WPŁYW ILOŚCI MODYFIKATORA NA WSPÓŁCZYNNIK RETENCJI W TECHNICE HPLC

WPŁYW ILOŚCI MODYFIKATORA NA WSPÓŁCZYNNIK RETENCJI W TECHNICE HPLC 1. WPROWADZENIE Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) Jest uniwersalną metodą analityczną, stosowaną głównie do analiz wieloskładnikowych próbek, zwłaszcza zawierających nielotne, także wielkocząsteczkowe związki chemiczne, a nawet substancje biologiczne czynne. W chromatografii cieczowej fazą stacjonarną, nieruchomą jest zwykle porowate wypełnienie a fazą ruchomą, eluentem ciecz. HPLC różni się od klasycznej chromatografii cieczowej wysokim ciśnieniem fazy ruchomej koniecznym do uzyskania przepływu tej fazy przez kolumnę chromatograficzną. Można wyróżnić wiele rodzajów chromatografii cieczowej. Jednym z kryteriów klasyfikacji jest natura stosowanej w kolumnie fazy stacjonarnej i rodzaj zachodzących procesów separacji. Według tego kryterium wydzielić chromatografię na: chromatografię adsorpcyjna: technikę, w której rozdzielanie jest głównie wynikiem różnic między zdolnościami składników próbki do adsorbowania się na powierzchni aktywnego ciała stałego chromatografię podziałową: technikę, w której rozdzielanie jest głównie wynikiem różnej rozpuszczalności składników próbki w fazie ruchomej i stacjonarnej chromatografię jonowymienna: technikę, w której rozdzielanie jest głównie wynikiem różnej zdolności składników próbki do ulegania wymianie jonowej chromatografię wykluczania: technikę, w której do rozdzielania wykorzystuje się efekty wykluczania, wynikające z różnic w wielkościach cząsteczek i/lub w ich kształcie albo ładunku. W przypadku gdy rozdział zależy od wielkości cząsteczek metodę określa się terminem chromatografię wykluczania zależnego od wielkości cząstek natomiast gdy rozdział zależy np. od stopnia dysocjacji rozdzielanych związków chromatografią wykluczania jonów Ponieważ ćwiczenie dotyczy zastosowania techniki chromatografii adsorpcyjnej tylko ona będzie przedmiotem bardziej szczegółowej charakterystyki. Chromatografia adsorpcyjna Chromatografia adsorpcyjna jest, jak zaznaczono wyżej, techniką, w której rozdzielanie jest głównie wynikiem różnic między zdolnościami składników próbki do adsorbowania się 1

na powierzchni aktywnego ciała stałego. Chromatografia adsorpcyjna dzielona bywa według podziału zgodnie z względną różnicą w polarnością polarności fazy ruchomej i stacjonarnej: Chromatografia w normalnym układzie faz. W tym układzie faza stacjonarna jest silnie polarnej natury np. silikażel a faza ruchoma jest niepolarna. Typowymi fazami ruchomymi są tu n-heksan lub tetrahydrofuran. Składniki próbki o polarnej strukturze są zatrzymywane dłużej na polarnej powierzchni fazy stałej niż składniki mniej polarne, czyli ich czas elucji z kolumny jest dłuższy, dłuższy jest też więc czas retencji tych związków. Im bardziej polarna faza ruchoma tym krótszy czas retencji. Słabością układów normalnofazowych jest istotna zależność retencji od nawet niewielkich ilości wody w fazach ruchomych. Nawet bowiem niewielkie zawilgocenie stosunkowo niepolarnych faz ruchomych w zdecydowany sposób wpływa na retencję co sprawia olbrzymie problemy z powtarzalnością analizy. Chromatografia w odwróconym układzie faz jest przeciwstawieniem tej pierwszej. Faza stacjonarna ma naturę niepolarną, hydrofobową natomiast fazą ruchomą jest ciecz polarna. W odwróconym układzie faz dokonuje