikacja może nie mieć znaczenia, lecz w rzeczywistości, modyfikacja ta może drastycznie zmienić wyniki. Bardziej radykalny przykład próby porównania jabłek z pomarańczami miał miejsce podczas testu kolorymetrycznego dla psilocybiny/psylocyny gdy próbowałem wstępnie oczyścić próbkę proszku grzybowego przy pomocy ekstrakcji. Moje ekstrakcje były próbami oczyszczenia proszku grzybowego z nieaktywnych tryptamin. Test kolorymetryczny miał czystszy kolor lecz ponieważ usunięte zostały inne substancje chemiczne, które również reagują z DMAB, całkowita absorbancja spadła, dając natychmiastowe wrażenie, że w próbce proszku grzybowego istnieje nie tyle psilocybiny/psylocyny, ile faktycznie istnieje. soma rights re-served 15 od 26.03.2015 na http://www.psilosophy.info/