RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 18419 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 23.06.06 06769014.9 (13) (1) T3 Int.Cl. C12N /00 (06.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 04.0.16 Europejski Biuletyn Patentowy 16/18 EP 18419 B1 (4) Tytuł wynalazku: Sposób oddzielania pochodzących ze szpiku kostnego komórek jądrzastych do tworzenia kości () Pierwszeństwo: 16.0.06 KR 060043936 (43) Zgłoszenie ogłoszono: 28.01.09 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 09/0 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono:.11.16 Wiadomości Urzędu Patentowego 16/11 (73) Uprawniony z patentu: Sewon Cellontech Co., Ltd., Seoul, KR (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP 18419 T3 HYUN-SHIN PARK, Seoul, KR JAE-DEOG JANG, Seoul, KR SAE-BOM LEE, Seoul, KR CHEONG-HO CHANG, Seoul, KR (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Magdalena Tagowska PATPOL KANCELARIA PATENTOWA SP. Z O.O. ul. Nowoursynowska 162 J 02-776 Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).
1 2 3 Opis Dziedzina wynalazku [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu oddzielania pochodzących ze szpiku kostnego komórek jądrzastych do tworzenia kości, a bardziej szczegółowo sposobu umożliwiającego szybkie i dogodne oddzielenie pochodzących ze szpiku komórek jądrzastych, które mogą być przeszczepione do miejsca wymagającego tworzenia się kości lub leczenia defektu kości. Zgodnie ze sposobem według wynalazku, tworzenie się kości, u pacjentów w stanach nagłych lub pacjentów poddawanych wielokrotnym operacjom chirurgicznym, może być skutecznie osiągnięte przez oddzielanie komórek jądrzastych w celu tworzenia się kości w miejscu prowadzenia operacji, w dogodny i szybki sposób, i wstrzykiwania oddzielonych komórek pacjentom. Stan techniki [0002] Według raportu WHO, ponad 0% starszej populacji, w wieku 6 lat lub starszej, cierpi na przewlekłe choroby kości, a wskaźnik złamań kości powodowanych przez osteoporozę zwiększył się o ponad dwa razy w ciągu ostatnich dziesięciu lat. Odpowiada to więcej niż około % populacji kobiet w wieku 0 lat lub starszych. W USA około 600 000 osób rocznie cierpi z powodu złamań kości, z których 3 0 000 osób jest poddawanych operacji. Według danych statystycznych Medical Data International (MDI) przeszczep kostny przeprowadzono w około 426 000 przypadków. Koszt użycia przeszczepu kostnego wynosi około osiemset milionów dolarów rocznie na cały świecie, a w roku 199 autoprzeszczep, alloprzeszep i przeszczep syntetycznych materiałów przeprowadzono w stosunku około 8%: 34%: 8%. [0003] Zazwyczaj proste złamanie jest wystarczająco leczone tylko unieruchomieniem przez kilka tygodni, ale w przypadku poważnego złamania lub ubytku kostnego, przeprowadzane są operacje przeszczepu kostnego. Jednak autoprzeszczep powoduje silny ból w miejscu pobrania, wymaga długiego okresu rekonwalescencji i występuje trudność w uzyskaniu miejsca pobrania przeszczepu kostnego. Alloprzeszczep jest bardzo ograniczony w stosowaniu z powodu osłabienia wytrzymałości kości, spowodowanego przez sterylizację, immunologicznej odpowiedzi odrzucenia, resorpcji i powtórnego złamania i posiada poważną wadę, że istnieje możliwość zakażenia, takiego jak zapalenie wątroby lub AIDS. Z tego powodu stosowanie przeszczepu zostało zmniejszone w drugiej połowie 1993 po zaostrzonych regulacjach Agencji Żywności i Leków (ang. Food & Drug Administration) dla banku tkanki kostnej, dotyczących zakażenia. [0004] W innej metodzie przeszczepu kostnego w chirurgii ortopedycznej stosuje się jako podparcie, na przykład, metal pokryty biologicznie aktywną lub nieaktywną ceramiką. Jednak stosowanie metalu jako materiału przeszczepu kostnego wiąże się z wieloma trudnościami spowodowanymi problemami, takimi jak korozja