(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/EP01/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 210198 (21) Numer zgłoszenia: 361401 (22) Data zgłoszenia: 12.09.2001 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 12.09.2001, PCT/EP01/010568 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: 21.03.2002, WO02/22167 (13) B1 (51) Int.Cl. A61K 39/09 (2006.01) A61P 31/04 (2006.01) A61K 39/385 (2006.01) (54) Immunogenna kompozycja, jej zastosowanie i sposób wytwarzania oraz zawierająca ją szczepionka przeciwko Streptococcus pneumoniae (30) Pierwszeństwo: 15.09.2000, GB, 0022742.1 (73) Uprawniony z patentu: SMITHKLINE BEECHAM BIOLOGICALS S.A., Rixensart, BE (43) Zgłoszenie ogłoszono: 04.10.2004 BUP 20/04 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 30.12.2011 WUP 12/11 (72) Twórca(y) wynalazku: CRAIG ANTONY JOSEPH LAFERRIERE, Rixensart, CA JAN POOLMAN, Rixensart, BE (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Magdalena Tagowska PL 210198 B1

2 PL 210 198 B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest immunogenna kompozycja, jej zastosowanie i sposób wytwarzania oraz zawierająca ją szczepionka przeciwko Streptococcus pneumoniae. W szczególności niniejszy wynalazek dotyczy szczepionek obejmujących pneumokokowy antygen polisacharydowy w kombinacji z antygenem białkowym ze Streptococcus pneumoniae i ewentualnie z adiuwantem indukującym Th1. Streptococcus pneumoniae jest Gram-dodatnią bakterią odpowiedzialną za znaczną zachorowalność i śmiertelność (zwłaszcza u osób bardzo młodych i w podeszłym wieku), wywołującą inwazyjne choroby jak zapalenie płuc, bakteriemia i zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych oraz choroby związane z kolonizacją, jak ostre zapalenie ucha środkowego. Wskaźnik pneumokokowego zapalenia płuc w USA dla osób powyżej 60 roku życia jest szacowany na 3 do 8 na 100 000. W 20% przypadków prowadzi to do bakteriemii i innych objawów, jak zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych ze śmiertelnością bliską 30% nawet przy leczeniu antybiotykami. Pneumokok posiada otoczkę z chemicznie połączonymi polisacharydami, które nadają swoistość serotypom. Znanych jest 90 serotypów pneumokokowych a otoczka jest główną determinantą zjadliwości, jako że otoczka nie tylko chroni wewnętrzną powierzchnię bakterii przed układem dopełniacza, ale jest sama słabo immunogenna. Polisacharydy są T-niezależnymi antygenami i nie mogą być przetwarzane i prezentowane na cząsteczkach MHC w celu oddziaływania z komórkami T. Mogą jednakże pobudzać układ odpornościowy przez alternatywny mechanizm, który dotyczy krzyżowego wiązania receptorów powierzchniowych na komórkach B. W kilku doświadczeniach wykazano, że ochrona przeciw inwazyjnej chorobie pneumokokowej jest najsilniej związana z przeciwciałami swoistymi wobec otoczki i że ochrona jest swoista wobec serotypów. Szczepionki uzyskane w oparciu o antygen polisacharydowy są dobrze znane w dziedzinie. Cztery, które były zarejestrowane do użytku u ludzi obejmują polisacharyd Vi z Salmonella typhi, polisacharyd PRP z Haemophilus influenzae, meningokokową szczepionkę tetrawalentną obejmująca serotypy A, C, W135 i Y oraz 23-walentną szczepionkę pneumokokową składającą się z polisacharydów odpowiadających serotypom 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F i 33 (składające się na co najmniej 90% pneumokokowych izolatów z krwi). Ostatnie trzy szczepionki nadają ochronę przeciw bakteriom wywołującym zakażenia układu oddechowego z poważną zachorowalnością i śmiertelnością u niemowląt, chociaż szczepionki te nie były zarejestrowane do stosowania u dzieci poniżej drugiego roku życia, ponieważ nie były wystarczająco immunogenne w tej grupie wiekowej [Peltola i wsp. (1984), N. Engl. J. Med. 310:1561-1566]. Streptococcus pneumoniae jest najczęstszą przyczyną inwazyjnej choroby bakteryjnej i zapalenia ucha środkowego u niemowląt i dzieci młodszych. Podobnie ludzie w podeszłym wieku słabo odpowiadają na szczepionki pneumokokowe [Roghmann i wsp., (1987), J. Gerontol. 42:265-270], stąd podwyższona liczba przypadków bakteryjnego zapalenia płuc w tej populacji [Verghese i Berk, (1983) Medicine (Baltimore) 62:271-285]. Strategie opracowane w celu wyeliminowania tego braku immunogenności u niemowląt obejmują wiązanie polisacharydu do większych immunogennych białek, które pomagają biernym komórkom T i indukują pamięć immunologiczną wobec antygenu polisacharydowego, z którym są skoniugowane. Glikoproteinowe koniugowane szczepionki pneumokokowe są obecnie oceniane pod względem bezpieczeństwa, immunogenności i skuteczności w różnych grupach wiekowych. 23-walentna nieskoniugowana szczepionka pneumokokowa wykazała dużą różnorodność w skuteczności klinicznej, od 0% do 81% [Fedson i wsp. (1994) Arch Intern Med. 154:2531-2535)]. Skuteczność wydawała się być związana z grupą ryzyka, która była immunizowana, taką jak osoby w podeszłym wieku, z chorobą Hodgkina, po splenektomii, z anemią sierpowatą i agammaglobulinemiami [Fine i wsp. (1994) Arch Intern Med. 154:2666-2677), a także z objawami choroby. Szczepionka 23-walentna nie wykazywała ochrony wobec pneumokokowego zapalenia płuc (w pewnych grupach wysokiego ryzyka takich jak osoby w podeszłym wieku) i zapalenia ucha środkowego. Dlatego istnieje potrzeba udoskonalenia kompozycji szczepionki pneumokokowej, zwłaszcza tej, która ma być bardziej skuteczna w ochronie i łagodzeniu objawów choroby pneumokokowej (zwłaszcza zapalenia płuc) u osób w podeszłym wieku i dzieci młodszych.

