Ocena ekspresji wybranych molekuł z rodziny B7 na powierzchni dojrzałych komórek dendrytycznych u chorych na raka krtani

otolaryngologia polska 66 (2012) 413 418 Doste pne online www.sciencedirect.com journal homepage: www.elsevier.com/locate/otpol Artykuł oryginalny/original research article Ocena ekspresji wybranych molekuł z rodziny B7 na powierzchni dojrzałych komórek dendrytycznych u chorych na raka krtani The assessment of selected molecules belonging to B7 family on the mature dendritic cells in laryngeal cancer patients Janusz Klatka 1, Ewelina Grywalska 2, Magdalena Wasiak 1, Paulina Wdowiak 2, Adrian Andrzejczak 1, Eliza Trzaskowska 1, *, Jacek Roliński 2 1 Katedra i Klinika Otolaryngologii i Onkologii Laryngologicznej Uniwersytetu Medycznego w Lublinie, Poland 2 Katedra i Zakład Immunologii Klinicznej Uniwersytetu Medycznego w Lublinie, Poland informacje o artykule Historia artykułu: Otrzymano: 02.04.2012 Zaakceptowano: 05.06.2012 Dostępne online: 09.06.2012 Słowa kluczowe: rak krtani B7-H1 B7-H2 B7-H4 komórki dendrytyczne Keywords: Laryngeal cancer B7-H1 B7-H2 B7-H4 Dendritic cells abstract B7-H1, B7-H2 and B7-H4 molecules play various roles in the adaptive immune system and are broadly expressed on many cells, especially those localized in cancer tissue. The aim of the study was to assess the surface expression of B7-H1, B7-H2 and B7-H4 molecules on the mature dendritic cells (DC) generated from peripheral blood monocytes of laryngeal cancer patients and healthy donors. Material and methods: Forty-four male patients treated surgically for squamous cell carcinoma of the larynx were included in the study. Peripheral blood from twelve healthy male donors was used as a control. Mononuclear cells were separated from all individuals by density gradient centrifugation, incubated with anti-cd14 microbeads, and passed through MACS separation columns. The CD14 positive cell population was used to prepare monocyte derived DC. Laryngeal cancer tissue was obtained from patients during surgical treatment and homogenized to prepare tumor cell lysates for further stimulation. We evaluated with the use of flow cytometry method the percentage of cells with an expression and mean fluorescent intensity (MFI) of surface markers, such as: CD83, B7-H1, B7-H2, B7-H4. Results: Our study revealed that the percentage of mature dendritic cells, stimulated with autologous tumor cell lysates, with the expression of B7-H1 molecule in patients was lower than in healthy donors (61.81 25.58% vs 93.02 4.63%, p = 0.007). In laryngeal cancer patients, the percentage of CD83+/B7-H2+ cells was higher than in healthy individuals (18.32 10.74% vs 2.89 0.43%, p = 0.019). Conclusions: There is a relation between the presence of laryngeal cancer and the expression of B7 family molecules. 2012 Polish Otorhinolaryngology - Head and Neck Surgery Society. Published by Elsevier Urban & Partner Sp. z o.o. All rights reserved. * Adres do korespondencji: Eliza Trzaskowska, Katedra i Klinika Otolaryngologii i Onkologii Laryngologicznej UM, ul. Jaczewskiego 8, 20-090 Lublin, Poland. Tel.: +48 605765554. Adres email: trzasia@onet.eu (E. Trzaskowska). 0030-6657/$ see front matter 2012 Polish Otorhinolaryngology - Head and Neck Surgery Society. Published by Elsevier Urban & Partner Sp. z o.o. All rights reserved. http://dx.doi.org/10.1016/j.otpol.2012.06.005