metalu, ścieranie powierzchni ceramika-metal i tworzenie masywnej tkanki włóknistej na powierzchniach kości i przeszczepu. [000] Jeśli chodzi o czynniki morfogenetyczne kości to od 192, gdy Urist i Mclean zaprezentowali kostną morfogenezę białek morfogenetycznych kości, badano różne czynniki. Jednak czynniki te mają ograniczenia w ich powszechnym zastosowaniu klinicznym, ponieważ są niewydajne, bo są wytwarzane za pomocą złożonego i kosztownego procesu, w małych ilościach. [0006] Wstrzyknięcie szpiku kostnego oparto na doniesieniach Huggins a (1931), Friedensteina (1973), Ashtona (1980) i tym podobnych, które wskazywały, że komórki osteoprogenitorowe w szpiku kostnym indukują i promują tworzenie się kości. To wstrzyknięcie szpiku kostnego, samego lub w kombinacji z przeszczepem kostnym, przeprowadza się głównie dla gojenia złamania kości. W przeciwieństwie do innych 1
1 2 3 metod przeszczepu kostnego nie wykonuje się nacięcia skóry w miejscu pobrania, a zatem nie ma problemu związanego z miejscem pobrania. W dodatku nie ma powikłań lub skutków ubocznych. [0007] Od tego czasu, mimo dobrych wyników klinicznego stosowania wstrzyknięcia szpiku kostnego, donoszono również, że znaczna część wyników nie jest powtarzalna. Również teoretyczna podstawa wyników nie jest jasna, gdyż ilość szpiku kostnego, którą można uzyskać z jednego miejsca, jest ograniczona, a liczba komórek osteoprogenitorowych, zawartych w szpiku kostnym, jest bardzo ograniczona. [0008] Zatem bardzo skuteczne jest stosowanie nowego sposobu przeszczepu kostnego dla tworzenia się kości, który obejmuje amplifikację i hodowlę komórek osteoprogenitorowych do wystarczającej liczby osteoblastów i wstrzyknięcie hodowanych osteoblastów do miejsca tworzenia się kości. Mimo, że ten sposób ma wiele zalet i efektów, w porównaniu z istniejącymi metodami autoprzeszczepu, alloprzeszczepu i wstrzykiwania szpiku kostnego, istnieje problem z tym, że ponieważ wymaga 3-4 tygodniowego okresu hodowli dla proliferacji osteoblastów, jest trudny do stosowania u pacjentów w nagłych przypadkach lub pacjentów, którzy wymagają powtórnych operacji chirurgicznych. Ujawnienie wynalazku Problem techniczny [0009] Niniejszy wynalazek został opracowany w celu rozwiązania powyżej opisanych problemów, występujących w stanie techniki, i pierwszym przedmiotem niniejszego wynalazku jest dostarczenie sposobu oddzielania pochodzących ze szpiku kostnego komórek jądrzastych do tworzenia kości, co zmniejsza problemy implantacji, przeszczepu kostnego, przeszczepu hodowanych osteoblastów i tym podobnych. Drugim przedmiotem niniejszego wynalazku jest dostarczenie sposobu oddzielania pochodzących ze szpiku kostnego komórek jądrzastych do tworzenia kości, który eliminuje kliniczną odpowiedź odrzucenia, przez ekstrakcję małej ilości szpiku kostnego do tworzenia się kości, oddzielenie tylko komórek jądrzastych dla tworzenia się kości ze szpiku kostnego i wstrzyknięcie oddzielonych komórek. Trzecim przedmiotem niniejszego wynalazku jest dostarczenie sposobu oddzielenia pochodzących ze szpiku kostnego komórek jądrzastych dla tworzenia kości, który spowoduje efektywne tworzenie się kości u pacjentów w nagłych przypadkach lub pacjentów poddawanych wielokrotnym operacjom chirurgicznym, poprzez oddzielenie komórek jądrzastych do tworzenia się kości w miejscu prowadzenia operacji, w dogodny i szybki sposób, i wstrzykiwanie oddzielonych komórek pacjentom. Czwartym przedmiotem niniejszego wynalazku jest dostarczenie sposobu oddzielania pochodzących ze szpiku kostnego komórek jądrzastych do tworzenia kości, który umożliwia efektywne tworzenie się kości indukowane przez oddzielenie komórek jądrzastych ze szpiku kostnego, pobranego według niniejszego wynalazku i wstrzykiwanie oddzielonych komórek do miejsca tworzenia się kości. Ponadto piątym przedmiotem