PL 210 198 B1 3 Niniejszy wynalazek dostarcza taką ulepszoną szczepionkę. Niniejszy wynalazek dostarcza kompozycji immunogennej, obejmującej co najmniej jeden polisacharydowy antygen Streptococcus pneumoniae (korzystnie skoniugowany z białkiem nośnikowym) i co najmniej jeden antygen białkowy Streptococcus pneumoniae wybrany z grupy składającej się z rodziny białek z triadą polihistydynową (Pht; np. PhtA, PhtB, PhtD czy PhtE) lub ich skróconych albo immunologicznie funkcjonalnych odpowiedników, ewentualnie z adiuwantem, korzystnie adiuwantem Th1 (tj. adiuwantem pobudzającym dominującą immunologiczną odpowiedź Th1). Korzystnie zawarte są oba białko pneumokokowe i adiuwant Th1. Opisano także korzystne kompozycje obejmujące kombinacje każdego z każdym wyżej wymienionych białek pneumokokowych według wynalazku z innymi białkami pneumokokowymi. W korzystnej postaci wykonania immunogenna kompozycja według wynalazku zawiera PhtD jako antygen białkowy Streptococcus pneumoniae. Również korzystnie immunogenna kompozycja według wynalazku ponadto zawiera Ply. Korzystniej antygen polisacharydowy w kompozycji według wynalazku jest prezentowany w postaci koniugatu polisacharyd-białko nośnikowe. Najkorzystniej białko nośnikowe jest wybrane z grupy składającej się z: toksoidu błoniczego, toksoidu tężcowego, CRM197, hemocyjaniny skałoczepu (KLH), białkowej pochodnej tuberkuliny (PPD) oraz białka D z H. influenzae. W innej korzystnej postaci wykonania immunogenna kompozycja według wynalazku obejmuje co najmniej cztery pneumokokowe antygeny polisacharydowe z różnych serotypów. Adiuwant stosowany korzystnie w kompozycji według wynalazku obejmuje sól glinu. W przypadku gdy adiuwant jest preferencyjnym induktorem odpowiedzi TH1, korzystnie obejmuje on co najmniej jeden z następujących: 3D-MPL, saponiny będącej czynnikiem pobudzającym układ immunologiczny lub immunostymulującego oligonukleotydu CpG. Również korzystnie adiuwant obejmuje nośnik wybrany z grupy zawierającej: emulsję olej w wodzie, liposomy oraz sól glinu. Przedmiotem wynalazku jest ponadto zastosowanie immunogennej kompozycji według wynalazku jako leku oraz szczepionka ją obejmująca. Kompozycje według wynalazku są szczególnie przydatne w leczeniu zapalenia płuc u osób w podeszłym wieku i u małych dzieci. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zatem zastosowanie pneumokokowego antygenu polisacharydowego w kombinacji z białkowym antygenem Streptococcus pneumoniae wybranym z grupy składającej się z PhtA, PhtD, PhtB i PhtE, oraz ewentualnie adiuwantem indukującym TH1 do wytwarzania leku do zapobiegania lub leczenia zapalenia płuc u pacjentów powyżej 55 roku życia lub zapalenia ucha środkowego u niemowląt i dzieci młodszych. Wynalazek dotyczy także sposobu wytwarzania immunogennej kompozycji według wynalazku etapy, który obejmuje etapy: wybierania jednego lub większej liczby pneumokokowych antygenów polisacharydowych; wybierania jednego lub większej liczby antygenów białkowych z grupy składającej się z: PhtA, PhtD, PhtB i PhtE, oraz mieszania tych antygenów polisacharydowych i białkowych z odpowiednią zaróbką. Polisacharydowe szczepionki pneumokokowe (skoniugowane lub nie) mogą nie być zdolne do ochrony przed zapaleniem płuc w starszej populacji, gdzie częstość występowania choroby jest bardzo wysoka. Kluczem mechanizmu obronnego przeciw pneumokokowi jest opsonofagocytoza (odpowiedź humoralna zależna od komórek B/neutrofili, wywoływana przez wytwarzanie przeciwciał wobec pneumokokowego polisacharydu, przy czym bakteria ostatecznie ulega fagocytozie), chociaż u osób w podeszłym wieku część mechanizmów zaangażowanych w opsonizację jest osłabiona, przykładowo przez wytwarzanie nadtlenku przez PMN (krwinki białe obojętnochłonne, ang. polymorphonuclear cells), wytwarzanie innych rodzajów reaktywnych tlenków, mobilizację PMN, apoptozę PMN, zniekształcanie PMN. U osób w podeszłym wieku może być również osłabiona odpowiedź związana z przeciwciałami. Przeciwnie do normalnie przyjmowanego dogmatu, prawidłowy poziom przeciwciał przeciw otoczkowym polisacharydom może nie być skuteczny w całkowitym usuwaniu bakterii, jako że pneumokoki mogą dokonywać inwazji komórek gospodarza unikając tej części systemu immunologicznego. Zaskakująco, twórcy niniejszego wynalazku wykazali, że jednoczesna stymulacja części układu immunologicznego zależnego od komórek (na przykład odporność zależna od komórek T) wraz z humoralną częścią układu immunologicznego (zależną od komórek B), synergizm (bądź współpraca) może przynieść efekt w postaci wzmocnienia oczyszczania gospodarza z pneumokoków. Jest to

4 PL 210 198 B1 ujawnienie, które ogólnie wspomoże zapobieganie (lub leczenie) zakażeń pneumokokowych, ale w szczególności będzie ważne w zapobieganiu (lub leczeniu) zapalenia płuc u osób w podeszłym wieku, u których szczepionki polisacharydowe nie wykazują skuteczności. Bez zamiaru wiązania z jakąkolwiek teorią twórcy niniejszego wynalazku wykazali, że oba ramiona układu immunologicznego mogą współpracować jeśli pneumokokowy polisacharyd (korzystnie skoniugowany z białkiem nośnikowym) jest podawany z pneumokokowym białkiem wybranym z grupy obejmującej: PhtA, PhtD, PhtB i PhtE (białka, które mogą być przetwarzane i prezentowane w kontekście klasy II i MHC klasy I na powierzchni zakażonych komórek ssaków). Chociaż jedno lub więcej z tych białek pneumokokowych może samo uwolnić komórkowo-zależną odporność, twórcy wynalazku wykazali również, że obecność adiuwanta indukującego Th1 w kompozycji szczepionki pomaga tej części układu immunologicznego i zaskakująco zwiększa synergizm pomiędzy dwiema częściami układu odpornościowego. Szczegółowy opis wynalazku Niniejszy wynalazek dostarcza ulepszoną szczepionkę w szczególności do zapobiegania i łagodzenia objawów zakażeń pneumokokowych u osób w podeszłym wieku i/lub niemowląt i dzieci młodszych. W kontekście wynalazku pacjent jest traktowany jako osoba w podeszłym wieku, jeśli ukończył co najmniej 55 rok życia, typowo jest osobą powyżej 60 roku życia i bardziej ogólnie powyżej 65 rok życia. Tak więc w jednym z wykonań według wynalazku dostarczana jest kompozycja szczepionki odpowiednia do stosowania u osób w podeszłym wieku i/lub niemowląt i dzieci młodszych, obejmująca co najmniej jeden z antygenów polisacharydowych Streptococcus pneumoniae i co najmniej jeden antygen (antygeny) białkowe Streptococcus pneumoniae, wybrane z grupy składającej się z: PhtA, PhtD, PhtB i PhtE. Szczepionka może ewentualnie zawierać adiuwant Th1. W drugim, korzystnym wykonaniu, niniejszy wynalazek dostarcza szczepionkę (odpowiednią w zapobieganiu zapaleniu płuc u osób w podeszłym wieku) obejmującą co najmniej jeden (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 lub 10) antygen (antygeny) polisacharydowy Streptococcus pneumoniae i co najmniej jeden antygen białkowy Streptococcus pneumoniae wybrany z grupy składającej się z: PhtA, PhtD, PhtB i PhtE oraz korzystnie adiuwant Th1. W powyższych wykonaniach przedstawione są szczepionki korzystnie obejmujące kombinacje wyżej wymienionych białek pneumokokowych według wynalazku, każde z każdym, oraz z innymi białkami pneumokokowymi są również zobrazowane w opisie poniżej. Pokazano, że taka szczepionka będzie również użyteczna w leczeniu zakażenia pneumokokowego (na przykład zapalenia ucha środkowego) w innych grupach wysokiego ryzyka w populacji, jak niemowlęta czy dzieci młodsze. Antygeny polisacharydowe Streptococcus pneumoniae Typowo szczepionka przeciw Streptococcus pneumoniae według wynalazku będzie obejmować antygeny polisacharydowe (korzystnie skoniugowane z białkiem nośnikowym), przy czym polisacharydy pochodzą od co najmniej czterech serotypów pneumokokowych. Korzystnie cztery serotypy obejmują 6B, 14, 19F i 23F. Bardziej korzystnie kompozycja zawiera co najmniej 7 serotypów, przykładowo te otrzymane z serotypów 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F i 23F. Jeszcze bardziej korzystnie kompozycja zawiera co najmniej 11 serotypów, przykładowo kompozycja w jednym z wykonań zawiera polisacharydy otoczkowe pochodzące od serotypów: 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F i 23F (korzystnie skoniugowane z białkiem nośnikowym). W korzystnym wykonaniu według wynalazku zawartych jest co najmniej 13 antygenów polisacharydowych (korzystnie skoniugowanych z białkiem nośnikowym), chociaż dalsze antygeny polisacharydowe, przykładowo 23 walentne (takie jak serotypy 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F i 33F) są również rozważane według wynalazku. W przypadku szczepienia osób w podeszłym wieku (na przykład w celu zapobiegania zapaleniu płuc) korzystne jest zawarcie serotypów 8 i 12F (i bardziej korzystne równocześnie serotypów 15 i 22) w 11-walentnej kompozycji antygenowej, opisanej powyżej, z wytworzeniem 15-walentnej szczepionki, podczas gdy dla niemowląt i dzieci młodszych (których najbardziej dotyczy zapalenie ucha środkowego) serotypy 6A i 19A są korzystnie zawarte w uzyskiwanej szczepionce 13-walentnej. Chociaż powyższe polisacharydy mogą być używane w ich natywnej formie o pełnej długości, należy rozumieć, że polisacharydy o zmniejszonym rozmiarze, które są wciąż immunogenne, mogą być również wykorzystywane (zobacz na przykład EP 497524 i 497525).