414 otolaryngologia polska 66 (2012) 413 418 Wstęp Materiał i metody Rak krtani jest obecnie najczęściej występującym nowotworem złośliwym w obrębie głowy i szyi, szczególnie u mężczyzn, u których stanowi istotną przyczynę śmiertelności [1]. Jego dominującym typem histologicznym jest rak płaskonabłonkowy [2]. Do radykalnych metod terapii raka krtani zaliczamy leczenie chirurgiczne i radioterapię. W zaawansowanych stanach stosuje się leczenie skojarzone [3]. Wybór metody jest indywidualny, a efekty mimo ciągłego rozwoju i doskonalenia klasycznych metod terapii pozostają niezadowalające [4, 5]. Przeprowadzone w ostatnim dziesięcioleciu badania kliniczne wskazują na istotną rolę czynników immunologicznych w przebiegu choroby nowotworowej u ludzi [6]. Niezadowalające wyniki leczenia, zwłaszcza zaawansowanych raków krtani, skłaniają do podjęcia badań nad opracowaniem efektywnych programów immunoterapeutycznych w ramach radykalnego leczenia skojarzonego. Podjęto liczne tego typu próby terapeutyczne m.in. z wykorzystaniem komórek dendrytycznych [7]. Niestety, nadal opracowanie optymalnej metody leczniczej przy użyciu komórek dendrytycznych (DC) nie zostało osiągnięte, między innymi z powodu niedokładniej znajomości biologii DC i wpływu antygenów nowotworowych na ich funkcje oraz ekspresję molekuł kostymuluja cych, niezwykle istotnych w interakcjach DC z innymi komórkami [8]. Molekuły B7-H1, B7-H2 i B7-H4 należą donowoodkrytych białek immunomoduluja cych z rodziny B7. Molekuła B7-H1 wykazuje właściwości hamuja ce względem odpowiedzi immunologicznej ze strony limfocytów T [9]. Molekuła B7-H2, biorąca udział w interakcji z antygenem CD28, jest kluczowa dla wzbudzania pierwotnej odpowiedzi immunologicznej ze strony ludzkich limfocytów T na antygeny allogeniczne oraz pobudzania komórek pamięci [10]. Molekuła B7-H4 natomiast została zidentyfikowana w 2003 r. jako cząsteczka kostymulująca, istotna w hamowaniu proliferacji limfocytów T oraz blokowaniu wytwarzania cytokin przez subpopulacje Th1 i Th2. Jej wysoka ekspresja na powierzchni komórek niektórych nowotworów powoduje, że może zostać uznana za marker karcynogenezy [11]. Dotychczas nie oceniano ekspresji wymienionych molekuł na komórkach dendrytycznych u osób chorych na płaskonabłonkowego raka krtani. Analiza ta wydaje się niezbędna z kilku powodów: pozwoli ocenić, czy od pacjentów z rakiem krtani można wygenerować w pełni sprawne immunologicznie DC, odpowiadające na antygeny nowotworowe, czy stymulowane lizatami komórek nowotworowych DC pacjentów różnią się od DC zdrowych dawców oraz które DC będą bardziej efektywne w odpowiedzi przeciwnowotworowej auto- czy allogeniczne. Celem pracy była ocena ekspresji cząsteczek B7-H1, B7-H2 i B7-H4 na powierzchni dojrzałych komórek dendrytycznych generowanych z monocytów krwi obwodowej chorych na raka krtani i zdrowych dawców. Ekspresję molekuł oceniono zarówno po stymulacji dojrzewania DC autologicznymi lizatami komórek nowotworowych, jak również na niestymulowanych DC zdrowych dawców. Charakterystyka chorych na raka krtani Materiał do badań uzyskano od 44 nieleczonych uprzednio chorych płci męskiej, z rozpoznanym płaskonabłonkowym rakiem krtani, zakwalifikowanych do zabiegu operacyjnego