niniejszego wynalazku jest dostarczenie sposobu oddzielania pochodzących ze szpiku kostnego komórek jądrzastych do tworzenia się kości, który znacznie zwiększy niezawodność oddzielania komórek, tak że zwiększana jest perspektywa odbiorców na lepiej oddzielone komórki. Rozwiązanie techniczne [00] Aby osiągnąć powyższe cele niniejszy wynalazek dostarcza sposób oddzielania pochodzących ze szpiku kostnego komórek do tworzenia kości, który obejmuje etapy: przemywanie szpiku kostnego; liza czerwonych krwinek w szpiku kostnym; neutralizowanie lizatu szpiku kostnego; oczyszczanie komórek jądrzastych z neutralizowanego szpiku kostnego; i mieszanie komórek jądrzastych z buforem podtrzymującym do tworzenia się kości, jak określono w zastrzeżeniu 1. 2
1 2 3 Najlepszy sposób realizacji wynalazku [0011] Poniżej korzystna postać wykonania niniejszego wynalazku będzie opisana bardziej szczegółowo. [0012] Konstrukcja sposobu według wynalazku do oddzielania pochodzących ze szpiku komórek jądrzastych dla tworzenia się kości jest następująca. [0013] W poniższym opisie szczegółowy opis znanych funkcji i konfiguracji, użytych w niniejszym opisie, będzie pominięty, gdy może to uczynić przedmiot niniejszego wynalazku niejasnym. [0014] Ponadto określenia opisane poniżej ustalono biorąc pod uwagę funkcje niniejszego wynalazku. Ponieważ określenia mogą być zmienione zgodnie z intencją producenta lub praktyką, znaczenia określeń powinny być definiowane na podstawie całej treści specyfikacji. [001] Sposób według wynalazku obejmuje etapy: przemywanie szpiku kostnego; lizę czerwonych krwinek w szpiku kostnym; neutralizowanie lizatu szpiku kostnego; oczyszczanie komórek jądrzastych z neutralizowanego szpiku kostnego; i mieszanie komórek jądrzastych z buforem podtrzymującym dla tworzenia się kości; i jego techniczna konstrukcja przedstawia się następująco. [0016] Etap przemywania szpiku kostnego obejmuje podetapy: pobranie 2- ml szpiku kostnego od pacjenta i przechowywanie pobranego szpiku kostnego w buforze do przemywania; potrząsanie buforu do przemywania ze szpikiem kostnym, w celu skutecznego usunięcia zanieczyszczeń lub składników tłuszczowych ze szpiku kostnego i wirowanie wstrząsanego buforu do przemywania przy 1600 rpm przez 4- minut; usuwanie supernatantu, przenoszenie pozostałego składnika szpiku kostnego do innego pojemnika do przemywania, wstrząsanie pojemnika zawierającego szpik kostny, aż do odpowiedniego wymieszania, a następnie wirowanie wstrząsanego roztworu przy 1600 rpm przez 4- minut; i usuwanie supernatantu z wirowanego roztworu. [0017] Również etap lizy czerwonych krwinek obejmuje podetapy: dodanie -krotnej ilości buforu do lizy do szpiku kostnego; i mieszanie buforu do lizy ze szpikiem kostnym kilka razy przy użyciu strzykawki a następnie odstawienie roztworu na - sekund. [0018] Również etap neutralizowania roztworu szpiku kostnego obejmuje podetapy: mieszanie roztworu szpiku kostnego z taką samą ilością buforu neutralizującego; i wirowanie tego roztworu przy 1600 rpm przez 4- minut, a następnie usuwanie supernatantu z wyjątkiem strąconych komórek jądrzastych przeznaczonych do tworzenia kości. [0019] Ponadto etap oczyszczania komórek jądrzastych obejmuje podetapy: mieszanie 4- ml buforu podtrzymującego z komórkami jądrzastymi w pojemniku; i wirowanie tego roztworu przy 1600 rpm przez 4- minut, a następnie usuwanie supernatantu. [00] W dodatku etap mieszania komórek jądrzastych z buforem podtrzymującym obejmuje podetapy: dodanie 2-3 ml buforu podtrzymującego do komórek jądrzastych przez wzgląd na uszkodzenie, a następnie unoszenie komórek jądrzastych na dnie pojemnika za pomocą strzykawki; i umieszczenie komórek jądrzastych i buforu podtrzymującego w strzykawce, a następnie wstrzykiwanie zawartości strzykawki do miejsca ubytku kostnego lub miejsca wymagającego tworzenia się kości. Sposób realizacji wynalazku [0021] Zgodnie ze sposobem według niniejszego wynalazku pochodzące ze szpiku komórki jądrzaste do tworzenia kości, które mogą być przeszczepione do miejsca wymagającego leczenia ubytku kostnego lub tworzenia się kości, mogą być oddzielane w miejscu prowadzenia zabiegu chirurgicznego w szybki i dogodny sposób. Przykład sposobu według wynalazku jest następujący. 3