PL 210 198 B1 5 Do zapobiegania/łagodzenia objawów zapalenia płuc u osób w podeszłym wieku (+55 lat) oraz zapalenia ucha środkowego u niemowląt (do 18 miesiąca życia) i dzieci młodszych (typowo od 18 miesiąca życia do 5 roku życia) korzystnym wykonaniem według wynalazku jest połączenie licznych składników polisacharydowych Streptococcus pneumoniae opisanych tutaj, z białkiem Streptococcus pneumoniae wybranym z grupy obejmującej: PhtA, PhtD, PhtB i PhtE lub ich immunologicznie funkcjonalnym odpowiednikiem. Kombinacja białek pneumokokowych może być również być korzystnie wykorzystana jak to opisano poniżej. Pneumokokowe białka według wynalazku Dla celów niniejszego wynalazku immunologicznie funkcjonalny odpowiednik" jest definiowany jako peptyd obejmujący co najmniej jeden epitop ochronny z białka opisanego powyżej. Epitopy te są charakterystycznie prezentowane na powierzchni, wysoce konserwowane i mogą wywoływać u gospodarza bakteriobójczą odpowiedź związaną z przeciwciałami lub chronić go przed toksycznymi działaniami. Korzystnie, funkcjonalny odpowiednik ma co najmniej 15, a bardziej korzystnie 30 lub większą liczbę stycznych aminokwasów z białka według wynalazku. Najkorzystniej, fragmenty, delecje białka takie jak jego warianty z delecjami transbłonowymi (tzn. użycie zewnątrzbłonowych domen białek), fuzje, chemicznie lub genetycznie odtoksycznione pochodne i tym podobne mogą być wykorzystane pod warunkiem, że są zdolne do wzbudzenia zasadniczo takiej samej odpowiedzi immunologicznej jak białko natywne. Pozycję potencjalnych epitopów komórek B w sekwencji białka można z łatwością ustalić poprzez identyfikację peptydów, które są jednocześnie prezentowane na powierzchni i antygenowe, wykorzystując kombinację dwóch metod: przewidywanie struktury 2D i przewidywanie wykładnika antygenowego. Przewidywanie struktury 2D można wykonać przy użyciu programu PSIPRED (od David Jones, Brunei Bioinformatics Group, Dept. Biological Sciences, Brunel University, Uxbridge UB8 3PH, Wielka Brytania). Wykładnik antygenowy można obliczyć w oparciu o metodę Jameson i Wolf (CABIOS 4:181-186 [1988]). Białka w rozwiązaniach według wynalazku są następującymi białkami, z których wszystkie są prezentowane na zewnętrznej powierzchni pneumokoka (mogą być rozpoznawane przez układ odpornościowy gospodarza podczas co najmniej części cyklu życia pneumokoka) lub są białkami wydzielanymi lub uwalnianymi przez pneumokoka. Białko Streptococcus pneumoniae jest korzystnie wybierane z grupy obejmującej: białko z rodziny z triadą polihistydynową (Pht), białko z rodziny Lyt, białko wiążące cholinę, białka posiadające motyw LPXTG (gdzie X jest dowolnym aminokwasem), białka posiadające motyw sekwencji sygnałowej typu II LXXC (gdzie X jest dowolnym aminokwasem) oraz białka posiadające motyw sekwencji sygnałowej typu I. Korzystnymi przykładami w tych kategoriach (lub motywach) są następujące białka (lub ich skrócone lub immunologicznie funkcjonalne odpowiedniki): Rodzina Pht (z triadą polihistydynową) obejmuje białka PhtA, PhtB, PhtD i PhtE. Rodzinę charakteryzuje sekwencja przyłączania lipidów, dwie domeny rozdzielone obszarem bogatym w prolinę i kilka histydynowych triad, zaangażowanych prawdopodobnie w wiązanie metalu lub nukleozydów, lub w aktywność enzymatyczną (3-5) obszary typu coiled-coil (superskręcone), konserwowany koniec N i heterologiczny koniec C. Jest obecna we wszystkich szczepach badanych pneumokoków. Homologiczne białka znaleziono także u innych paciorkowców i Neiseria. Korzystni przedstawiciele rodziny obejmują PhtA, PhtB i PhtD. Bardziej korzystnie obejmują PhtA lub PhtD. Jest zrozumiałe, jednak, że określenia Pht A, B, D i E dotyczą białek posiadających sekwencje ujawnione w pracach cytowanych poniżej jak również ich naturalnie występujących (i wytworzonych przez człowieka) wariantów, które posiadają sekwencję homologiczną w co najmniej 90% identyczną z białkami odniesienia. Korzystnie jest ona w 95% identyczna i bardziej korzystnie w 97% identyczna. Odnośnie białek Pht, PhtA jest ujawnione w WO 98/18930 i określane także jako Sp36. Jak zauważono powyżej, jest to białko z rodziny białek z triadą polihistydynową i posiada motyw sekwencji sygnałowej typu II LXXC. PhtD jest ujawnione w WO 00/37105 i określane także jako Sp036D. Jak zauważono powyżej, jest to także białko z rodziny białek z triadą polihistydynową i posiada motyw sekwencji sygnałowej typu II LXXC. PhtB jest ujawnione w WO 00/37105 i określane także jako Sp036B. Innym członkiem rodziny PhtB jest Polipeptyd Degradujący C3 ujawniony w WO 00/17370. Białko to także pochodzi z rodziny białek z triadą polihistydynową i posiada motyw sekwencji sygnałowej typu II LXXC. Korzystnym immunologicznie funkcjonalnym odpowiednikiem jest białko Sp42 ujawnione w WO 98/18930. Ucięte Ph około 79 kd) jest ujawnione w WO 99/15675 i jest ono także uważane za przedstawiciela rodziny PhtX.

