Zasady i metody klasycznej i molekularnej diagnostyki cytogenetycznej. Beata Nowakowska,

Transkrypt

1 Zasady i metody klasycznej i molekularnej diagnostyki cytogenetycznej Beata Nowakowska,

2 Cytogenetyka Dział genetyki zajmujący się badaniem chromosomów. Koncentruje się zarówno na kształcie jak i liczbie chromosomów oraz na ich dziedziczeniu. Klasyczne badanie cytogenetyczne - opiera się na analizie chromosomów w stadium metafazy cytogenetyka molekularna - umożliwia badanie materiału genetycznego w stadium interfazy

3 Rola i znaczenie badań cytogenetycznych Badanie cytogenetyczne stanowi podstawę: pre- i postnatalnego rozpoznania chorób i zespołów uwarunkowanych aberracjami chromosomowymi identyfikacji rodzin ryzyka genetycznego poznawania etiologii i patomechanizmu chorób genetycznych

4 Od chromosomu do nukleotydu Cytogenetyka Sekwencjonowanie CGH NGS CNV SNP + CNV (?)

5 Rozdzielczość metod cytogenetyki molekularnej Klasyczne metody oceny kariotypu >4 Mpz FISH kpz MLPA pz HR-CGH >3 Mpz Mikromacierze CGH 1 Mpz 20 pz Sekwencjonowanie DNA- 1pz

6 Metody cytogenetyki klasycznej - hodowla limfocytów krwi obwodowej

7 Limfocyty T odpowiedzialne za odpowiedź odpornościową komórkową U osoby zdrowej stanowią ~70% populacji wszystkich limfocytów Limfocyty B odpowiedzialne za rozpoznanie antygenu i wytwarzanie przeciwciał Limfocyty Tylko limfocyty ulegają pobudzeniu przez czynnik wzrostu

8 Każdy chromosom ma specyficzny dla siebie obraz (wzór) prążkowy, czyli układ poprzecznych prążków, różniących się wielkością i intensywnością zabarwienia. W haploidalnym zestawie chromosomów metafazowych można wyróżnić około 400 prążków. Chromosomy z wcześniejszych stadiów podziału chromosomowego, prometafazowe lub profazowe, wykazują, zależnie od stopnia kondensacji, prążków. Wielkość najmniejszej aberracji która może być w nim rozpoznana odpowiada 7-10 Mpz, przy 400 prążkach i zwiększa się do 2-5 Mpz przy 850 prążkach. Analiza prążkowa chromosomów

9 Każda para chromosomów musi być przeanalizowana co najmniej dwukrotnie (każdy region prążkowy) przy zalecanej rozdzielczości na podstawie wzorców z ISCN 6p21.3 region 2 prążek 1 subprążek 2

10 46,XX

11 Kariotyp prawidłowy męski, rozdzielczość 450 prążków

12 Kariotyp prawidłowy męski, rozdzielczość 750 prążków

13 47,XY,+21

14 Trisomia 21 (zespół Downa), 47,XY,+21

15 47,XY,+21

16 47,XXY

17 47,XXX

18 47,XY,+mar

19 X del(x) 46,X,del(X)(q21)

20 46,X,del(X)(q21)

21 46,X,t(X;3)(p21.1;12.1)

22 3 der(3) der(x) X t(x;3)(p21.1;12.1)

23 45,XY,der(13;14)(q10;q10)

24 46,XY,add(7)(q36)

25 Translokacja Robertsonowska zrównoważona, 46,XY,der(13;14)(p11,p11)

26 Translokacja Robertsonowska niezrównoważona, trisomia 13 (zespół Patau) 46,XY,der(13;14)(q10;q10),+13

27 Translokacja wzajemna zrównoważona, 46,XX,t(4;7)(p15.2;q11.2)

28 Delecja w obrębie długiego ramienia chromosomu 18 pary, 46,XY,del(18)(q21.3)

29 Metody cytogenetyki molekularnej

30 Technika FISH umożliwia identyfikację specyficznych sekwencji DNA w chromosomach metafazowych, jądrach interfazowych lub skrawkach tkanek znajdujących się w preparatach cytologicznych.