się dzisiaj przeważającej części rozdziałów chromatograficznych w HPLC. Typowymi fazami ruchomymi są tu mieszaniny wody z metanolem, izopropanolem lub acetonitrylem. Typowymi fazami stacjonarnymi są krzemionki modyfikowane (hydrofobizowane) poprzez reakcję ze związkami krzemoorganicznymi. W chromatografii w odwróconym układzie faz związki mniej polarne zatrzymywane są mocniej przez hydrofobową powierzchnię fazy stałej niż składniki bardziej polarne, czyli ich czas elucji z kolumny jest dłuższy, dłuższy jest też więc czas retencji tych związków. Im mniej polarna faza ruchoma tym krótszy czas retencji. Polarność eluentu pełni zasadniczą rolę w każdym rodzaju technik HPLC. W przypadku chromatografii w odwróconym układzie faz woda jest polarnym składnikiem fazy ruchomej zaś metanol, izopropanol i acetonitryl pełnią rolę składników zmniejszających polarność fazy ruchomej. Organiczne składniki fazy ruchomej mające bardziej hydrofobowy charakter, łatwiej uruchamiają analit zatrzymywany na fazie stacjonarnej, skracając tym samym czas elucji czyli skracając czas retencji związku. Generalnie stosuje się dwa typy elucji: izokratyczną i gradientową. W pierwszym przypadku faza ruchoma o niezmiennym składzie pompowana jest poprzez kolumnę w 2

czasie całego cyklu analizy. W przypadku elucji gradientowej skład fazy ruchomej zmienia się podczas cyklu analizy. Kolumny chromatograficzne stosowane w technice z odwróconym układem faz HPLC Kolumna wraz z wypełnieniem stanowi najistotniejszy element układu chromatograficznego, w którym zachodzi właściwy proces rozdziału. W zależności od wielkości próbki stosuje się w technice HPLC kolumny analityczne, mikrokolumny i kolumny preparatywne. Są to najczęściej rurki ze stali nierdzewnej o wypolerowanej powierzchni wewnętrznej różnej długości i średnicy wewnętrznej Do celów analitycznych z reguły stosuje się kolumny analityczne. Kolumnę chromatograficzną w technice HPLC, z technicznego punktu widzenia, charakteryzują następujące parametry: Średnica wewnętrzna kolumny: 0,3-0,46 cm dla kolumn analitycznych, 0,1 lub 0,21 cm dla mikro kolumn, 0,8-1,0 cm dla kolumn semipreparatywnych i 2,0-5,0 cm dla kolumn preparatywnych Długość kolumny: 3-25 cm dla kolumn analitycznych, 15 lub 25 cm dla mikro kolumn, 10-25 cm dla kolumn semipreparatywnych i preparatywnych (wyjątkiem są kolumny jonowymienne, których długość sięga 30 cm) Średnica ziaren wypełnienia wyrażana w µm: 3-10 dla kolumn analitycznych, 3-8 dla mikro kolumn, 5-20 dla kolumn semipreparatywnych i preparatywnych. Jest to bardzo ważny parametr w technice HPLC. Wymiary cząstek 5 µm to, w przypadku kolumn analitycznych, dobry kompromis pomiędzy skutecznością rozdziału na kolumnie, ciśnieniem zwrotnym i trwałością kolumny. Natomiast 3 µm ziarno umożliwia prowadzenie znaczenie szybszych rozdziałów chromatograficznych ponieważ umożliwia stosowanie wyższych przepływów fazy ruchomej niż to ma miejsce w przypadku ziaren wypełnienia o większych rozmiarach. Mniejsze średnice ziaren to krótsze drogi dyfuzji i dlatego możliwe jest wykorzystanie wyższych przepływów bez utraty sprawności kolumny. Szczególne zastosowanie znalazły wypełnienia nieporowate o średnicy ziaren ok. 1 1,5 µm w analizie biomakromolekuł. Średnica porów wyrażana jest w nm lub Å. Średnica tych porów waha się od 7 do 100 nm (70 do 1000 Å) przy czym w kolumnach analitycznych przeznaczonych do rozdziału substancji o małych masach wykorzystuje się wypełnienia z wąskimi porami 7-12 nm, natomiast do rozdziału związków 3