6 PL 210 198 B1 PthE jest ujawnione w WO 00/30299 i jest określane jako BVH-3. Białka stosowane w niniejszym wynalazku są korzystnie wybrane z grupy PhtD i PthA lub z kombinacji obu tych białek Korzystne kombinacie jednego lub większej liczby białek z innymi białkami pneumokokowymi W szczepionce według wynalazku każde z powyższych białek (korzystnie zarówno PhtD jak i PthA) można także korzystnie łączyć z jednym lub większą liczbą białek pneumokokowych z następującej listy: pneumolizyna (także określana jako Ply; korzystnie odtoksyczniona przez traktowanie chemicznie lub przez mutację) [WO 96/05859, WO 90/06951, WO 99/03884], PsaA i jego warianty z delecjami transbłonowymi (Berry i Paton, Infect Immun 1996, Grudz.; 64(12):5255-62), PspA i jego warianty z delecjami transbłonowymi (patent USA 5804193, WO 92/14488, WO 99/53940) PspC i jego warianty z delecjami transbłonowymi (WO 97/09994, WO 99/53940), przedstawiciel rodziny białka wiążącego cholinę (Cbp) [np. CbpA i jego warianty z delecjami transbłonowymi (W097/41151; WO 99/51266)], dehydrogenaza gliceraldehydu-3-fosforanowego (Infect. Immun. 1996, 64:3544), HSP70 (WO 96/4092) PcpA (sanchez-beato i wsp. FEMS Microbiol Lett 1998, 164:207-14) białko typu M (zgłoszenie patentowe SB nr EP 0837130) oraz adhezyna 18627 (zgłoszenie patentowe SB nr EP 0834568). Niniejszy wynalazek obejmuje także immunologicznie funkcjonalne odpowiedniki lub skrócone formy takich białek (jak określono powyżej). Przedstawiciele rodziny białka wiążącego cholinę zostali pierwotnie zidentyfikowani jako białka pneumokokowe, które można oczyszczać przez chromatografię powinowactwa do choliny. Wszystkie białka wiążące cholinę są niekowalencyjnie związane z ugrupowaniami fosforylocholiny kwasu tejchowego ze ściany komórkowej oraz z kwasem lipotejchowym związanym z błonami. Strukturalnie posiadają one kilka wspólnych obszarów w całej rodzinie, chociaż właściwa natura białek (sekwencja aminokwasowa, długość itp.) może być różna. Zasadniczo, białka wiążące cholinę obejmują obszar na końcu N (N), obszary konserwowanych powtórzeń (R1 i/lub R2), obszar bogaty w prolinę (P) oraz konserwowany region wiążący cholinę (C) zbudowany z wielu powtórzeń, które obejmują średnio połowę białka. Stosowana w tym zgłoszeniu rodzina białka wiążącego cholinę (Cbp)" jest wybrana z grupy składającej się z białek wiążących cholinę jak określono w WO 97/41151, PbcA, SpsA, PspC, CbpA, CbpD i CbpG. CbpA jest ujawnione w WO 97/41151. CbpD i CbpG są ujawnione w WO 00/29434. PspC jest ujawnione w WO 97/09994. PbcA jest ujawnione w WO 98/21337. Korzystnie białka wiążące cholinę są wybrane z grupy składającej się z CbpA, PbcA, SpsA i PspC. Jeśli Cbp jest dodatkowym wykorzystywanym białkiem może ono być skróconym Cbp, przy czym Cbp" jest określone powyżej a skrócone" odnosi się do białek, które straciły 50% lub więcej obszaru wiążącego cholinę (C). Korzystnie białka takie tracą cały obszar wiążący cholinę. Bardziej korzystnie takie skrócone białka straciły (i) obszar wiążący cholinę i (ii) także fragment połowy N terminalnej białka, przy czym pozostał co najmniej jeden powtórzony obszar (R1 lub R2). Jeszcze bardziej korzystnie skrócone białko posiada 2 obszary (R1 i R2). Przykładami takich korzystnych wykonań są NR1xR2 i R1xR2 jak zilustrowano w WO 99/51266 lub WO 99/51188, chociaż, inne białka wiążące cholinę, które straciły podobny obszar wiążący cholinę są także rozpatrywane w zakresie niniejszego wynalazku. Białka chimerowe skrócone Cbp - skrócone Lyt (lub fuzje) mogą także być użyte w szczepionce według wynalazku. Korzystnie obejmują one NR1xR2 (lub R1xR2) z Cbp i fragment końca C (Cterm, tzn., który stracił domeny wiążące cholinę) z Lyt (np. LytCterm lub Sp91Cterm). Bardziej korzystnie Cbp jest wybrany z grupy złożonej z CbpA, PbcA, SpsA i PspC. Jeszcze bardziej korzystnie jest CbpA. Korzystnie Lyt jest LytC (określany również jako Sp91). Także można użyć skrócone białka PspA lub PsaA, które straciły domenę wiążącą cholinę (C) i są wyrażane w fuzji z Lyt. Korzystnie Lyt jest LytC. Korzystne kombinacie białek pneumokokowych dla celów niniejszego wynalazku Korzystne połączenia białek według wynalazku są wybrane z 2 lub większej liczby (3 lub 4) różnych kategorii takich jak białka posiadające motyw sekwencji sygnałowej typu II LXXC (gdzie X jest dowolnym aminokwasem, np. rodzina z triadą histydynową (Pht)), białka wiążące cholinę (Cbp), białka posiadające motyw sekwencji sygnałowej typu I (np. Sp101), białka posiadające motyw LPXTG (gdzie X jest dowolnym aminokwasem, np. Sp128, Sp130), toksyny (np. Ply) itd. Korzystnymi przykładami w tych kategoriach (lub motywach) są białka wspomniane powyżej lub ich immunologicznie funkcjonalne odpowiedniki. Korzystnymi połączeniami kategorii są toksyna + Pht, toksyna + Cbp, Plit + Cbp i toksyna + Pht + Cbp.

PL 210 198 B1 7 Korzystnie pożyteczne połączenia zawierają ale nie wyłącznie PhtD + NR1xR2, PhtD + NR1xR2- -Sp91Cterm białka chimerowe lub fuzyjne, PhtD + Ply, PhtD + Sp128, PhtD + PsaA, PhtD + PspA, PhtA + NR1xR2, PhtA + NR1xR2-Sp91 Cterm białka chimerowe lub fuzje, PhtA + Ply, PhtA + Sp128, PhtA + PsaA, PhtA + PspA, NR1xR2 + LytC, NR1xR2 + PspA, NR1xR2 + PsaA, NR1xR2 + Sp128, R1xR2 + LytC, R1xR2 + PspA, R1xR2 + PsaA, R1xR2 + Sp128, R1xR2 + PhtD, R1xR2 + PhtA. Korzystnie NR1xR2 (lub R1xR2) jest z CbpA lub PspC. Bardziej korzystnie jeśli jest z CbpA. Szczególnie korzystne połączenie białek pneumokokowych obejmuje Ply (lub jego skrócony czy immunologicznie funkcjonalny odpowiednik) + PhtD (lub jego skrócony czy też immunologicznie funkcjonalny odpowiednik) + NR1xR2 (lub R1xR2). Korzystnie NR1xR2 (lub R1xR2) jest z CbpA lub PspC. Bardziej korzystnie jest z CbpA. Bez zamiaru wiązania z jakąkolwiek teorią białko pneumokokowe (lub połączenia opisane powyżej) w kompozycji według wynalazku może pomóc indukować odpowiedź zależną od komórek T wobec choroby pneumokokowej - wymaganą zwłaszcza w ochronie przeciw zapaleniu płuc - współdziałającą z humoralną częścią układu odpornościowego w zapobieganiu inwazji pneumokoków i stymulowaniu procesu opsonofagocytozy. Dalszą korzyścią włączenia antygenu białkowego jest prezentacja dalszych antygenów wobec procesu opsonofagocytozy. Zatem w wykonaniu według wynalazku dostarczana jest szczepionka przeciw Streptococcus pneumoniae obejmująca pneumokokową skoniugowaną szczepionkę polisacharydową obejmującą antygeny polisacharydowe pochodzące co najmniej od czterech serotypów, korzystniej co najmniej 7 serotypów, bardziej korzystnie 11 serotypów i co najmniej z jednym, ale korzystnie z 2, 3 lub 4 białkami Streptococcus pneumoniae wybranymi z grupy obejmującej PhtA, PhtD, PhtB i PhtE (lub połączeń pneumokokowych białek jak opisano powyżej). Korzystnie jednym z białek jest PhtA (lub jego immunologicznie funkcjonalny odpowiednik). Bardziej korzystnie jedno z białek stanowi PhtD (lub jego immunologicznie funkcjonalny odpowiednik). Jak wspomniano powyżej, problemem związanym z polisacharydowym podejściem do szczepionki jest fakt, że polisacharydy per se są słabymi immunogenami. Aby