31 RODZAJE SOND MOLEKULARNYCH subtelomer centromer subtelomer 1. Sondy malujące 2. Sondy specyficzne do unikalnych sekwencji DNA 3. Sondy specyficzne do powtarzalnych sekwencji DNA

32 Sondy subtelomerowe Sondy malujące chromosom 12 Sondy specyficzne do unikalnych sekwencji DNA Zespół Wolfa- Translokacja (4;7)

33 Subtelomere Region-specific Probes p-arm probes fluoresce green q-arm probes fluoresce red X/Y

34 Sondy subtelomerowe Chromosomy 3 pary - prawidłowe Chromosomy 6 pary - prawidłowe Translokacja (4;7)

35 Multicolor - FISH

36 Prawidłowa liczba sygnałów 13 - sygnały zielone 21 - sygnały czerwone Nieprawidłowa liczba sygnałów 3 sygnały zielone trisomia 13 pary Rapid FISH 36

37 Metoda MLPA Zalety Możliwość analizy ~45 loci w jednym badaniu Możliwość badania do 96 próbek równocześnie Wynik badania po 24 godz. Prostota, mały koszt Zastosowanie Diagnostyka: zespołów mikrodelecji/mikroduplikacji aberracji subtelomerowych aneuploidii w badaniach prenatalnych MRC Holland

38 Starter Y do reakcji PCR 5 Y Sekwencja komplementarna do badanego regionu DNA X 3 Badany region DNA A 5 Y Ligacja i amplifikacja X Hybrydyzacj a Y Starter X do reakcji PCR Unikalnej długości sekwencje DNA Sekwencja komplementarna do badanego regionu DNA Badany region DNA B X 5 Y X 5 3 Pojedyncza sonda zawiera dwa różne oligonukleotydy (20-43 nukleotydy), których miejsca wiązania w genomie znajdują się koło siebie. Sondy swoiste dla przylegających do siebie fragmentów DNA analizowanego regionu połączone są z krótkimi, unikalnymi sekwencjami DNA o różnej długości ( nukleotydów), oflankowanymi sekwencjami komplementernymi do uniwersalnych starterów. Ilościowa analiza powstałych tak produktów PCR umożliwia odzwierciedlenie liczby kopii analizowanych loci. (d) Rozróżnienie poszczególnych sond odbywa się na drodze rozdziału elektroforetycznego w sekwenatorze, dzięki temu, że każda z sond jest innej długości Schouten, J.P. et al. Nucl. Acid Res. 30, e57. More info on 38

39 Delecja 22q

40 Duplikacja 4p 40

41 Genomowe DNA pacjenta Cot-1 DNA Genomowe DNA referencyjne addycja delecja Pozycja na chromosomie Metoda porównawczej hybrydyzacji genomowej

42

43 Sondy centromerowe 8/9 Chromosom markerowy Chromosom mar Sondy centromerowe 13/21

44 Sonda malx

45 Względna fluorescencja Porównawcza hybrydyzacja genomowa (CGH) do mikromacierzy: Genomowe DNA pacjenta Cot-1 DNA Genomowe DNA referencyjne 1 addycja delecja Profil intensywności fluorescencji Wartości progowe Pozycja na chromosomie

46 Porównawcza hybrydyzacja genomowa (CGH) do mikromacierzy: Test Sample Cy5 Reference Sample Cy3 Hybridization for 16 hrs

47 Schemat analizy DNA genomowego techniką mikromacierzy CGH: Fragment sekwencji DNA umieszczony na mikromacierzy DNA referencyjne DNA testowane Wizualizacja wyniku Fragmenty DNA umieszczone na szkiełku podstawowym Mieszanina sond Duplikacja fragmentu DNA Hybrydyzacja do mikromacierzy Wstępne przetwarzanie danych Względna fluorescencja wg. Chari i wsp. 2006