wielkocząsteczkowych z porami szerokimi tj. 15-100 nm. Wielkość średnicy porów podawana jest w charakterystyce kolumny HPLC. Istotnym parametrem jest średnica kolumny. Kolumna o mniejszej średnicy powoduje duże oszczędności w zużyciu fazy ruchomej, bez zmniejszenia liniowej prędkości przepływu zachowując przy tym taki czas analizy, żeby współczynnik retencji nie przekroczył wartości 20 (Definicja współczynnika retencji, patrz p. 5.4). Jest to również czasem wprost wymogiem wobec zastosowanego detektora mas lub innego wymagającego minimalnej ilości wprowadzanego rozpuszczalnika (fazy ruchomej). W celu ochrony fazy stacjonarnej przed kolmatacją cząstkami stałymi, kolumny są zamknięte z dwóch końców filtrami (najczęściej ze stali nierdzewnej o średnicy porów 0,5-2 µm) i łącznikami do połączenia z dozownikiem i detektorem. Ponieważ napełnianie kolumn do HPLC wymaga dobrego przygotowania i profesjonalnego oprzyrządowania, dlatego preferowaną drogą zaopatrywania się w kolumny jest zakup w specjalistycznej firmie dostarczającej wyposażenie chromatograficzne. Kolumny można napełniać techniką suchą i mokrą. Lepsze efekty przy małych ziarnach dają techniki mokre. Ich zasada polega na tym, że sporządza się zawiesinę wypełnienia w rozpuszczalniku o gęstości zbliżonej do wypełnienia i zawiesinę taką pompuje się przez kolumnę, stosując wysokie ciśnienie w granicach 50-100 MPa. Krzemionkowe wypełnienia stosowane w chromatografii z odwróconym układem faz wytwarzane są przeważnie drogą związania kowalencyjnymi wiązaniami organicznych silanów (tzw. fazy związane) lub osadzenia organicznych polimerowych warstw na powierzchniach podtrzymujących takich jak krzemionki lub Al 2 O 3. Najczęściej wykorzystywane wypełnienia są wytwarzane w reakcjach powierzchniowych silanoli (grup Si-OH występujących na powierzchni SiO 2 ) z chlorodimetyloalkilosilanami, reakcjach silanoli z trójfunkcyjnymi chloroalkilosilanami lub silanoli z trójfunkcyjnymi alkoksysilanami. Wśród wymienionych wyżej procesów najczęściej wykorzystywany jest pierwszy z nich tj. reakcja silanoli z chlorodimetyloalkilosilanami. Zaletą wytwarzania wypełnień metodą reakcji silanów z jedną grupą funkcyjną z silanolami jest jej powtarzalność ponieważ jedna grupa silanolowa reaguje z jedną cząsteczką chlorodimetylosilanu tworząc przewidywalna strukturę. Wypełnienia wykonywane tym sposobem charakteryzują się wysoką sprawnością dzięki szybkiej dyfuzji do wewnątrz i na zewnątrz cienkiego złoża fazy stacjonarnej. Retencja analizowanych próbek przeważnie rośnie wraz z długością łańcucha węglowego (C 18 >C 8 >C 3 >C 1 ), jakkolwiek nie należy oczekiwać zasadniczych różnic dla dłuższych łańcuchów węglowych tj. C 8 i C 18. Istotnym 4

parametrem charakteryzującym fazę ruchoma jest natomiast powierzchniowe stężenie grup C 18 wyrażane w µmol/m 2. Jak wspomniano wyżej, niektóre wypełnienia kolumn mogą zawierać osadzane na nośniku fazy stacjonarne wytwarzane drogą polimeryzacji różnego typu monomerów. W handlu dostępne są także kolumny z fazą stacjonarną z tlenku glinu modyfikowanego polibutadienem czy z dwutlenkiem cyrkonu jako fazą stacjonarną. Fazy stacjonarne na bazie dwutlenku cyrkonu charakteryzują się wysoką odpornością termiczną oraz możliwością pracy w całym