ominąć ten problem, polisacharydy mogą być skoniugowane z białkami nośnikowymi, które pomagają biernym komórkom T. Korzystne jest zatem, aby polisacharydy wykorzystywane według wynalazku były połączone z takimi białkami nośnikowymi. Przykłady takich nośników stosowanych obecnie powszechnie do wytwarzania immunogenów polisacharydowych obejmują toksoid błoniczy i tężcowy (odpowiednio DT, DT CRJVI197 i TT) hemocjaninę skałoczepu (KLH), OMPC z N. meningitidis oraz oczyszczona białkowa pochodna tuberkuliny (PPD). Korzystnym nośnikiem dla kompozycji immunogennych (lub szczepionek) opartych na pneumokokowym polisacharydzie jest białko D z Haemophilus influenzae (EP 594610-B) lub jego fragmenty. Fragmenty odpowiednie do zastosowania obejmują epitopy komórek T pomocniczych. W szczególności fragment białka D korzystnie będzie zawierał 1/3 końca N z białka. Nośnik z białka D jest zaskakująco przydatny jako nośnik w szczepionkach, w których skoniugowanych jest wiele polisacharydowych antygenów pneumokokowych. Zazwyczaj może wystąpić supresja epitopu jeśli ten sam nośnik jest stosowany dla każdego polisacharydu. Zaskakująco, twórcy niniejszego wynalazku ujawnili, że białko D jest szczególnie stosowne do zminimalizowania skutków takiej supresji epitopu w szczepionkach kombinowanych. Jeden lub większą liczbę połączonych pneumokokowych polisacharydów można korzystnie skoniugować z białkiem D, a korzystnie wszystkie antygeny są skoniugowane z białkiem D w takiej kombinowanej szczepionce. Dalszym korzystnym nośnikiem dla polisacharydu pneumokokowego jest samo białko pneumokokowe (jak określono powyżej w rozdziale Pneumokokowe białka według wynalazku"). Polisacharydy można łączyć z białkiem nośnikowym znaną metodą (przykładowo, podaną przez Likhite, w opisie patentowym USA nr 4372945 i Armor i wsp., w patencie USA 4474757). Korzystnie, przeprowadzana jest CDAP (WO 95/08348). Korzystnie stosunek (wagowo:wagowy) białko:polisacharyd w koniugantach wynosi 0,3:1 do 1:1, bardziej korzystnie 0,6:1 do 0,8:1 i najkorzystniej 0,7:1. Szczepionki według wynalazku korzystnie zawierają adiuwanty. Stosowne adiuwanty obejmują sole glinu, takie jak żel wodorotlenku glinu (alum) lub fosforan glinu, lecz także sole wapnia, magnezu, żelaza lub cynku lub mogą być nierozpuszczalnymi zawiesinami acetylowanej tyrozyny lub acetylowanych cukrów, kationowo i anionowo derywatyzowane polisacharydy lub polifosfazeny.

8 PL 210 198 B1 Korzystnie adiuwant jest wybrany jako uprzywilejowany induktor odpowiedzi typu Th1 w celu wzmocnienia części odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem komórek. Adiuwanty Th1 według wynalazku Wysokie poziomy cytokin typu Th1 przyczyniają się do indukcji komórkowej odpowiedzi immunologicznej na dany antygen, podczas gdy wysokie poziomy cytokin typu Th2 przyczyniają się do indukcji humoralnej odpowiedzi immunologicznej na dany antygen. Ważne jest, aby pamiętać, że rozróżnienie odpowiedzi immunologicznej Th1 i Th2 nie jest całkowite. W rzeczywistości osobnik będzie utrzymywał odpowiedź immunologiczną, która jest opisana jako głównie Th1 lub głównie Th2. Chociaż, często wygodnie jest rozpatrywać rodziny cytokin w znaczeniu opisanym dla mysich klonów komórek T CD4 +ve przez Mosmann i Coffman (Mosmann, T.R. i Coffman, R.L. (1989) Th1 and Th2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Reyieyw of Immunology, 7, str. 145-173). Tradycyjnie, odpowiedzi typu Th1 są związane z wytwarzaniem przez limfocyty T INF-γ i cytokin IL-2. Inne cytokiny, takie jak IL-12, często bezpośrednio związane z indukcją odpowiedzi immunologicznych typu Th1 nie są wytwarzane przez komórki T. Dla kontrastu odpowiedzi typu Th2 są związane z wydzielaniem IL-4, IL-5, IL-6, IL-10. Stosowne systemy adiuwanta, które pobudzają głównie odpowiedź Th1 obejmują: monofosforylolipid A lub jego pochodną w szczególności 3-de-O-acylowany monofosforylolipid A (3D-MPL) (opis jego wytwarzania przedstawiono w GB 222021 A) oraz kombinację monofosforylolipidu A, w szczególności 3-de-O-acylowanego monofosforylolipidu A, z solą glinu (przykładowo fosforanu glinu lub wodorotlenku glinu) lub emulsją olej w wodzie. W takich kombinacjach, antygen i 3D-MPL znajdują się w tych samych określonych strukturach, co pozwala na skuteczniejsze dostarczanie sygnałów antygenowych i immunostymulujących. Badania pokazały, że 3D-MPL są zdolne dodatkowo do wzmacniania immunogenności antygenu zaadsorbowanego na alumie [Thoelen i wsp. Vaccine (1998) 16:708-14; EP 689454-B1]. System wzmacniający wymaga kombinacji lipidu monofosforylowego A i pochodnej saponinowej, w szczególności kombinacji QS21 i 3D-MPL jak ujawniono w WO 94/00153 lub kompozycji mniej reaktywnej gdzie QS21 jest wyciszany cholesterolem, jak ujawniono w WO 96/33739. Szczególnie silny preparat adiuwanta wymagający QS21, 3D-MPL i tokoferolu w emulsji woda w oleju opisano w WO 95/17210 i jest on korzystnym preparatem. Korzystnie szczepionka dodatkowo obejmuje saponinę, bardziej korzystnie QS21. Preparat może także obejmować emulsję olej w wodzie i tokoferol (WO 95/17210). Niniejszy wynalazek dostarcza także sposobu wytwarzania preparatów szczepionki obejmujący mieszanie białka według niniejszego wynalazku z farmaceutycznie dopuszczoną zaróbką taką jak 3D-MPL. Korzystnymi induktorami odpowiedzi Th1 są także oligonukleotydy zawierające niemetylowane CpG (WO 96/02555) i są one odpowiednie do zastosowania według niniejszego wynalazku. Szczególnie korzystne kompozycje według wynalazku obejmują jeden lub większą liczbę skoniugowanych polisacharydów pneumokokowych, jedno lub większą liczbę białek pneumokokowych oraz adiuwanta Th1. Bez zamiaru wiązania z jakąkolwiek teorią indukcja odpowiedzi komórkowej poprzez białko pneumokokowe (jak opisano powyżej) oraz współdziałanie pomiędzy dwoma ramionami układu immunologicznego mogą być wspomagane przez zastosowanie adiuwanta Th1, w wyniku czego uzyskiwana jest szczególnie skuteczna szczepionka ogólnie przeciw pneumokokowej chorobie, a w szczególności przeciw pneumokokowemu zapaleniu płuc u osób w podeszłym wieku. W dalszym aspekcie według niniejszego wynalazku dostarczany jest immunogen lub szczepionka jak tu opisano do zastosowania w medycynie. Niniejszym opisano sposób zapobiegania lub łagodzenia objawów zapalenia płuc u starszych ludzi (+55 lat) obejmujący podawanie bezpiecznej i skutecznej ilości szczepionki, jak tu opisano, obejmującej antygen polisacharydowy Streptococcus pneumoniae i białko pneumokokowe wybrane z grupy obejmującej: PhtA, PhtD, PhtB i PhtE i ewentualnie adiuwanta Th1, dla omawianych starszych pacjentów. Niniejszym opisano również sposób zapobiegania lub łagodzenia objawów zapalenia ucha środkowego u niemowląt (do 18 miesiąca) lub dzieci młodszych (typowo 18 miesięcy do 5 roku życia) obejmujący podawanie bezpiecznej i skutecznej ilości szczepionki obejmującej antygen polisacharydowy Streptococcus pneumoniae i antygen białkowy Streptococcus pneumoniae wybrany z grupy obejmującej: PhtA, PhtD, PhtB i PhtE, oraz ewentualnie adiuwanta Th1, dla omawianych niemowląt lub dzieci młodszych.