1 2 3 Przykład [0022] Najpierw zestaw do oddzielania pochodzących ze szpiku kostnego komórek jądrzastych do tworzenia kości jest tak przygotowany, aby miał następujące elementy: 1) Dwa roztwory do przechowywania i przemywania pobranego szpiku kostnego; 2) Bufor do lizy czerwonych krwinek; 3) Bufor neutralizujący; 4) Bufor podtrzymujący do tworzenia kości; i ) Strzykawka do przeszczepu kostnego [0023] Stosując zestaw o wyżej wskazanych elementach, sposób według wynalazku, do oddzielania pochodzących ze szpiku kostnego komórek do tworzenia kości, można przeprowadzić następująco. 1) 2- ml szpiku kostnego pobiera się od pacjenta i przechowuje w roztworze do przemywania. W pobranym z grzebienia biodrowego szpiku kostnym, ilość czystego szpiku kostnego wynosi około 2- ml, a pobranie przekraczające tą ilość odpowiada składnikom krwi obwodowej. Zatem skuteczne dla pobrania czystego szpiku kostnego jest pobranie szpiku kostnego w ilości 2- ml. 2) Pojemnik zawierający szpik kostny w roztworze do przemywania jest wstrząsany, aż do wystarczającego usunięcia zanieczyszczeń lub składników tłuszczowych ze szpiku kostnego, a następnie roztwór jest wirowany przy 1600 rpm przez minut. Prędkość (rpm) i czas wirowania są minimalnymi warunkami, w których komórki są strącane bez uszkodzeń. 3) Po usunięciu supernatantu, składnik szpiku kostnego utrzymujący się na dnie pojemnika jest przenoszony do drugiego roztworu do przemywania, a pojemnik zawierający szpik kostny jest wstrząsany, aż do wystarczającego wymieszania szpiku kostnego z drugim roztworem do przemywania, a następnie roztwór jest wirowany przy 1600 rpm przez minut. 4) Po usunięciu supernatantu -krotna ilość buforu do lizy czerwonych krwinek jest dodawana do pozostałego roztworu szpiku kostnego. -krotna ilość buforu do lizy służy do lizy czerwonych krwinek w roztworze szpiku kostnego, przy wykorzystaniu ciśnienia osmotycznego minimalizującego jednocześnie uszkodzenie komórek jądrzastych. ) Bufor do lizy i roztwór szpiku kostnego są mieszane kilka razy ze sobą przy wykorzystaniu strzykawki, a następnie pozostawione do odstania na - sekund do dokonania lizy krwinek czerwonych. 6) Ta sama ilość buforu neutralizującego jest dodawana do szpiku kostnego, a następnie ostrożnie wstrząsana w celu mieszania buforu neutralizującego ze szpikiem kostnym. Stosowany tu bufor neutralizujący jest -krotnie stężonym buforem. 7) Po wirowaniu wspomnianego roztworu przy 1600 rpm przez minut, supernatant, z wyjątkiem wytrąconych komórek jądrzastych do tworzenia kości, jest usuwany. 8) Bufor podtrzymujący do tworzenia kości jest dodawany do pojemnika zawierającego komórki jądrzaste, a następnie pojemnik jest wstrząsany kilka razy. 9) Roztwór jest wirowany przy 1600 rpm przez minut, a supernatant jest usuwany. ) Bufor podtrzymujący do tworzenia kości jest dodawany do komórek w ilości wybranej ze względu na wielkość uszkodzenia, a następnie komórki na dnie pojemnika są unoszone z wykorzystaniem strzykawki. 11) Komórki jądrzaste do tworzenia kości i bufor podtrzymujący do tworzenia kości są umieszczane w strzykawce, a następnie wstrzykiwane w miejsce ubytku kostnego lub miejsce wymagające tworzenia się kości. 4