celem resekcji nowotworu. Chorzy byli hospitalizowani w Katedrze i Klinice Otolaryngologii i Onkologii Laryngologicznej Uniwersytetu Medycznego w Lublinie w latach 2006 2010. Wiek badanych chorych wahał się od 41 do 73 lat (średnia 59,78 13,42). Charakterystyka grupy kontrolnej Grupę kontrolna stanowiło 12zdrowychmężczyzn, których wiek mieścił się w podobnych granicach do wieku pacjentów od 45 do 71 lat (średnia 54,39 12,83). Wszystkie osoby, zarówno z grupy badanej jak i z grupy kontrolnej, w okresie 1 miesiąca poprzedzającego pobranie materiału nie przechodziły infekcji, nie stosowały antybiotykoterapii oraz innych leków mogących mieć wpływ na układ immunologiczny, nie miały także wykonywanej transfuzji krwi. Z badań wykluczono osoby zgłaszające w wywiadzie choroby alergiczne. Badania zostały wykonane zgodnie z protokołem zaakceptowanym przez Komisję Bioetyczną przy Uniwersytecie Medycznym w Lublinie. Materiał do badań Materiał badany stanowiła krew obwodowa pobierana z żyły odłokciowej w ilości 20 ml do jałowych strzykawek zawierających heparynę sodową (Polfa, Warszawa) w ilości 20 j/ml krwi. Wykorzystano ją do izolacji komórek mononuklearnych. Od chorych na raka krtani podczas zabiegu operacyjnego uzyskano materiał tkankowy z guza, który po poddaniu homogenizacji, służył do stymulacji komórek dendrytycznych. Izolacja komórek mononuklearnych z krwi obwodowej Krew obwodową rozcieńczano 0,9% zbuforowanym roztworem soli fizjologicznej PBS bez soli wapnia i magnezu (Biochrome AG, Niemcy) w stosunku 1:1. Rozcieńczoną krew nawarstwiano na 3 ml Gradisolu L (Aqua Medica, Polska) o ciężarze właściwym 1,077 g/ml. Krew wirowano w gradiencie gęstości przez 20 minut przy przyspieszeniu 700 xg. Uzyskaną frakcję komórek jednojądrzastych zbierano i dwukrotnie płukano przez 5 minut w roztworze PBS bez jonów Ca2+ i Mg2+. Następnie wypłukane komórki zawieszano w 1 ml PBS bez jonów Ca2+ i Mg2+ oraz określano ich liczebność i żywotność.

otolaryngologia polska 66 (2012) 413 418 415 Izolacja komórek nowotworowych i przygotowanie lizatów Fragment tkanki nowotworowej niezawieraja cy obszarów martwiczych, wielkości 2 x 2 cm rozdrabniano za pomocą skalpela chirurgicznego. Rozdrobnioną tkankę zawieszano w 30 ml RPMI 1640 (PanBiotech, Niemcy) z dodatkiem następujących enzymów 1 mg/ml kolagenazy typu I (Biochrome AG, Niemcy), 1 mg/ml DNA-azy typu I (Sigma, Niemcy) i 0,1 mg/ml hialuronidazy (Sigma, Niemcy). Całość umieszczano w szklanej butli o pojemności 100 ml i trawiono w sterylnych warunkach z wykorzystaniem mieszadła magnetycznego (Kucharczyk, Polska) w temperaturze 378C przez 60 min. Po strawieniu zawiesinę filtrowano przez sito i wirowano przez 5 minut przy przyśpieszeniu 700xg. Uzyskane w ten sposób komórki płukano dwukrotnie w czystym RPMI 1640. Lizaty komórek raka krtani zostały przygotowywane poprzez pięciokrotny cykl szybkiego zamrażania (-808C) iodmrażania (378C) zawiesiny komórek w 1 ml RPMI 1640 bez czerwieni fenolowej (PanBiotech, Niemcy). Następnie preparat odwirowywano przez 5 minut z przyśpieszeniem 700xg, zbierano supernatant i filtrowano go przez filtr 20 mm. Przefiltrowany lizat w ilości po 500 ml użyto do stymulacji komórek dendrytycznych. Generacja komórek dendrytycznych Separacja magnetyczna komórek CD14+ Monocyty CD14+ pozyskiwano z frakcji jednojądrzastych komórek krwi obwodowej, z wykorzystaniem metody izolacji magnetycznej za pomocą aparatu Vario MACS (Miltenyi Biotec, Niemcy) oraz przeciwciał monoklonalnych anty- CD14 sprzężonych ze znacznikiem magnetycznym (Miltenyi Biotec, Niemcy) zgodnie z protokołem producenta. Komórki zawieszono w 1 ml PBS, liczono i oceniano żywotność. Czystość uzyskanych monocytów sprawdzano w cytometrze przepływowym przy użyciu przeciwciał anty-cd14 sprzężonego z FITC. Hodowla i stymulacja dojrzewania komórek dendrytycznych Komórki dendrytyczne generowano z monocytów uzyskanych w procesie separacji magnetycznej. Generację prowadzono w butelkach hodowlanych (BD Falcon, USA) w standardowych warunkach: w temperaturze 378C, w atmosferze 5% CO 2. Jako medium hodowlane wykorzystano RPMI 1640 (PAA, Austria) wzbogacone 2% albuminą ludzką (Baxter, USA) oraz antybiotykami w następuja cych stężeniach: 100 IU penicyliny/ml, 50 mg streptomycyny/ml, 100 mg neomycyny/ml (Sigma, Niemcy). Monocyty zawieszono w medium (0,5x10 6 komórek na 1 ml medium) uzupełnionym dodatkowo cytokinami: rhgm-csf w dawce 1000 IU/ml (Gentaur, Belgia) oraz rhil-4 w dawce 500 IU/ml (Gentaur, Belgia). Cytokiny dodawano również 3. i 5. dnia hodowli. Szóstego dnia hodowli do butelki hodowlanej dodawano lizat z komórek nowotworowych w ilości 100 mg białka na ml medium hodowlanego. W celu dodatkowej indukcji dojrzewania komórek dendrytycznych dodawano rhtnf-a w ilości 50 ng/ml (Strathmann, Niemcy). Ósmego dnia generacji uzyskane komórki dendrytyczne liczono, oceniano ich żywotność,anastępnie zawieszano w medium, barwiono odpowiednimi zestawami przeciwciał monoklonalnych i analizowano w cytometrze przepływowym. Cytometria przepływowa Wygenerowane komórki dendrytyczne oceniono pod względem ekspresji markerów powierzchniowych, wykorzystuja c następujące przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko ludzkim antygenom: anty-83 FITC (izotyp IgG1) (BD Pharmingen, USA)/anty-B7H1 PE (izotyp IgG2b, kappa) (Biolegend, USA); anty-83 FITC (izotyp IgG1) (BD Pharmingen, USA)/anty-B7H2 PE (izotyp IgG2b) (BD Pharmingen, USA); anty-83 FITC (izotyp IgG1) (BD Pharmingen, USA)/anty-B7H4 PE (izotyp IgG1) (Biolegend, USA). Ocenie poddano odsetek poszczególnych komórek oraz średnią intensywność fluorescencji (MFI; Mean Fluorescence Intensity), będącą wykładnikiem gęstości ekspresji poszczególnych cząsteczek na komórce. Oceny immunofenotypu dokonano za pomocą cytometru przepływowego FACSCalibur (Becton Dickinson, USA) wyposażonego w laser argonowy o emisji 488 nm. Do analizy badanych parametrów wykorzystano program CellQuest (Becton Dickinson, USA). Za dojrzałe komórki dendrytyczne uznawano komórki o fenotypie CD83+. Analiza statystyczna Analiza statystyczna przeprowadzona została przy użyciu programu Statistica 9.0 PL. Obliczeń statystycznych dokonano za pomocą testu U Manna-Whitneya dla sprawdzenia różnic pomiędzy grupą badaną a grupą kontrolną, za istotne statystycznie przyjmując wartości p < 0,05. Uzyskane wyniki opisano za pomocą średnich arytmetycznych, odchyleń standardowych, median, wartości najmniejszej szeregu statystycznego (min.), wartości największej szeregu statystycznego (maks.). Wyniki Wykazano, że odsetek dojrzałych komórek dendrytycznych, stymulowanych antygenami raka krtani, charakteryzujących się ekspresją B7-H1 wyniósł u osób chorych 61,81 25,58% i był istotnie statystycznie niższy niż w grupie zdrowych 93,02 4,63% (p = 0,007) (Ryc. 1). Średnia intensywność fluorescencji molekuły B7-H1 wyniosła w poszczególnych grupach odpowiednio 270,33 159,08 i 181,18 62,29. Różnica ta nie była jednak istotna statystycznie (p = 0,196) (Ryc. 2). Odsetek dojrzałych komórek dendrytycznych z ekspresja B7-H2 wyniósł u osób chorych 18,32 10,74% i był istotnie

416 [(Ryc._1)TD$FIG] otolaryngologia polska 66 (2012) 413 418 [(Ryc._3)TD$FIG] Ryc. 1 Odsetek dojrzałych komórek dendrytycznych z powierzchniową ekspresją molekuły B7-H1 (CD83+/ B7-H1+) u chorych na raka krtani i zdrowych dawców Fig. 1 Percentage of mature dendritic cells with surface expression of B7-H1 molecule (CD83+/B7-H1+) in laryngeal cancer patients and healthy donors [(Ryc._2)TD$FIG] Ryc. 3 Odsetek dojrzałych komórek dendrytycznych z powierzchniową ekspresją molekuły B7-H2 (CD83+/ B7-H2+) u chorych na raka krtani i zdrowych dawców Fig. 3 Percentage of mature dendritic cells with surface expression of B7-H2 molecule (CD83+/B7-H2+) in laryngeal cancer patients and healthy donors [(Ryc._4)TD$FIG] Ryc. 2 MFI molekuły B7-H1 na powierzchni dojrzałych komórek dendrytycznych u chorych na raka krtani i zdrowych dawców Fig. 2 MFI of B7-H1 molecule on the mature dendritic cells in laryngeal cancer patients and healthy donors Ryc. 4 MFI molekuły B7-H2 na powierzchni dojrzałych komórek dendrytycznych u chorych na raka krtani i zdrowych dawców Fig. 4 MFI of B7-H2 molecule on the mature dendritic cells in laryngeal cancer patients and healthy donors statystycznie wyższy niż w grupie zdrowych 2,89 0,43% (p = 0,019) (Ryc. 3). Mimo obserwowanych wyższych wartości MFI molekuły B7-H2 u osób z rakiem krtani niż w grupie kontrolnej (odpowiednio 61,21 43,72 i 17,64 5,87), nie wykazano istotności statystycznej (p = 0,09) (Ryc. 4). Odsetek dojrzałych DC z ekspresją B7-H4 wyniósł w grupie badanej 13,66 48,74%, a w grupie kontrolnej 2,31 1,98% (p = 0,58) (Ryc. 5). Uzyskano średnią wartość MFI dla molekuły B7-H4 w grupie osób chorujących na nowotwór równą 49,54 54,48, natomiast w grupie zdrowych 5,27 1,47 (p = 0,06). Wynik analizy był bliski istotności statystycznej, ale jej nie osiągnął (Ryc. 6). Omówienie Immunoterapia nowotworów przy użyciu komórek dendrytycznych budzi wielkie nadzieje zarówno wśród lekarzy klinicystów, jak i naukowców oraz samych pacjentów. Również w raku krtani, którego leczenie standardowymi

[(Ryc._5)TD$FIG] otolaryngologia polska 66 (2012) 413 418 417 Ryc. 5 Odsetek dojrzałych komórek dendrytycznych z powierzchniową ekspresją molekuły B7-H4 (CD83+/ B7-H4+) u chorych na raka krtani i zdrowych dawców Fig. 5 Percentage of mature dendritic cells with surface expression of B7-H4 molecule (CD83+/B7-H4+) in laryngeal cancer patients and healthy donors [(Ryc._6)TD$FIG] wykazuje silną ekspresję na aktywowanych komórkach dendrytycznych, limfocytach T i B oraz monocytach [17]. Istnieją doniesienia, iż cząstka B7-H1 obecna na DC wpływa na hamowanie proliferacji limfocytów T zależnej od TCR oraz zmniejszenie wydzielania cytokin [18]. Może odgrywać istotną rolę w regulacji odpowiedzi immunologicznej i indukcji tolerancji. W przeprowadzonych badaniach własnych zaobserwowano istotnie statystycznie niższy odsetek komórek CD83+/B7-H1+ w grupie chorych na raka krtani. Badania przeprowadzone na modelu zwierzęcym [19] wykazały, iż zablokowanie cza stki B7-H1 skutkuje wzrostem wydzielania interleukiny 2 i interferonu g. Molekuła B7-H1 znacza co przyczynia się do obniżenia aktywacji limfocytów T. Badania własne wskazują, iż komórki dendrytyczne generowane z monocytów chorych na raka krtani nie wykazują hamującego wpływu na aktywację i proliferację limfocytów T poprzez molekułę B7-H1. B7-H2 jest molekułą działającą tolerogennie, gdyż poprzez białko ICOS (ICOS; inducible costimulatory molecule) promuje wydzielanie interleukiny 10 przez limfocyty T [20]. W prezentowanych badaniach zanotowano istotnie wyższy odsetek dojrzałych komórek dendrytycznych z ekspresja B7-H2 u chorych na raka krtani. Wyniki te mogą wskazywać na większą zdolność komórek dendrytycznych do indukcji tolerancji w raku krtani. Molekuła B7-H4, wchodząc w interakcję ze swoim receptorem, hamuje aktywację limfocytów T, wydzielanie cytokin oraz ogranicza zjawisko cytotoksyczności [21]. Rola B7-H4 związana jest również z zapobieganiem apoptozie komórek nowotworowych. Wykazano, że interleukina 10 zwiększa ekspresję białka B7-H4 na powierzchni ludzkich komórek prezentuja cych antygen, natomiast czynnik stymulujący kolonie granulocytów i makrofagów oraz interleukina 4 zmniejszają ekspresję tej molekuły [22]. Występowanie omawianej molekuły zostało potwierdzone na wielu typach komórek nowotworowych, m.in.: w raku endometrium [23], piersi [24] i jajnika [25]. W prezentowanych badaniach własnych nie odnotowano istotnych statystycznie różnic w odsetku komórek dendrytycznych o fenotypie CD83+/B7- -H4+ w obu badanych grupach mimo wyraźnie większego odsetka tych DC u chorych na raka krtani. Ryc. 6 MFI molekuły B7-H4 na powierzchni dojrzałych komórek dendrytycznych u chorych na raka krtani i zdrowych dawców Fig. 6 MFI of B7-H4 molecule on the mature dendritic cells in laryngeal cancer patients and healthy donors metodami jest niezwykle obcia żające dla chorych [12, 13], a w stanach zaawansowanych zazwyczaj mało efektywne, stosowano różne schematy immunoterapii z niestety miernym dotychczas skutkiem [14, 15]. Molekuły B7 na powierzchni komórek prezentujących antygen uczestniczą w najważniejszym szlaku aktywującym w procesie kostymulacji, stanowiąc tak zwany,,drugi sygnał, niezbędny do prawidłowej aktywacji limfocytów T poprzez interakcję z molekułą CD28 na limfocytach T [16]. Molekuła B7-H1 Wnioski W przeprowadzonych badaniach własnych zaobserwowano istotnie statystycznie niższy odsetek komórek CD83+/B7-H1+, znacząco wyższy odsetek dojrzałych DC z ekspresja B7-H2 oraz nieznacznie wyższy odsetek komórek CD83+/B7-H4+ w grupie chorych na raka krtani. Ekspresja wymienionych tolerogennych molekuł na dojrzałych DC może odpowiadać za dotychczasowe niepowodzenia w immunoterapii płaskonabłonkowego raka krtani przy użyciu DC stymulowanych autologicznymi lizatami komórek nowotworowych. Wydaje się zasadne zastosowanie inhibitorów cząsteczek z rodziny B7, zwłaszcza B7-H1 oraz B7-H2, które mogłyby uwrażliwić układ immunologiczny gospodarza na antygeny raka poprzez odblokowanie hamującego wpływu wymienionych molekuł na cytotoksyczność limfocytów T, co skutkować może poprawą wyników immunoterapii.

418 otolaryngologia polska 66 (2012) 413 418 Wkład autorów/authors contribution J. Klatka jest głównym badaczem oraz przewodniczącym zespołu autorów, E. Grywalska brała udział w zbieraniu danych, przygotował wyniki badań do analizy i wykonał obliczenia statystyczne, A. Andrzejczak oraz E. Trzaskowska brali udział w zbieraniu danych i przygotowaniu manuskryptu, M. Wasiak i P. Wdowiak wykonały oznaczenia laboratoryjne i brał udział w przygotowaniu manuskryptu, autor J. Roliński brał udział w interpretacji danych. Konflikt interesu/conflict of interest Nie występuje. piśmiennictwo/references [1] Pantel M, Guntinas-Lichius O. Laryngeal carcinoma: Epidemiology, risk factors and survival. HNO 2012;60:32 40. [2] Ren J, Zhu D, Liu M, Sun Y, Tian L. Downregulation of mir-21 modulates Ras expression to promote apoptosis and suppress invasion of Laryngeal squamous cell carcinoma. Eur J Cancer 2010;46:3409 3416. [3] Habl G, Jensen AD, Potthoff K, Uhl M, Hof H, Hajda J, et al. Treatment of locally advanced carcinomas of head and neck with intensity-modulated radiation therapy (IMRT) in combination with cetuximab and chemotherapy: the REACH protocol. BMC Cancer 2010;10:651. [4] Kardasz-Ziomek M, Scierski W, Namysłowski G, Majewski W. Long term results of partial laryngectomies in patients suffering from laryngeal cancer. Otolaryngol Pol 2012;66:46 50. [5] Ritoe SC, de Vegt F, Scheike IM, Krabbe PF, Kaanders JH, van den Hoogen FJ, et al. Effect of routine follow-up after treatment for laryngeal cancer on life expectancy and mortality: results of a Markov model analysis. Cancer 2007;109:239 247. [6] Wang BQ, Zhang CM, Gao W, Wang XF, Zhang HL, Yang PC. Cancer-derived matrix metalloproteinase-9 contributes to tumor tolerance. J Cancer Res Clin Oncol 2011;137:1525 1533. [7] Liang W, Wang XF. In vitro induction of specific antitumoral immunity against laryngeal carcinoma by using human interleukin-12 gene-transfecteddendritic cells. Chin Med J (Engl) 2011;124:1357 1361. [8] Ma XJ, Pan XL, Lv ZH, Xu FL, Liu da Y, Lei da P, et al. Therapeutic influence on circulating and monocyte-derived dendritic cells in laryngeal squamous cell carcinoma patients. Acta Otolaryngol 2009;129:84 91. [9] Xia Y, Chen R, Ye SL, Sun R, Chen J, Zhao Y. Inhibition of T-cell responses by intratumoral hepatic stellate cells contribute to migration and invasion of hepatocellular carcinoma. Clin Exp Metastasis 2011;28:661 674. [10] Yao S, Zhu Y, Zhu G, Augustine M, Zheng L, Goode DJ, et al. B7-h2 is a costimulatory ligand for CD28 in human. Immunity 2011;34:729 740. [11] Choi IH, Zhu G, Sica GL, Strome SE, Cheville JC, Lau JS, et al. Genomic organization and expression analysis of B7-H4, an immune inhibitory molecule of the B7 family. J Immunol 2003;171:4650 4654. [12] Balm AJ, van den Brekel MW, Tan IB, Hilgers FJ. The indwelling voice prosthesis for speech rehabilitation after total laryngectomy: a safe approach. Otolaryngol Pol 2011;65:402 409. [13] Kiprian D, Kawecki A, Jarza bski A, Michalski W, Pawłowska-Sendułka B. The results and toxicity of organ preservation treatment for locoregionally advanced laryngeal and hypopharyngeal cancer. Otolaryngol Pol 2011;65:363 368. [14] Liang W, Wang XF. In vitro induction of specific antitumoral immunity against laryngeal carcinoma by using human interleukin-12 gene-transfected dendritic cells. Chin Med J (Engl) 2011;124:1357 1361. [15] Wang X, Zhang L, Du X, Liang W, Yuan Y. Experimental studies on the antitumor immunity induced by total laryngeal carcinoma RNA- transfected dendritic cells. Lin Chung Er Bi Yan Hou Tou Jing Wai Ke Za Zhi 2010;24: 843 846. [16] Nurieva RI, Liu X, Dong C. Yin-Yang of costimulation: crucial controls of immune tolerance and function. Immunol Rev 2009;229:88 100. [17] Yamazaki T, Akiba H, Koyanagi A, Azuma M, Yagita H, Okumura K. Blockade of B7-H1 on macrophages suppresses CD4+ T cell proliferation by augmenting IFN-gammainduced nitric oxide production. J Immunol 2005;175: 1586 1592. [18] Mirza N, Duque MA, Dominguez AL, Schrum AG, Dong H, Lustgarten J. B7-H1 expression on old CD8+ T cells negatively regulates the activation of immune responses in aged animals. J Immunol 2010;184:5466 5474. [19] Kim HK, Guan H, Zu G, Li H, Wu L, Feng X, et al. High-level expression of B7-H1 molecules by dendritic cells suppresses the function of activated T cells and desensitizes allergen-primed animals. J Leukoc Biol 2006;79:686 695. [20] Wang S, Zhu G, Chapoval AI, Dong H, Tamada K, Ni J, et al. Costimulation of T cells by B7-H2, a B7-like molecule that binds ICOS. Blood 2000;96:2808 2813. [21] Sica GL, Choi IH, Zhu G, Tamada K, Wang SD, Tamura H, et al. B7-H4, a molecule of the B7 family, negatively regulates T cell immunity. Immunity 2003;18:849 861. [22] Kryczek I, Wei S, Zou L, Zhu G, Mottram P, Xu H, et al. Cutting edge: induction of B7-H4 on APCs through IL-10: novel suppressive mode for regulatory T cells. J Immunol 2006;177:40 44. [23] Miyatake T, Tringler B, Liu W, Liu SH, Papkoff J, Enomoto T, et al. B7-H4 (DD-O110) is overexpressed in high risk uterine endometrioid adenocarcinomas and inversely correlated with tumor T-cell infiltration. Gynecol Oncol 2007;106: 119 127. [24] Tringler B, Zhuo S, Pilkington G, Torkko KC, Singh M, Lucia MS, et al. B7-h4 is highly expressed in ductal and lobular breast cancer. Clin Cancer Res 2005;11:1842 1848. [25] Kryczek I, Zou L, Rodriguez P, Zhu G, Wei S, Mottram P, et al. B7-H4 expression identifies a novel suppressive macrophage population in human ovarian carcinoma. J Exp Med 2006;203:871 881.