PL 210 198 B1 9 Korzystnie w sposobach tych, jak opisano powyżej, antygen polisacharydowy jest obecny jako koniugat polisacharydu z białkiem. Preparaty szczepionki według wynalazku Preparaty szczepionki według niniejszego wynalazku mogą być wykorzystane do ochrony lub leczenia ssaków wrażliwych na zakażenie, za pomocą zastosowania wyżej wymienionej szczepionki drogą systemową lub śluzówkową. Zastosowania te mogą obejmować iniekcje drogą domięśniową, dootrzewnową śródskórną lub podskórną; lub podawanie na śluzówki jamy ustnej/przewodu pokarmowego oraz układu oddechowego i moczowo-płciowego. Donosowe podawanie szczepionek w leczeniu zapalenia płuc lub zapaleniu ucha środkowego jest bardziej korzystne (jako że zapobieganie nosogardłowemu nosicielstwu pneumokoków może być bardziej efektywne, osłabiając w ten sposób zakażenie na jego najwcześniejszym etapie). Chociaż szczepionka według wynalazku może być podawana w pojedynczej dawce, jej składniki mogą również być podawane jednocześnie w tym samym czasie lub w różnym czasie (na przykład polisacharydy pneumokokowe mogą być podawane osobno w tym samym czasie lub 1-2 tygodnie po podaniu białka bakteryjnego, będącego składnikiem szczepionki dla optymalnej koordynacji odpowiedzi immunologicznych, odnoszących się do każdej z nich). Przy jednoczesnym podawaniu może być obecny dowolny adiuwant Th1 w jakimkolwiek lub we wszystkich różnych podawaniach, jednakże jest korzystnie jeśli jest obecny w kombinacji z bakteryjną komponentą białkową szczepionki. Dodatkowo do pojedynczej drogi podania, mogą być wykorzystywane 2 różne drogi podania. Na przykład, każdy z wirusowych antygenów może być podawany ID (śródskórnie), podczas gdy białka bakteryjne mogą być podawane IM (domięśniowo) lub IN (donosowo). Polisacharydy mogą być podawane IM (lub ID) i białka bakteryjne mogą być podawane IN (lub ID). Dodatkowo, szczepionki według wynalazku mogą być podawane IM w pierwszych dawkach i IN w dawkach przypominających. Ilość koniugowanego antygenu w każdej dawce szczepionki jest wybierana na podstawie ilości indukującej odpowiedź immuno-ochronną bez znaczących objawów niepożądanych w typowych szczepionkach. Taka ilość jest różna zależnie od swoistego immunogenu, który jest stosowany i od sposobu w jaki jest on prezentowany. Ogólnie oczekuje się, że każda dawka będzie zawierać 0,1-100 μg polisacharydu, korzystnie 0,1-50 μg, korzystniej 0,1-10 μg, z czego 1-5 μg jest najbardziej korzystnym zakresem. Zawartość antygenów białkowych w szczepionce będzie typowo w zakresie 1-100 μg, korzystnie 5-50 μg, najbardziej typowo 5-25 μg. Optymalna ilość składników dla danej szczepionki może być sprawdzona w standardowych badaniach związanych z obserwacjami odpowiednich odpowiedzi immunologicznych u badanych osobników. Po początkowym szczepieniu osobniki mogą otrzymać jedną lub kilka przypominających immunizacji, odpowiednio rozłożonych w czasie. Preparat szczepionki jest ogólnie opisany w Vaccine Design ( The subunit and adjuvant approach" (wyd. Powell M.F. & Newmann M.J.) (1995) Plenum Press New York). Hermetyzacja wewnątrz liposomów jest opisana przez Fullertona, patent USA 4235877. Chociaż szczepionki według niniejszego wynalazku mogą być podawane każdą drogą, śródskórne (ID) podawanie opisanych szczepionek stanowi jedno z wykonań według niniejszego wynalazku. Skóra ludzka obejmuje zewnętrzny rogowy naskórek, nazywany warstwą rogową naskórka, która przykrywa naskórek. Pod tym naskórkiem jest warstwa nazywana skórą właściwą, która przykrywa z kolei tkanki podskórne. Naukowcy wykazali, że taka śródskórna iniekcja szczepionki, zwłaszcza w warstwę skóry właściwej, pobudza odpowiedź immunologiczną, która również może być związana z licznymi dodatkowymi korzyściami. Szczepienie śródskórne opisanymi tutaj szczepionkami stanowi korzystną cechę dla rozwiązań według niniejszego wynalazku. Konwencjonalna technika iniekcji śródskórnej, procedura mantoux", obejmuje etapy czyszczenia skóry, następnie naciągania jej jedną ręką i umieszczania końca wąskiej igły (rozmiar 26-31) zwróconej do góry pod kątem 10-15. Kiedy skos igły zostaje umieszczony, światło igły jest opuszczane i dalej wysuwane naprzód podczas, gdy dostarczany lekki nacisk podnosi ją ponad skórę. Płyn jest następnie wstrzykiwany bardzo powoli i w ten sposób tworzy pęcherzyk lub wypukłość na powierzchni skóry, następnie powoli wycofuje się igłę. Ostatnio zostały opisane przyrządy, które są zaprojektowane specyficznie do podawania środków płynnych do lub przez skórę, na przykład przyrządy opisane w WO 99/34850 i EP 1092444, również przyrządy wstrzykujące opisane na przykład w WO 01/13977; patent USA 5480381, patent USA

10 PL 210 198 B1 5599302, patent USA 5334144, patent USA 5993412, patent USA 5649912, patent USA 5569189, patent USA 5704911, patent USA 5383851, patent USA 5893397, patent USA 5466220, patent USA 5339163, patent USA 5312335, patent USA 5503627, patent USA 5064413, patent USA 5520,639, patent USA 4596556, patent USA 4790824, patent USA 4941880, patent USA 4940460, WO 97/37705 i WO 97/13537. Alternatywne metody podawania śródskórnego preparatów szczepionki mogą obejmować konwencjonalne strzykawki i igły lub przyrządy zaprojektowane do balistycznego dostarczania stałych szczepionek (WO 99/27961), lub plastry przezskórne (WO 97/48440; WO 98/28037); lub stosowane na powierzchni skóry (śródskórne lub przezskórne podawanie WO 98/20734; WO 98/28037). Kiedy szczepionki według wynalazku są podawane doskórnie lub bardziej specyficznie do warstwy skóry właściwej, szczepionka znajduje się w małej objętości płynu, w szczególności w objętości pomiędzy około 0,05 ml i 0,2 ml. Zawartość antygenów w skórnych lub śródskórnych szczepionkach według wynalazku może być podobna do konwencjonalnych dawek ustalonych dla domięśniowych szczepionek (zobacz powyżej). Jednakże jest cechą szczepionek skórnych lub śródskórnych, że mogą być wytwarzane w niskiej dawce". Zatem antygeny białkowe w szczepionkach o niskiej dawce" są korzystnie obecne w tak małej ilości jak 0,1 do 10 μg, korzystnie 0,1 do 5 μg na