48

49 Mikromacierze DNA: CGH: identyfikacja zmiany liczby kopii fragmentów DNA (CNV) SNP: identyfikacja zmiany liczby kopii fragmentów DNA (CNV) identyfikacja disomii jednorodzicielskiej (UPD) identyfikacja utraty heterozygotyczności (LOH) identyfikacja mutacji punktowych

50 Rodzaje i zastosowanie CGH do mikromacierzy Mikromacierz skonstruowana dla określonego regionu chromosomu -region 1p36 - Yu W i wsp.,2003, -region 15q Locke i wsp.,2004, -region 18q Veltman JA i wsp., 2004, -region 17p Shaw CJ i wsp.,2004 Mikromacierz kliniczna, zawiera sondy specyficzne dla regionów krytycznych zespołów genetycznych oraz regiony subtelomerowe (Cheung SW i wsp.,2005, Shaffer L i wsp., 1999) Mikromacierz sporządzona dla całego genomu (Li Ji wsp.,2003, Cai WW i wsp.,2002 )

51 Charakterystyka mikromacierzy stosowanych w badaniach diagnostycznych

52 Mikromacierze selektywne vs. całogenomowe: 1. Targeted BAC Array 2. Whole Genome BAC Array 1MB 3. Whole Genome BAC Tiling Array 4. Oligo Targeted Array 5. Oligo Whole Genome Tiling Array

53 CNV- Copy Number Variations Zmiany liczby kopii fragmentów DNA łagodne CNVs oraz patogenne CNVs indel (insertion or deletion)

54 CNV (copy number variants) zmiana liczby kopii sekwencji DNA Large-scale copy number polymorphism in the human genome. Sebat J, Lakshmi B, Troge J, Alexander J, Young J, Lundin P, Månér S, Massa H, Walker M, Chi M, Navin N, Lucito R, Healy J, Hicks J, Ye K, Reiner A, Gilliam TC, Trask B, Patterson N, Zetterberg A, Wigler M. Science Jul 23;305(5683): Detection of large-scale variation in the human genome. Iafrate AJ, Feuk L, Rivera MN, Listewnik ML, Donahoe PK, Qi Y, Scherer SW, Lee C. Nat Genet Sep;36(9):

55 CNV: 290 fenotypowo prawidłowych osób pochodzących z różnych grup etnicznych 1668 CNVs (średnio 11 CNVs na osobę) średnia wielkość kpz (100 kpz- 10 Mpz) łącznie CNVs stanowiły 360 Mpz co stanowi 12% ludzkiego genomu (obecnie w internetowej bazie zmiany łagodne pokrywają 29% genomu) Uważa się, że CNVs są odpowiedzialne za - ewoluję - zmienność osobniczą ( np. HIV - Gonzalez et al. 2005, choroby autoimmunologiczne - Yang et al. 2007) - odpowiedź na leki (np. onkologia - Ouahchi et al. 2006) - podatność na powstawanie chorób

56 Oddziaływanie CNVs na fenotyp: Zmiana ekspresji genu Modyfikację dawki produktu danego genu Zaburzenie funkcji elementów regulatorowych Odsłonięcie alleli recesywnych

57 Interpretacja wyników badań metodą acgh Ustalenie rodzinnego pochodzenia zmiany Bazy danych wariantów polimorficznych: - Toronto Database of Genomic Variants Bazy danych osób z nieprawidłowym fenotypem: - DECIPHER Region bogaty w geny Wielkość zmiany Delecja czy duplikacja Informacje od lekarza kierującego pacjenta na badania

58 Interpretacja wyników badań metodą acgh Rodzicielskie pochodzenie CNV Mniejsze prawdopodobieństwo patogenności (>99% dziedziczonych CNV to CNV łagodne) ale w interpretacji wyniku trzeba uwzględnić: - Ocenę fenotypu rodzica, nosiciela CNV (zróżnicowanie ekspresji, niepełna penetracja, mozaikowość odziedziczone CNV np.1q21.1; 1q41q42; 3q29; 15q11.2; 15q13.2q13.3; 16p11.2; 16p13.11; 22q11.2 mogą być patogenne - Czynniki epigenetyczne (CNV zawiera piętnowany locus, np. del UBE3A od matki skutkuje chorobą u dziecka) - Możliwość ujawnienia się mutacji recesywnej gdy dotyczy drugiego allelu genu znajdującego się w obrębie CNV odziedziczonego od rodzica

59 Niepełna penetracja

60 Niepełna penetracja McCarroll S.A. Human Molecular Genetics, 2008, Vol. 17, Review Issue 2

61 Możliwość ujawnienia się mutacji recesywnej

62 Interpretacja wyników badań metodą acgh Ustalenie rodzinnego pochodzenia zmiany Bazy danych wariantów polimorficznych: - Toronto Database of Genomic Variants Bazy danych osób z nieprawidłowym fenotypem: - DECIPHER Region bogaty w geny Wielkość zmiany Delecja czy duplikacja Informacje od lekarza kierującego pacjenta na badanie

63

64

65

66 A JHG 82,

67 Interpretacja wyników badań metodą acgh Ustalenie rodzinnego pochodzenia zmiany Bazy danych wariantów polimorficznych: - Toronto Database of Genomic Variants Bazy danych osób z nieprawidłowym fenotypem: - DECIPHER Region bogaty w geny Wielkość zmiany Delecja czy duplikacja Informacje od lekarza kierującego pacjenta na badanie

68 10,7Mb delecja interstycjalna bez efektu fenotypowego

69 5q14.3q15 a FLJ11292 TMEM161B MEF2C AL Patient 1 LYSMD3 GPR98 CETN3 Patient 2 86,200,000-95,500,000 PH critical region 5.8 Mb Position MB RASA1 CCNH LOC POLR3G ARRDC3 Patient 3 FLJ42709 NR2F1 FAM172A POU5F2 AK C5orf36 CR KIAA0825 ANKRD32 MCTP1 CR SPATA9 RHOBTB3 KIAA0878 FAM81B TTC37 UNQ630 ELL2 ARSK GPR150 RFESD GLRX b Deletion: Cardoso et al.(2009) Patient 1 Deletion: Cardoso et al.(2009) Patient 2 c Deletion: Engels et al.(2009) Patient 2 Deletion: Cardoso et al.(2009) Patient 3 Deletion: Engels et al.(2009) Patient 1 Deletion: Engels et al.(2009) Patient 3 d Deletion: Le Meur et al.(2009) Patient 1 Deletion: Le Meur et al. (2009) Patient 2 Deletion: Le Meur et al. (2009) Patient 3 Deletion: Le Meur et al. (2009) Patient 4 Deletion: Le Meur et al. (2009) Patient 5 Duplication: Le Meur et al. (2009) Patient 6 Nowakowska i wsp., Am J Med. Genet Part B,

70 Wg. Buysse i wsp., Eur J Med. Genet., 2009 Średnia wielkość CNV

71 Rekomendacje ISCA The International Standard Cytogenomic Array Consortium Opracowany na podstawie 35 badań w grupie pacjentów z NI /opóźnieniem rozwoju psychoruchowego/ chorobą ze spektrum zaburzeń autystycznych (ASD) / wrodzonymi wadami rozwojowymi o nieznanej etiologii Platformy stosowane do badań diagnostycznych w przypadkach NI/ASD/WWR o nieznanej etiologii powinny być całogenomowe i mieć rozdzielczość 400 kpz Rekomenduje Podstawa: Stosując rozdzielczość ~400 kpz wykrywamy wszystkie znane i powtarzające się zmiany warunkujące choroby genomowe i większość unikalnych, patogennych niezrównoważeń genomu oraz niewielką liczbę łagodnych CNV Kariotyp konwencjonalny powinien być wykonywany w przypadkach wywiadu rodzinnego obciążonego zrównoważoną rearanżacją chromosomową lub licznymi poronieniami oraz w przypadkach znanych zespołów aneuploidii (tris.21, 13, zespół Turnera i Klinfeltera)

72 CNV stwierdzane metodą acgh w różnych grupach klinicznych Szacuje się, że aż 15% chorób genetycznych uwarunkowana jest submikroskopowym niezrównoważeniem genomu Noworodki z wielowadziem i/lub cechami dysmorfii ~ 14-28% Niepełnosprawność intelektualna / opóźnienie rozwoju 9 13% psychoruchowego (3 5% met. GTG) Mikromacierze są ok. 3 krotnie skuteczniejsze w diagnostyce niezrównoważenia genomu niż badania metodami konwencjonalnymi

73 Przydatność diagnostyczna metody acgh w badaniach prenatalnych: Wapner et al. June, 2014

74 Internetowe bazy danych: Wapner et al. June,

75 Przydatność kliniczna badań na mikromacierzach Badania na mikromacierzach umożliwiają: Lepsze poznanie i zrozumienie fenotypowej zmienności w znanych zespołach genetycznych Wyjaśnianie genetycznej etiologii znanych zespołów (poprzez identyfikację genów odpowiedzialnych za patologię np. CHD7 w zespole CHARGE) Diagnostykę rzadkich zespołów genetycznych Odkrywanie nowych zespołów mikrodelecji/mikroduplikacji Poznawanie znaczenia klinicznego mozaikowości (w 8 10% mozaikowość nie wykrywana badaniami konwencjonalnymi) Wzbogacanie wiedzy o polimorfizmie genetycznym (częstość i rozmieszczenie w genomie CNV, 4000 loci), jego aspektach klinicznych np. znaczenia dla predyspozycji do chorób wieloczynnikowych (autyzm, Alzheimer, nowotwory)

76 Interpretation of array comparative genome hybridization data: a major challenge. Gijsbers AC, Schoumans J, Ruivenkamp CA. Cytogenet Genome Res. 2011;135(3-4):222-7

77 Porównawcza hybrydyzacja genomowa do mikromacierzy (acgh) Zalety Duża rozdzielczość Precyzyjne mapowanie miejsc złamań Wykrywanie duplikacji Ograniczenia Nie wykrywa zrównoważonych rearanżacji i poliploidii (~0.3% osób z NI ma aberrację zrównoważoną) Duża liczba wykrywanych polimorfizmów Problemy z interpretacją wyników badań Wykrywanie mozaikowatości (10% BAC, 30% oligonukleotydowe)

78 Metoda Rozdzielczość Zalety Problem Ograniczenia Skutki GTG 4 10 Mpz Identyfikacja aberracji zrównoważonych Mała rozdzielczość Subiektywizm oceny nie identyfikowane mikroaberracje wysokie ryzyko błędu FISH kpz Wysoka rozdzielczość Łatwość MLPA pz wykonania Cena ograniczona liczba analizowanych loci konieczność znajomości regionu patologii Wieloetapowa identyfikacja aberracji HR-CGH >3 Mpz Analiza całego genomu Identyfikacja dodatkowego materiału Mała rozdzielczość Nie identyfikowane aberracje zrównoważone nie identyfikowane mikroaberracje Nie identyfikowane translokacje zrównoważone acgh 1 Mpz do kpz Duża rozdzielczość Wykrywanie mozaikowości Nie identyfikowane aberracje zrównoważone Wykrywanie polimorfizmów Nie identyfikowane translokacje zrównoważone Trudności w interpretacji

79 1997 r. 79