Analiza genetyczna w niepowodzeniach ciąży i badaniach prenatalnych Dr n. med. Joanna Walczak- Sztulpa Katedra i Zakład Genetyki Medycznej Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu
Diagnostyka niepowodzeń ciąży Badania cytogenetyczne i molekularne: Badanie kariotypu rodziców po dwóch poronieniach, po jedynym porodzie martwym Ocena kariotypu poronionego zarodka/płodu Skrining genów
Diagnostyka prenatalna chorób genetycznych Aberracje chromosomowe Metody klasycznej cytogenetyki FISH QF- PCR MLPA acgh Choroby uwarunkowane jednogenowo Metody biologii molekularnej
Analiza kariotypu metodą klasyczną Hodowla amniocytów (komórek płynu owodniowego), trofoblastu lub limfocytów pośrednia lub bezpośrednia Możliwość oceny wszystkich chromosomów Kontaminacja komórkami matczynymi wzrastanie komórek matczynych (kariotypy żeńskie prawidłowe) Długi czas oczekiwania na wynik 2-3 tygodnie
Kariotyp komórek płynu owodniowego
FISH fluorescencyjna hybrydyzacja in situ Hybrydyzacja DNA chromosomów lub jąder interfazowych z sondą molekularną wyznakowaną fluorescencyjnie Diagnostyka wybranych aberracji chromosomowych Wynik uzyskany wciągu 1-2 dni
Zastosowanie wielokolorowych sond molekularnych do określenia liczby kopii chromosomów chromosom X chromosom Y chromosom 18 chromosom 13 chromosom 21 a płytka metafazowa i jądro interfazowe limfocytów b - jądro niehodowanej komórki płynu owodniowego płód żeński c - jądro niehodowanej komórki płynu owodniowego płód męski d - jądro niehodowanej komórki płynu owodniowego- płód męski z trisomią chromosomu 21
Wyniki FISH przeprowadzone bezpośrednio na niehodowanych komórkach płynu owodniowego komercyjna sonda 22q11.2; wykrycie mikrodelecji charakterystycznej dla zespołu podniebno- sercowo- twarzowego; kontrolna sonda specyficzna dla 22q
QF- PCR - Quanftafve fluorescence polymerase chain reacfon Amplifikacja specyficznych regionów mikrosatelitarnych (wysoce polimorficznych krótkich powtórzeń tandemowych typu STR) z zastosowaniem fluorescencyjnych starterów w reakcji PCR Ilościowa ocena produktów po amplifikacji Szybka diagnostyka najczęstszych aneuploidii, np. 13, 18, 21
Wynik
Wykrycie trisomii 13 metodą QF- PCR
Wykrycie trisomii 18 metodą QF- PCR
Wykrycie trisomii 21 metodą QF- PCR
Wynik QF- PCR
MLPA - Mulfplex Ligafon - dependent Probe Amplificafon Połączenie metody hybrydyzacji i PCR Umożliwia ilościową ocenę 40 różnych sekwencji w jednym badaniu Ilościowa ocena produktów po amplifikacji Szybka diagnostyka najczęstszych aneuploidii, np. 13,18, 21
MLPA - Mulfplex Ligafon - dependent Probe Amplificafon
Określenie liczby kopii chromosomu X
Badania genetyczne materiału z poronienia mogą wskazać nosicielstwo mikrorearanżacji materiału genetycznego u któregoś z partnerów Jedyną metodą diagnostyczną jest ArrayCGX materiału z poronienia! Mikromacierze kliniczne ArrayCGX
Mikromacierz DNA (ang. DNA microarray) Szklana lub plasfkowa płytka wielkości szkiełka mikroskopowego z naniesionymi w regularnych pozycjach polami (ang.spots) mikroskopijnej wielkości. Pola te zawierają różniące się od siebie sekwencją jednoniciowe cząsteczki DNA, które są sondami molekularnymi mającymi zdolność specyficznego wiązania komplementarnych sekwencji DNA badanego.
Technologia mikromacierzy arraycgh I. Stanowi przełom w diagnostyce genetycznej II. Umożliwia w jednym badaniu wykrycie wszystkich niezrównoważonych aberracji chromosomowych oraz submikroskopowych mikrodelecji i mikroduplikacji III. Nie wymaga hodowli komórek IV. Krótki czas oczekiwania na wynik
acgh genomowa hybrydyzacja porównawcza do mikromacierzy Hybrydyzacja wyznakowanego fluorescencyjnie DNA pacjenta do płytki mikromacierzy z naniesionymi sekwencjami DNA w postaci klonów BAC lub fragmentów oligonukleotydowych Rozdzielczość od 1Mpz do <100 kpz (?) Nie identyfikuje zmian zrównoważonych oraz poliploidii Czasami trudna interpretacja uzyskanych wyników
Array- CGH
Array- CGH Test DNA e.g. Cancer Cot-1 DNA Reference DNA
Array- CGH Sample Reference Sample Reference Sample Reference
Analiza wyników - Array- CGH
Wynik Array- CGH
Przykład 1 Ciąża III, poronienie II, 10 Hbd, zdrowych, niespokrewnionych rodziców kariotypy obojga prawidłowe. W materiale z ciąży III stwierdzono interstycjalną duplikację w chromosomie 7 pary (region 7q11.23; rozmiar duplikacji 4.22 Mb). Zmiana znajduje się w regionie krytycznym dla zespołu mikroduplikacyjnego 7q11.23.
Przykład 2 Ciąża III, poronienie II, 17 Hbd. Rodzice niespokrewnieni, kariotypy obojga prawidłowe. Wynik badania techniką mikromacierzy kosmówki z ciąży III: Terminalna delecja w chromosomie 4 (region 4p16.3-4p14; rozmiar 33,44 Mb). Zmiana obejmuje region krytyczny dla zespołu Wolf- Hirschhorn.
Dziękuję za uwagę!