dawkę, a antygeny polisacharydowe (korzystniej koniugowane) mogą być obecne w zakresie 0,01-1 μg, korzystniej pomiędzy 0,01 a 0,5 μg polisacharydu na dawkę. Użyty tu termin śródskórne podawanie" oznacza podawanie szczepionki w obszar skóry właściwej. Jednakże szczepionka nie musi być koniecznie podawana wybiórczo do warstwy skóry właściwej. Skóra właściwa jest warstwą w skórze zlokalizowaną pomiędzy około 1,0 i 2,0 mm od powierzchni skóry ludzkiej, ale istnieje pewna różnorodność pomiędzy osobnikami i pomiędzy różnymi częściami ciała. Ogólnie można się spodziewać, że osiągnie się warstwę skóry właściwej na wysokości 1,5 mm poniżej powierzchni skóry. Skóra właściwa jest zlokalizowana pomiędzy warstwą rogową naskórka i naskórkiem na powierzchni a warstwą podskórną poniżej. Zależnie od sposobu podawania szczepionka może być ostatecznie umieszczona jedynie lub przede wszystkim w skórze właściwej lub może być ostatecznie dystrybuowana w naskórku i w skórze właściwej. Niniejszy wynalazek rozważa również kombinację szczepionek, które chronią przeciwko różnym patogenom. Wiele pediatrycznych szczepionek jest obecnie dostępnych jako szczepionki kombinowane, aby w ten sposób ograniczyć liczbę iniekcji, które dzieci muszą otrzymać. Zatem w pediatrycznych szczepionkach inne antygeny z innych patogenów mogą być uwzględnione w szczepionkach według wynalazku. Na przykład, szczepionki według wynalazku mogą być formułowane z (lub podawane osobno, ale w tym samym czasie) dobrze znaną trzywalentną kombinowaną szczepionką obejmującą toksoid błoniczy (DT), toksoid tężcowy (TT) i komponenty krztuścowe [typowo odtoksyczniony toksoid krztuścowy (PT) i włóknista hemaglutynina (FHA) z dowolną pertaktyną (PRN) i/lub aglutyniną 1+2], na przykład handlowa szczepionka INFANRIX-DTPa (SmithKlineBeecham Biologicals), zawierająca antygeny DT, TT, PT, FHA i PRN, lub ze składnikami całej komórki krztuścowej, na przykład handlowy Tritarix firmy SmithKlineBeecham Biologicals. Kombinowana szczepionka może również obejmować inny antygen, taki jak powierzchniowy antygen wirusa zapalenia wątroby typu B (HbsAg), antygeny wirusa Polio (na przykład inaktywowany trzywalentny wirus Polio - IPV), białka błony zewnętrznej Moraxella catarrhalis, białka nietypowalne (bezotoczkowe) H. influenzae, białka błony zewnętrznej N. meningitidis B. Przykłady korzystnych antygenów białkowych Moraxella catarrhalis, które mogą być zawarte w kombinowanej szczepionce (zwłaszcza do zapobiegania zapaleniu ucha środkowego) to: OMP106 [WO 97/41731 (Antex) i WO 96/34960 (PMC)]; OMP21; LbpA i/lub LbpB [WO 98/55606 (PMCP]; TbpA i/lub TbpB [WO 97/13785 i WO 97/32980 (PMC)]; CopB (Helminen ME i wsp. (1993) Infect. Immun. 61: 2003-2010]; UspA1 i/lub UspA2 [WO 93/03761 (University of Texas)]; OmpCD; HasR (PCT/EP99/03824; PilQ (PCT/EP99/03823); OMP85 (PCT/EPOO/01468); lipo06 (GB 9917977.2); lipo10 (GB 9918208.1); lipo11 (GB 9918302.2); lipo18 (GB 9918038.2); P6 (PCT/EP99/03038); D15 (PCT/EP99/03822); OmpA1 (PCT/EP99/06781); Hly3 (PCT/EP99/03257) i OmpE. Przykłady antygenów nietypowalnych Haemophilus influenzae, które mogą być zawarte w kombinacji szczepionki (zwłaszcza do zapobiegania zapaleniu ucha środkowego) obejmują: białko fimbrynowe [(US 5766608 - Ohio State Research Foundation)] i fuzje obejmujące jego peptydy [na przykład fuzje peptydu LBl(f);

PL 210 198 B1 11 US 5843464 (OSU) lub WO 99/64067]; OMP26 [WO 97/01638 (Cortecs)]; P6 [EP 281673 (State University of New York)]; TbpA i/lub TbpB; Hia; Hsf; Hin47; Hif; Hmw1; Hmw2; Hmw3; Hmw4; Hap; D15 (WO 94/12641); białko D (EP 594610); P2 i P5 (WO 94/26304). Inne rozważane kombinacje to pneumokokowe PS i białko według wynalazku w kombinacji z antygenami wirusowymi, na przykład z wirusem grypy (atenuowanym, rozszczepionym lub podzielonym na jednostki [na przykład powierzchniowe glikoproteiny neuraminidazy (NA) i hemaglutynina (HA). Zobacz, na przykład, Chaloupka I. i wsp., Eur, Journal Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1996, 15: 121-127], RSV (np. antygeny F i G lub fuzje F/G, zobacz np. Schmidt A. C. i wsp., J Virol, Maj 2001, str. 4594-4603), PIV3 (np. białka HN i F, zobacz Schmidt i wsp., powyżej). Varicella (np. atenuowana, glikoproteiny I-V, itd.) oraz każda (lub wszystkie) komponenty MMR (odra, świnka, różyczka). Korzystna pediatryczna kombinacja szczepionki rozważana według wynalazku dla ogólnego leczenia i zapobiegania zapaleniu ucha środkowego obejmuje: jeden lub więcej antygen(ów) polisacharydowych Streptococcus pneumoniae (korzystnie skoniugowane z białkiem D), jedno lub więcej białek pneumokokowych wybranych z grupy obejmującej: PhtA, PhtD, PhtB i PhtE (lub ich immunologicznie funkcjonalne odpowiedniki) i jeden lub więcej powierzchniowo prezentowanych antygenów z Moraxella catarrhalis i/lub nietypowalnych Haemophilus influenzae. Białko D może być korzystnie używane jako białko nośnikowe dla polisacharydów pneumokokowych, aby pokonać problemy supresji epitopów (jak wspomniano powyżej) i ponieważ samo jest immunogenem zdolnym do ochrony za pośrednictwem komórek B przed nietypowalnym H. influenzae (nthi). Antygeny Moraxella catarrhalis i nietypowalnych Haemophilus influenzae mogą być zawarte w szczepionce w formie podjednostki lub mogą być dodane jako antygeny obecne na powierzchni pęcherzyków (bąbelków) błony zewnętrznej pochodzących od bakterii. Korzystnie kompozycje antygenowe (i szczepionki) opisane tutaj wcześniej są liofilizowane do czasu, w którym będą użyte, kiedy to są na poczekaniu odtwarzane w rozpuszczalniku. Bardziej korzystnie są one liofilizowane w obecności 3D-MPL i są na poczekaniu odtwarzane w roztworze soli fizjologicznej. Alternatywnie, białko i polisacharyd mogą być przechowywane osobno w zestawie szczepionkowym (albo jedna albo obie komponenty są liofilizowane), komponenty są odtwarzane i albo mieszane przed użyciem, albo podawane osobno pacjentowi. Adiuwant Th1 (korzystnie 3D-MPL) może być obecny albo w jednej albo w dwóch komponentach. Liofilizacja szczepionek jest dobrze znana w dziedzinie wynalazku. Typowo płynna szczepionka