1 [0024] Zgodnie z wyżej opisanym sposobem, komórki jądrzaste do tworzenia kości są oddzielane ze szpiku kostnego pobranego od pacjenta i wstrzykiwane w miejsce wymagające tworzenia się kości, po czym kliniczna odpowiedź odrzucania nie występuje. Również przez to, że komórki jądrzaste do tworzenia kości są oddzielane i przeszczepiane w krótkim czasie po pobraniu szpiku kostnego, tworzenie się kości można indukować w efektywny i szybki sposób. Zastosowanie przemysłowe [002] Jak opisano szczegółowo powyżej, niniejszy wynalazek ma na celu niwelowanie problemów występujących przy implantacji, przeszczepie kostnym, przeszczepianiu hodowanych osteoblastów i tym podobnych. W szczególności, według niniejszego wynalazku, kliniczna odpowiedź odrzucenia jest eliminowana przez pobieranie małych ilości szpiku kostnego do tworzenia kości, oddzielanie ze szpiku kostnego tylko komórek jądrzastych do tworzenia kości i wstrzykiwanie oddzielonych komórek. [0026] Również według niniejszego wynalazku skuteczne tworzenie się kości, u pacjentów w nagłych przypadkach lub pacjentów poddawanych wielokrotnym operacjom chirurgicznym, osiąga się przez oddzielanie komórek jądrzastych do tworzenia kości w miejscu prowadzenia zabiegów chirurgicznych w szybki i dogodny sposób i wstrzykiwanie oddzielonych komórek pacjentom. [0027] W dodatku według niniejszego wynalazku skuteczne tworzenie się kości może być indukowane przez oddzielanie komórek jądrzastych ze szpiku kostnego pobieranego według niniejszego wynalazku i wstrzykiwanie oddzielonych komórek do miejsca tworzenia się kości. [0028] W rezultacie, według niniejszego wynalazku, niezawodność oddzielania komórek może być znacznie zwiększona tak, że zwiększana jest perspektywa odbiorców na lepiej oddzielone komórki. 2 3 Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób oddzielania pochodzących ze szpiku kostnego komórek jądrzastych do tworzenia kości, który obejmuje etapy: (a) przemywania szpiku kostnego obejmującego podetapy: (a1) przechowywania 2- ml szpiku kostnego pobranego od pacjenta w buforze do przemywania; (a2) wstrząsania szpiku kostnego z buforem do przemywania -0 razy, aż do skutecznego usunięcia zanieczyszczeń lub składników tłuszczowych ze szpiku kostnego, (a3) wirowania wstrząsanego buforu do przemywania przy 1600 rpm przez 4- minut; (a4) usuwania supernatantu, (a) przenoszenia pozostałego składnika szpiku kostnego do innego pojemnika do przemywania, (a6) wstrząsania pojemnika zawierającego szpik kostny -0 razy, (a7) wirowania wstrząsanego roztworu przy 1600 rpm przez 4- minut, i (a8) usuwania supernatantu z wirowanego roztworu; (b) lizy czerwonych krwinek szpiku kostnego obejmującej podetapy: (b1) dodania -krotnej ilości buforu do lizy do szpiku kostnego; i (b2) mieszania buforu do lizy ze szpikiem kostnym kilka razy przy wykorzystaniu strzykawki, i (b3) pozostawienia roztworu na - sekund; (c) neutralizowania lizatu szpiku kostnego obejmującego podetapy: (c1) mieszania roztworu szpiku kostnego z taką samą ilością buforu neutralizującego; (c2) wirowania tego roztworu przy 1600 rpm przez 4- minut, i (c3) usuwania supernatantu z wyjątkiem wytrąconych komórek jądrzastych do tworzenia kości;
(d) oczyszczania komórek jądrzastych z neutralizowanego szpiku kostnego obejmującego podetapy: (d1) mieszania 4- ml buforu podtrzymującego z komórkami jądrzastymi w pojemniku; i (d2) wirowania tego roztworu przy 1600 rpm przez 4- minut, i (d3) usuwania supernatantu; oraz (e) mieszania komórek jądrzastych z buforem podtrzymującym do tworzenia kości. 2. Sposób według zastrz. 1, przy czym etap (e) mieszania komórek jądrzastych z buforem podtrzymującym obejmuje podetapy: (e1) dodania 2-3 ml buforu podtrzymującego do komórek jądrzastych przez wzgląd na uszkodzenie, (e2) unoszenia komórek jądrzastych na dnie pojemnika z wykorzystaniem strzykawki; i (e3) umieszczenia komórek jądrzastych i buforu konserwującego w strzykawce do wstrzyknięcia do miejsca ubytku kostnego lub miejsca wymagającego tworzenia się kości. 6