zakresie ph w przeciwieństwie do wypełnień opartych na SiO 2, których zakres pracy mieści się granicach 1,5< ph <8. Detektory stosowane w wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Detektory to jedne z głównych elementów składowych wysokosprawnego chromatografu cieczowego. Rolą detektora jest dostarczanie w sposób ciągły informacji o składzie eluatu wypływającego z kolumny. Dobry detektor charakteryzować się musi odpowiednio wysoką czułością i małą objętością komory pomiarowej. Najczęściej stosowanymi detektorami w technice HPLC są: Detektor absorpcji w nadfiolecie i świetle widzialnym (UV-VIS) Jest to najczęściej stosowany detektor, którego działanie polega na pomiarze absorbancji w warunkach przepływowych w kuwecie o objętości 1 µl. Źródłem światła jest tu niskociśnieniowa lampa rtęciowa umożliwiająca pomiar absorpcji w zakresie 200 600 nm, przy czym typową analityczną długością fali jest promieniowanie o λ= 254 nm. Ta długość fali absorbowana jest przez większość związków organicznych. Za absorpcję promieniowania odpowiedzialne są tzw. chromofory, grupy absorbujące promieniowanie UV w charakterystycznych dla siebie zakresach promieniowania. Chromoforami są np. podwójne wiązania C=C, zarówno alifatyczne jak i aromatyczne, wiązania C=N, N=O i inne. Czułość detektora UV-VIS jest bardzo wysoka i dla silnie absorbujących związków dochodzi do 10-11 g oznaczanej substancji. Współczesne detektory umożliwiają programowalną, w czasie cyklu chromatograficznego, zmianę długości fali, na optymalną dla w analizowanego tym momencie związku. Jeszcze lepsze możliwości analityczne zapewnia modyfikacja detektora UV-VIS znana jako układ szeregu diodowego (angielska nazwa systemu to Diode-Array). W tym systemie przez próbkę w kuwecie przepływowej przechodzi światło polichromatyczne w zakresie UV-VIS i dopiero za kuwetą jest rozszczepiane na siatce dyfrakcyjnej. Następnie światło pada na zestaw fotodiod rozmieszczonych liniowo, tak, że każda z diod rejestruje 5

tylko wąski (rzędu 2 nm) zakres światła. Z funkcjonalnego punktu widzenia jest to jakby zestaw równocześnie pracujących detektorów obejmujących swym zakresem całe widmo UV- VIS. Zaletami tego systemu są: - możliwość rejestrowania całego widma UV-VIS dla każdej z eluowanych substancji - możliwość sprawdzania czystości eluowanego piku eliminuje możliwość przeoczenia nakładających się substancji - daje możliwość korekcji linii podstawowej w przypadku wzrostu absorbancji na skutek stosowania gradientu. Refraktometr różnicowy. Opiera się na pomiarze różnicy współczynnika załamania światła między czysta fazą ruchomą a fazą zawierającą wymywany składnik. Zasadniczą wadą tego detektora jest wysoka wrażliwość na nawet małe zmiany temperatury - wymaga stabilizacji temperatury ± 0,001 o C aby osiągnąć czułość 10-7 jednostki współczynnika załamania. Jest więc detektorem mało wygodnym w użyciu. Ponadto detektor ten wyklucza stosowanie gradientu fazy ruchomej. Detektor fluorymetryczny (fluorescencyjny) Detektor fluorescencyjny jest około 100 razy czulszy (dla związków fluoryzujących) i znacznie bardziej selektywny niż detektor UV. Detektor ten wykorzystuje zjawisko fluorescencji tj. emisji światła przez substancję wzbudzone wysokoenergetycznym promieniowaniem UV. Jest detektorem selektywnym, gdyż związki mogą zostać wzbudzane tylko światłem o określonej długości fali. Emitowane promieniowanie mierzone jest fotopowielaczem ustawionym pod kątem 90 o do źródła wzbudzenia. Detektor ten może wykrywać pikogramowe ilości (10-12 g) substancji. Stosuje się go często w analityce wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych (WWA). Źródła wzbudzenia są takie jak te używane w konwencjonalnych spektrofluorymetrach: lampy rtęciowe, lampy ksenonowe, kwarcowe lampy halogenowe oraz lampy deuterowe. Najciekawsze efekty osiąga się przy pomocy laserów. Światło laserowe można skupić na bardzo małej powierzchni co skutkuje detektorami o bardzo małej komorze pomiarowej rzędu 1 nl. Tego typu detektory stosować można w mikrochromatografii cieczowej wykorzystując mikrokolumny lub kolumny kapilarne. Detektory elektrochemiczne Do tej grupy zaliczają się detektory kulometryczny i detektor polarograficzny. Detektorów tych zwykle używa się przy fazach zawierających wodę a takie właśnie fazy 6

stosowane są szeroko w HPLC, dlatego można się spodziewać wzrostu ich znaczenia. Detektory te są detektorami selektywnymi o wielkiej czułości, jednak ich stosowanie uważa się za uciążliwe. Detektor konduktometryczny Zasada działania tego detektora opiera się na pomiarze przewodnictwa, stosowany jest w chromatografii jonowej Inne detektory stosowane w HPLC W HPLC stosuje się również detektory przejęte z chromatografii gazowej jak FID, ECD, PID czy MSD ale wiąże się to z rozwiązaniem problemu transportu całości lub części wycieku z kolumny LC, odparowaniu rozpuszczalnika po drodze i dostarczeniu nielotnych substancji do detektora. Z powyższych powodów w technice HPLC znalazł praktyczne zastosowanie tylko detektor masowy MSD, którego zalety rekompensują opisane wyżej problemy. 2. CEL ĆWICZENIA Określenie wpływu polarności fazy ruchomej na retencję polarnych i niepolarnych związków analizowanych techniką wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Ponadto ćwiczenie służyć ma zapoznanie się z: Budową, zasadą działania i właściwościami detektorów stosowanych w wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Wykorzystaniem detektora UV-VIS w analizie związków organicznych. Wyznaczenie maksimum absorpcji badanego związku w oparciu o widmo UV-VIS. 3. ZAKRES MATERIAŁU WYMAGANY PRZED PRZYSTĄPIENIEM DO WYKONYWANIA ĆWICZENIA. Charakterystyka i budowa kolumn stosowanych w wysokosprawnej chromatografii cieczowej: Rodzaje fazy stacjonarnej stosowane w wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Pojęcie uziarnienia i wielkości porów jako czynników charakteryzujących kolumnę, stosowane jednostki Pojęcia chromatografii w normalnym i odwróconym układzie faz. Detektory stosowane w chromatografii cieczowej Budowa i zasada działania 7

Czułość i współczynnik odpowiedzi detektora Chromofory i ich charakterystyczne pasma absorpcji Pojęcia czasu retencji i indeksu retencji Zalecana literatura: J. Nawrocki, I. Obst : Metody analizy zanieczyszczeń powietrza atmosferycznego i organicznych zanieczyszczeń wody pitnej Wydawnictwo Naukowe UAM L.R. Snyder, J.J. Kirkland, J.L. Glach: Practical HPLC method development Second Edition, John Wiley & Sons, Inc. NewYork 1997 4. SPRZĘT I ODCZYNNIKI Chromatograf cieczowy WATERS 2690 wyposażony w kolumnę SYMMETRY C18 2,1 x 150 mm i detektor Waters 486 (UV-VIS) oraz automatyczny system nastrzyku próbki. Spektrofotometr UV-VIS HACH DR 4000U Warunki analizy: Składnik A: woda wysokiej czystości, składnik C: MeOH HPLC grade przepływ 1 ml/min, λ=230 nm Pipety automatyczne 20-200 µl, 100-1200 µl, 1000-5000 µl Naczyńka laboratoryjne o pojemności 1800 µl Podstawowe, metanolowe, roztwory toluenu (metylobenzenu) związku niepolarnego oraz kwasu benzoesowego związku polarnego, w stężeniach po 0,5 mg/ml. Metanol cz.d.a. Azotan sodowy roztwór 10 mg/l 5. SPOSÓB WYKONANIA ĆWICZENIA 5.1.WYZNACZENIE DŁUGOŚCI FALI ODPOWIADAJĄCEJ MAKSIMUM ABSORPCJI TOLUENU I KWASU BENZOESOWEGO 8

Wykorzystując spektrofotometr HACH DR 4000U wykonać analizę spektrofotometryczną roztworów toluenu i kwasu benzoesowego. Odczytać długości fali odpowiadające maksimom absorpcji toluenu i kwasu benzoesowego wykorzystując do tego celu roztwory obu związków. Stwierdzić czy wśród wartości uzyskanych dla obu związków są długości fali wspólne dla obu związków identyczne czy też różnią się znacznie. W drugim przypadku istnieje konieczność zmiany długości fali detektora UV-VIS w trakcie prowadzenia analizy. 5.2. WYKONANIE ROBOCZYCH ROZTWORÓW TOLUENU, KWASU BENZOESOWEGO ORAZ MIESZANINY OBU ZWIĄZKÓW Naczyńko laboratoryjne oznaczone TOLUEN zawiera podstawowy metanolowy roztwór toluenu (0,5 mg/ml) a naczyńko oznaczone K_BENZ podstawowy metanolowy roztwór kwasu benzoesowego (0,5 mg/ml). W naczyńkach laboratoryjnych o pojemności 1,8 ml wykonać rozcieńczenia roztworów podstawowych TOLUEN i K_BENZ w celu osiągnięcia stężeń 10 mg/l oraz ich mieszaniny o stężeniu po 10 mg/l każdego z obu składników. W tym celu automatyczną pipetą pobrać porcje metanolu po 1500 µl i wprowadzić do naczyniek o pojemności 1,8 ml wstępnie opisanych jako TOLUEN-rob, K_BENZ-rob i MIX. Automatyczną pipetą o pojemności 20-200 ul. usunąć z naczyniek TOLUEN-rob, K_BENZ-rob po 30 µl metanolu a z naczyńka MIX 60 µl metanolu. Następnie z naczyńka TOLUEN pobrać porcje roztworu po 30 µl i przenieść je do naczyniek oznaczonych TOLUEN-rob i MIX a z naczyńka K_BENZ pobrać porcje roztworu po 30 µl i przenieść je do naczyniek oznaczonych K_BENZ-rob i MIX. Naczyńka szczelnie zamknąć nakrętką i wstrząsając nim wymieszać zawartość. 5.3. ANALIZA CHROMATOGRAFICZNA 1. Na panelu kontrolnym chromatografu Waters ustawić skład fazy ruchomej na Składnik A (Woda) =50%, Składnik B=0%, Składnik C (Metanol) =50%, Składnik D=0% oraz przepływ na 1 ml/min. 2. Wybrać PROJECT FAZY w programie CSW. Przygotowane wzorce, w kolejności TOLUEN-rob, K_BENZ-rob i MIX umieścić w magazynku autosamplera. W oknie opisu próbek projektu FAZY wpisać informacje dotyczące, w przypadku pierwszej analizy, próbki TOLUEN-rob a drugiej próbki K_BENZ-rob. 3. Nastawić na panelu sterującym chromatografu Waters, wyznaczoną spektrofotometrycznie wspólna dla obu związków długość fali detektora UV-VIS (w przypadku różnych wartości dla obu związków, pierwotnie zaprogramować długości fali 9

odpowiadającej maksimum absorpcji TOLUENU a przed wykonaniem drugiej analizy, długości fali odpowiadającej maksimum absorpcji KWASU BENZOESOWEGO. 4. Uruchomić bieg programu chromatograficznego z panelu sterującego chromatografu Waters wybierając analizę próbki nr jeden i objętość nastrzyku 20 µl. Po analizie zebrać i wydrukować otrzymany chromatogram. Wyznaczyć wysokość, pole i czas retencji TOLUENU. 5. Jeśli wybrano dla obu związków różne długości fal, na panelu kontrolnym chromatografu Waters zmienić długość fali na tę spektrofotometrycznie wyznaczoną dla KWASU BENZOESOWEGO. Powtórnie uruchomić program chromatograficzny z panelu sterującego chromatografu Waters wybierając analizę próbki nr dwa i objętość nastrzyku 20 µl a po analizie zebrać i wydrukować otrzymany chromatogram wyznaczając wysokość, pole i czas retencji KWASU BENZOESOWEGO. Zebrane wartości umieścić w tabeli. 6. Jeśli wybrano dla obu związków różne długości fal, na panelu kontrolnym chromatografu Waters wybrać opcję zmiany długość fali w trakcie trwania cyklu chromatograficznego. Na panelu kontrolnym chromatografu Waters ustawić skład fazy ruchomej na Składnik A=10%, Składnik B=0%, Składnik C=90%, Składnik D=0% Po raz trzeci uruchomić bieg programu chromatograficznego z panelu sterującego chromatografu Waters wybierając analizę próbki nr 3 i objętość nastrzyku 20 µl. Po analizie zebrać i wydrukować otrzymany chromatogram. Wyznaczyć wysokość, pole i czas retencji TOLUENU i KWASU BENZOESOWEGO umieszczając zebrane wartości w tabeli. 7. Powtarzać analizę opisaną powyżej (p.6) zmieniając skład fazy ruchomej zgodnie ze schematem umieszczonym w tabeli. Każdorazowo po analizie zebrać i wydrukować otrzymany chromatogram. Wyznaczyć wysokość, pole i czas retencji TOLUENU i KWASU BENZOESOWEGO umieszczając zebrane wartości w tabeli. 5.4. WYZNACZENIE WSPÓŁCZYNNIKÓW RETENCJI. Współczynnik retencji definiowany jest wzorem: a martwy czas retencji: gdzie: k współczynnik retencji t R czas retencji piku w min t 0 martwy czas retencji w min k=(t R -t 0 )/t 0 t 0 =V m /F 10

V m martwa objętość kolumny (objętość fazy ruchomej w kolumnie) w ml F- przepływ przez kolumnę w ml/min Martwą objętość kolumny można wyznaczyć z przybliżonego wzoru: V m 0,5. L. 2 d c gdzie: L - długość kolumny w cm d c wewnętrzna średnica kolumny w cm Martwy czas retencji można również stosunkowo łatwo wyznaczyć doświadczalnie analizując roztwór NaNO 3 lub roztwór uracylu. W tym celu wykorzystując spektrofotometr HACH DR 4000U wykonać analizę spektrofotometryczną przygotowanego roztworu NaNO 3. Odczytać długości fali odpowiadające maksimom absorpcji azotanu sodowego wykorzystujące do tego celu otrzymany roztwór związku. Wykonać analizę chromatograficzną roztworu w warunkach analizy opisanych w p.5.3.1. tj. A (Woda) =50%, Składnik B=0%, Składnik C (Metanol) =50%, Składnik D=0% oraz przepływ na 1 ml/min, nastawiając długość fali na wartość odpowiadającą maksimum absorpcji azotanu sodowego. Czas retencji związku jest martwym czasem retencji układu. Porównać uzykaną wartość z wyliczoną teoretycznie. 6. OPRACOWANIE WYNIKÓW W sprawozdaniu z przebiegu ćwiczenia umieścić wyliczony i wyznaczony martwy czas retencji oraz tabelę (patrz wzór tab.) wraz z wyliczonymi współczynnikami retencji oraz ocenę: Wpływu polarności fazy ruchomej na wysokość, pole piku oraz współczynnik retencji obu związków. Korelacji pomiędzy polarnością fazy ruchomej a wysokością, polem piku oraz współczynnikiem retencji związku w zależności od jego polarności 11

Wzorcowa tabela wyników. Lp. Nazwa próbki Udział składnika A w fazie ruchomej [%] Udział składnika C w fazie ruchomej [%] Wsp. retencji toluenu [-] Wsp. retencji kwasu benzoes owego [-] Wysokość/ pole piku toluenu [mv]/[mv. s] Wysokość/ pole piku kwasu benzoesowe go [mv]/[mv. s] 1 TOLUEN-rob 50 50 2 K_BENZ-rob 50 50 3 MIX 10 90 4 MIX 20 80 5 MIX 30 70 6 MIX 40 60 7 MIX 50 50 8 MIX 60 40 9 MIX 70 30 10 MIX 80 20 11 MIX 90 10 12