jest osuszana w formie zamrożonej w obecności czynników zapobiegających zbrylaniu na przykład cukrów, takich jak sacharoza lub laktoza (obecnych w początkowym stężeniu 10-200 mg/ml). Typowo liofilizacja składa się z serii etapów, na przykład cykl rozpoczyna się w 69 C, stopniowo temperatura jest obniżana do -24 C w ciągu 3 godzin, następnie utrzymywana przez 18 godzin, następnie stopniowo podwyższana do -16 C w ciągu 1 godziny, następnie temperatura ta jest utrzymywana przez 6 godzin, następnie stopniowo podwyższana do +34 C w ciągu 3 godzin i ostatecznie ta temperatura jest utrzymywana przez 9 godzin. Liofilizowanie kompozycji daje w rezultacie bardziej stabilną kompozycję (na przykład zabezpiecza to przed zniszczeniem antygenów polisacharydowych). Metoda ta jest również zadziwiająco odpowiedzialna za wyższe miano przeciwciał przeciw polisacharydom pneumokokowym. Wykazano, że było to szczególnie korzystne dla koniugatów PS 6B. Innym aspektem wynalazku jest zatem liofilizowana antygenowa kompozycja obejmująca koniugat PS 6B z adiuwantem 3D-MPL (korzystnie pozbawionym adiuwantów na bazie glinu) i pneumokokowe białko wybrane z grupy obejmującej: PhtA, PhtD, PhtB i PhtE. Przykłady P r z y k ł a d 1 Polisacharyd otoczkowy S. pneumoniae 11-walentna szczepionka - kandydat zawiera polisacharydy otoczkowe serotypów 1,3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F i 23F, które wytworzono zasadniczo jak opisano w EP 72513. Każdy polisacharyd jest aktywowany i derywatyzowany przy użyciu reakcji chemicznej z CDAP (WO 95/08348) i koniugowany z białkiem nośnikowym. Wszystkie polisacharydy są koniugowane w ich natywnej formie, z wyjątkiem serotypu 3, (którego rozmiar był zredukowany, aby obniżyć jego lepkość). Białko nośnikowe: Wybrane białko nośnikowe jest zrekombinowanym białkiem D (PD) nietypowalnego Haemophilus influenzae wyrażonym w E. coli.

12 PL 210 198 B1 Ekspresja białka D Białko D z Haemophilus influenzae Konstrukt genetyczny do ekspresji białka D Materiały wyjściowe DNA kodujący białko D Białko D jest silnie konserwowane u H. influenzae wszystkich serotypów i szczepów nietypowalnych. Wektor phic348 zawierający sekwencję DNA kodującą cały gen białka D otrzymano od dr A. Forsgrena, Department of Medical Microbiology, University of Lund, Malmö General Hospital, Malmö, Szwecja. Sekwencja DNA białka D była opublikowana przez Janson i wsp. (1991) Infect. Immun. 59:119-125. Wektor ekspresyjny pmg1 Wektor ekspresyjny pmg1 jest pochodną pbr322 (Gross i wsp., 1985), do którego wprowadzono elementy kontroli transkrypcji i translacji dla wstawianych obcych genów pochodzące z bakteriofagaλ (Shatzman i wsp., 1983). Dodatkowo, gen nadający oporność na ampicylinę wymieniono na gen nadający oporność na kanamycynę. Szczep E. coli ARS 8 Szczep E. coli ARS 8 wytworzono przez transdukcję N99 roztworem podstawowym faga P1 hodowanego pierwotnie na szczepie pochodnym SA500 (gal::tn10, lambdakil - ci857 AH1). Szczepy N99 i SA500 są szczepami pochodzącymi z laboratorium dr Martina Rosenberga w National Institute of Health. Wektor ekspresyjny pmg1 Do wytworzenia białka D, DNA kodujący białko sklonowano w wektorze ekspresyjnym pmg 1. Plazmid ten wykorzystuje sekwencje sygnałowe z DNA faga lambda w celu kierowania transkrypcją i translacją wprowadzonych obcych genów. Wektor zawiera starter PL, operator OL i dwa miejsca wykorzystywane (NutL i NutR) do zmniejszenia efektów polarności transkrypcji, kiedy dostarczone jest białko N (Gross i wsp., 1985). Wektory zawierające starter PL są wprowadzane do lizogenicznej E. coli jako gospodarza dla stabilizacji plazmidu. Szczepy lizogenicznego gospodarza zawierają DNA faga lambda, defektywnego w procesie replikacji, w postaci zintegrowanej z genomem (Shatzman i wsp., 1983). Chromosomalny DNA faga lambda kieruje syntezą białka represora cl, który wiąże się z operatorem OL z wektora i uniemożliwia wiązanie się polimerazy RNA do startera PL i tym samym transkrypcję wstawionego genu. Gen cl ze szczepu ekspresyjnego AR58 zawiera wrażliwe na temperaturę przesunięcie tak, że PL kierujący transkrypcją można regulować zmianą temperatury, tzn. podniesienie temperatury hodowli inaktywuje represor i rozpoczyna się synteza obcego białka. Taki system ekspresji pozwala na kontrolowanie syntezy obcych białek w szczególności tych, które mogą być toksyczne dla komórki (Shimataka i Rosenberg, 1981). Szczep E. coli AR58 Lizogeniczny szczep E. coli AR58 używany do wytwarzania białka D będącego nośnikiem jest pochodną standardu NIH E. coli K12 szczep N99 (F su galk2, lacz thr ). Zawiera on defektywnego lizogennego faga lambda (gal::tn10 lambdakil ci857 ΔH1). Fenotyp Kil zapobiega wyłączaniu syntezy makrocząsteczek gospodarza. Mutacja ci857 nadaje wrażliwość na temperaturę receptorowi cl. Delecja ΔHl usuwa prawy operon faga lambda oraz loci gospodarza bio, uvr3 i ch1a. Szczep AR58 wytworzono przez transdukcję N99 roztworem podstawowym faga P1 hodowanego pierwotnie na szczepie pochodnym SA500 (gal::tn10, lambdakil ci857 ΔHl). Wprowadzenie defektywnego lizogenu do N99 selekcjonowano tetracykliną na podstawie obecności transpozonu TN10 kodującego oporność na tetracyklinę w przylegającym genie gale. Konstrukcja wektora pmgmdpprd Wektor pmg1 zawierający gen kodujący niestrukturalne białko S1 wirusa grypy (pmgns1) wykorzystano do konstrukcji pmgmdpprd. Gen białka D amplifikowano przy użyciu PCR na matrycy wektora phic348 (Janson i wsp., 1991) stosując startery zawierające miejsca restrykcyjne Ncol i Xbal odpowiednio na końcach 5' i 3'. Fragment NcoI/XbaI wprowadzono do pmgns1 pomiędzy Ncol i Xbal wytwarzając w ten sposób białko zawierające na końcu N 81 aminokwasów z białka NS1, a za nimi białko PD. Wektor oznaczono jako pmgns1prd. Na bazie konstruktu opisanego powyżej wytworzono końcowy konstrukt do wytwarzania białka D. Z pmgns1prd usunięto fragment BamHI/BamHI. Taka hydroliza DNA usuwa region kodujący NS1 z wyjątkiem pierwszych trzech reszt na końcu N. Po ponownej ligacji wektora wytworzono gen kodujący fuzję białkową o następującej sekwencji na końcu N: