(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/US02/039646

PL 214803 B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 214803 (21) Numer zgłoszenia: 374382 (22) Data zgłoszenia: 11.12.2002 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 11.12.2002, PCT/US02/039646 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: 19.06.2003, WO03/049703 (13) B1 (51) Int.Cl. A61K 39/12 (2006.01) A61K 39/295 (2006.01) C12P 19/34 (2006.01) C12N 7/00 (2006.01) C12N 7/04 (2006.01) (54) Zakaźna chimerowa cząsteczka kwasu nukleinowego cirkowirusa świni PCV1-2, sposób jej wytwarzania, zawierający ją plazmid lub wektor wirusowy i komórka gospodarza, oraz chimerowy cirkowirus świni, sposób wytwarzania immunogennego produktu polipeptydowego, szczepionka wirusowa i jej zastosowanie, zakaźna odwrotna chimerowa cząsteczka kwasu nukleinowego cirkowirusa świni PCV1-2 (30) Pierwszeństwo: 12.12.2001, US, 60/340,775 08.11.2002, US, 60/424,840 09.12.2002, US, 10/314,512 (73) Uprawniony z patentu: VIRGINIA TECH INTELLECTUAL PROPERTIES, INC., Blacksburg, US IOWA STATE UNIVERSITY RESEARCH FOUNDATION, INC., Ames, US (43) Zgłoszenie ogłoszono: 17.10.2005 BUP 21/05 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 30.09.2013 WUP 09/13 (72) Twórca(y) wynalazku: XIANG-JIN MENG, Blacksburg, US MARTIJN FENAUX, Blacksburg, US PATRICK G. HALBUR, Ames, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Magdalena Tagowska

2 PL 214 803 B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest zakaźna chimerowa cząsteczka kwasu nukleinowego cirkow i- rusa świni PCV1-2, sposób jej wytwarzania, zawierający ją plazmid lub wektor wirusowy i komórka gospodarza, oraz chimerowy cirkowirus świni, sposób wytwarzania immunogennego produktu polipeptydowego, szczepionka wirusowa i jej zastosowanie, zakaźna odwrotna chimerowa cz ą- steczka kwasu nukleinowego PCV2-1. Ogólnie opisane mniejszym rozwiązania dotyczą zakaźnych klonów DNA cirkowirusa świni typu 1 (PCV1) i typu 2 (PCV2), chimerowych zakaźnych klonów DNA PCV1-2 oraz żywych chimerowych wirusów pochodzących z chimerowych klonów DNA, użytecznych jako szczepionki. Cirkowirus świni (PCV, ang. porcine circovirus) został początkowo wyodrębniony jako zanieczyszczenie hodowli komórkowej linii komórek nerki świńskiej PK-15 (I. Tischer i wsp., A very small porcine virus with circular single-stranded DNA, Nature 295:64-66 (1982); I. Tischer i wsp., Characterization of papovavirus and picomavirus-like particles in permanent pig kidney cell lines, Zentralbl. Bakteriol. Hyg. Otg. A. 226(2):153-167 (1974)). PCV jest małym ikozaedralnym wirusem bezotoczkowym, który zawiera jednoniciowy kolisty genom DNA o wielkości około 1,76 kb. PCV jest zaliczany do rodziny Circoviridae, która zawiera trzy inne zwierzęce cirkowirusy (wirus anemii kurcząt (CAV, ang. chicken anemia virus), wirus papuziej choroby dzioba i piór (PBFDV, ang. psittacine beak and feather disease virus) i niedawno odkryty cirkowirus gołębia (CoCV, ang. columbid circovirus)) oraz trzy roślinne cirkowirusy (wirus krzaczastości wierzchołkowej bananowca, wirus zgnilizny liści kokosa i wirus karłowatości goździka) (M. R. Bassami i wsp., Psittacine beak and feather disease virus nucleotide sequence analysis and its relationship to porcine circovirus, plant circoviruses, and chicken anemia virus, Virology 249:453-459 (1998); J. Mankertz i wsp., Transcription analysis of porcine circovirus (PCV), Virus Genes 16:267-276 (1998); A. Mankertz i wsp., Cloning and sequencing of columbid circovirus (CoCV), a new circovirus from pigeons, Arch. Virol. 145:2469-2479 (2000); B. M. Meehan i wsp., Sequence of porcine circovirus DNA: affinities with plant circoviruses, J. Gen. Virol. 78:221-227 (1997); B. M. Meehan i wsp., Characterization of novel circovirus DNAs associated with wasting syndromes in pigs, J. Gen. Virol. 79:2171-2179 (1998); D. Todd i wsp., Comparison of three animal viruses with circular single-stranded DNA genomes, Arch. Virol. 117:129-135 (1991)). Przedstawiciele trzech poprzednio opisanych cirkowirusów zwierzęcych (PCV, CAV i PBFDV) nie wykazują homologii sekwencji nukleotydowej lub determinant antygenowych ze sobą nawzajem (M. R. Bassami i wsp., 1998, op. cit.; D. Todd i wsp., 1991, op. cit.). Genom nowo odkrytego CoCV wykazuje około 40% identyczności sekwencji nukleotydowej z genomem PCV (A. Mankertz i wsp., Cloning and sequencing of columbid circovirus (CoCV), a new circovirus from pigeons, Arch. Virol. 145:2469-2479 (2000)). Obecnie, nowy ludzki cirkowirus o kolistym genomie, opisany jako wirus przenoszony przez transfuzję lub wirus TT (TTV, ang. transfusion transmitted virus) został wyodrębniony od osób w związku z zapaleniem wątroby po transfuzji (H. Miyata i wsp., Identification of a novel GC-rich 113-nucleotide region to complete the circular, singlestranded DNA genome of TT virus, the first human circovirus, J. Virol. 73:3582-3586 (1999); T. Nishizawa i wsp., A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transaminase levels in posttransfusion hepatitis of unknown etiology, Biochem. Biophys. Res. Commun. 241:92-97 (1997)). Ponadto, ludzki mini-wirus podobny do TTV został wyodrębniony od zdrowych dawców krwi (P. Biagini i wsp., Genetic analysis of full-length genomes and subgenomic sequences of TT virus-like mini virus human isolates, J. Gen. Virol. 82: 379-383 (2001); K. Takahashi i wsp., Identification of a new human DNA virus (TTV-like mini virus, TLMV) intermediately related to TT virus and chicken anemia virus, Arch. Virol. 145:979-93 (2000)) i trzeci nowy ludzki cirkowirus, znany jako wirus SEN (SENV), został również wyodrębniony od ludzi z zapaleniem wątroby po transfuzji (T. Umemura i wsp., SEN virus infection and its relationship to transfusion-associated hepatitis, Hepathology 33:1303-1311 (2001)). Organizacja genomowa zarówno ludzkiego TTV jak i ludzkiego TLMV jest podobna do tej u CAV (P. Biagini i wsp., 2001, op. cit.; H. Miyata i wsp., 1999, op. cit.; K. Takahashi i wsp., 2000, op. cit.). Chociaż przeciwciała przeciwko PCV zostały wykryte u różnych gatunków zwierząt, włączając ludzi, myszy, bydło i świnie (G. M. Allan i wsp., Production, preliminary characterization and applications of monoclonal antibodies to porcine circovirus, Vet. Immunol. Immunopathol. 43:357-371 (1994); G. C. Dulac and A. Afshar, Porcine circovirus antigens in PK-15 cell line (ATCC CCL-33) and evidence of antibodies to circovirus in Canadian pigs, Can. J. Vet. Res. 53:431-433 (1989); S. Edwards and J. J. Sands, Evidence of circovirus infection in British pigs, Vet. Rec. 134:680-1 (1994); J. C. Harding and E.G. Clark, Recognizing and diagnosing postweaning

PL 214 803 B1 3 multisystemic wasting syndrome (PMWS), Swine Health and Production 5:201-203 (1997); R. K. Hines and P. D. Lukert, Porcine circovirus: a serological survey of swine in the United States, Swine Health and Production 3:71-73 (1995); G. P. Nayar i wsp., Evidence for circovirus in cattle with respiratory disease and from aborted bovine fetuses, Can. Vet. J. 40:277-278 (1999); I. Tischer i wsp., Distribution of antibodies to porcine circovirus in swine populations of different breeding farms, Arch. Virol. 140:737-743 (1995); I. Tischer i wsp., Presence of antibodies reacting with porcine circovirus in sera of humans, mice, and cattle, Arch. Virol. 140:1427-1439 (1995)), niewiele wiadomo o patogenezie PCV u tych gatunków zwierzęcych. Eksperymentalne zakażenie świń PCV pochodzącym z komórek PK-15 nie doprowadziło do choroby klinicznej, a zatem wirus ten nie jest uważany za chorobotwórczy dla świń (G. M. Allan i wsp., Pathogenesis of porcine circovirus; experimental infections of colostrum deprived piglets and examination of pig foetal material, Vet. Microbiol. 44:49-64 (1995); I. Tischer i wsp., Studies on epidemiology and pathogenicity of porcine circovirus, Arch. Virol. 91:271-276 (1986)). Niepatogenny PCV z zanieczyszczonych komórek linii PK-15 został określony jako cirkowirus świni typu 1 lub PCV1. Wielonarządowy poodsadzeniowy zespół wyniszczający u świń (PMWS, ang. postweaning multisystemic wasting syndrome), po raz pierwszy opisany w 1991 r. (J. C. Harding i E.G. Clark, 1997, op. cit.), jest złożoną chorobą prosiąt po odstawieniu, która staje się coraz bardziej rozpowszechniona. W związku z groźbą możliwego poważnego wpływu gospodarczego na przemysł trzody chlewnej, pilne stało się opracowanie szczepionki przeciwko PCV2, głównemu czynnikowi etiologicznemu PMWS. PMWS dotyka przede wszystkim świnie w wieku 5-18 tygodni. Kliniczne objawy PMWS obejmują stopniową utratę wagi, płytki i częsty oddech, anemię, biegunkę i żółtaczkę. Współczynnik śmiertelności może wahać się od 1% do 2%, i nawet do 40% w pewnych skomplikowanych przypadkach w Wielkiej Brytanii (M. Muirhead, Sources of information on PMWS/PDNS, Vet. Rec. 150:456 (2002)). Uszkodzenia mikroskopowe charakterystyczne dla PMWS obejmują ziarniniakowate śródmiąższowe zapalenie płuc, limfadenopatię, zapalenie wątroby i zapalenie nerek (G. M. Allan i J. A. Ellis, Porcine circoviruses: a review, J. Vet. Diagn. Invest. 12:3-14 (2000); J. C. Harding and E.G. Clark, 1997, op. cit.). PMWS został obecnie zaobserwowany u świń w Kanadzie, Stanach Zjednoczonych (G. M. Allan i wsp., Novel porcine circoviruses from pigs with wasting disease syndromes, Vet. Rec. 142:467-468 (1998); G. M. Allan i wsp., Isolation of porcine circovirus-like viruses from pigs with a wasting disease in the USA and Europe, J. Vet. Diagn. Invest. 10:3-10 (1998); G. M. Allan and J. A. Ellis, 2000, op. cit.; J. Ellis i wsp., Isolation of circovirus from lesions of pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome, Can. Vet. J. 39:44-51 (1998); A. L. Hamel i wsp., Nucleotide sequence of porcine circovirus associated with postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs, J. Virol. 72:5262-5267 (1998); M. Kiupel i wsp., Circovirus-like viral associated disease in weaned pigs in Indiana, Vet. Pathol. 35:303-307 (1998); R. Larochelle i wsp., Identification and incidence of porcine circovirus in routine field cases in Quebec as determined by PCR, Vet. Rec. 145:140-142 (1999); B. M. Meehan i wsp., 1998, op. cit.; I. Morozov i wsp., Detection of a novel strain of porcine circovirus in pigs with post weaning multisystemic wasting syndrome, J. Clin. Microbiol. 36:2535-2541 (1998)), większości krajów europejskich (G. M. Allan i wsp., Isolation of porcine circovirus-like viruses from pigs with a wasting disease in the USA and Europe, J. Vet. Diagn. Invest. 10:3-10 (1998); G. M. Allan i J. A. Ellis, 2000, op. cit.; S. Edwards i J. J. Sands, 1994, op. cit.; S. Kennedy i wsp., Porcine circovirus infection in Northern Ireland, Vet. Rec. 142:495-496 (1998); A. Mankertz i wsp., Characterization of PCV-2 isolates from Spain, Germany and France, Virus Res. 66:65-77 (2000); C. Rosell i wsp., Identification of porcine circovirus in tissues of pigs with porcine dermatitis and nephropathy syndrome. Vet. Rec. 146:40-43 (2000); P. Spillane i wsp., Porcine circovirus infection in the Republic of Ireland, Vet. Rec. 143:511-512 (1998); G. J. Wellenberg i wsp., Isolation and characterization of porcine circovirus type 2 from pigs showing signs of post-weaning multisystemic wasting syndrome in the Netherlands, Vet. Quart. 22:167-72 (2000)) i w niektórych krajach w Azji (C. Choi i wsp., Porcine postweaning multisystemic wasting syndrome in Korean pig: detection of porcine circovirus 2 infection by immunohistochemistry and polymerase chain reaction, J. Vet. Diagn. Invest. 12:151-153 (2000); A. Onuki i wsp., Detection of porcine circovirus from lesions of a pig with wasting disease in Japan, J. Vet. Med. Sci. 61:1119-1123 (1999)). PMWS ma potencjalnie poważny wpływ ekonomiczny na przemysł trzody chlewnej na całym świecie. Głównym czynnikiem etiologicznym PMWS jest patogenny szczep PCV opisany jako cirkowirus świni typu 2 lub PCV2 (G. M. Allan i wsp., Novel porcine circoviruses from pigs with wasting disease syndromes, Vet. Rec. 142:467-468 (1998); G. M. Allan i wsp., Isolation of porcine circovirus-like viru-

4 PL 214 803 B1 ses from pigs with a wasting disease in the USA and Europe, J. Vet. Diagn. Invest. 10:3-10 (1998); G. M. Allan i wsp., Isolation and characterisation of circoviruses from pigs with wasting syndromes in Spain, Denmark and Northern Ireland, Vet. Microbiol. 66:115-23 (1999); G. M. Allan and J. A. Ellis, 2000, op. cit.; J. Ellis i wsp., 1998, op. cit.; A. L. Hamel i wsp., 1998, op. cit.; B. M. Meehan i wsp., 1998, op. cit.; I. Morozov i wsp., 1998, op. cit.). Została określona całkowita sekwencja genomowa PCV2 związanego z PMWS (M. Fenaux i wsp., Genetic characterization of type 2 porcine circovirus (PCV-2) from pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome in different geographic regions of North America and development of a differential PCR-restriction fragment length polymorphism assay to detect and differentiate between infections with PCV-1 and PCV-2, J. Clin. Microbiol. 38:2494-503 (2000); A. L. Hamel i wsp., 1998, op. cit.; J. Mankertz i wsp., 1998, op. cit.; B. M. Meehan i wsp., 1997, op. cit.; B. M. Meehan i wsp., 1998, op. cit.; I. Morozov i wsp., 1998, op. cit.). PCV1 jest powszechny u świń, ale nie jest dla świń chorobotwórczy. Dla odróżnienia, spokrewniony genetycznie PCV2 jest chorobotwórczy i powoduje PMWS u świń. Analizy sekwencji wykazują, że związany z PMWS PCV2 wykazuje tylko około 75% identyczności sekwencji nukleotydowej z niepatogennym PCV1. Gen ORF2 zarówno niepatogennego PCV1 jak i patogennego PCV2 koduje główne immunogenne białko kapsydu wirusowego (P. Nawagitgul i wsp., Modified indirect porcine circovirus (PCV) type 2-based and recombinant capsid protein (ORF2)-based ELISA for the detection of antibodies to PCV, Immunol. Clin. Diagn. Lab Immunol. 1:33-40 (2002); P. Nawagitgul i wsp., Open reading frame 2 of porcine circovirus type 2 encodes a major capsid protein, J. Gen. Virol. 81:2281-2287 (2000)). Początkowe próby powtórzenia klinicznego PMWS u zwykłych świń przez inokulację PCV2 były nieskuteczne (M. Balasch i wsp., Experimental inoculation of conventional pigs with tissue homogenates from pigs with post-weaning multisystemic wasting syndrome, J. Comp. Pathol. 121:139-148 (1999); M. Fenaux i wsp., Cloned Genomic DNA of Type 2 Porcine Circovirus (PCV-2) Is Infectious When Injected Directly into the Liver and Lymph Nodes of SPF Pigs: Characterization of Clinical Disease, Virus Distribution, and Pathologic Lesions, J. Virol. 76:541-551 (2002)). Doświadczalne powtórzenie klinicznego PMWS u sterylnych świń i u zwykłych świń z homogenatami tkankowymi od świń z naturalnie występującym PMWS i PCV2 namnażanym w hodowli komórkowej dały różne rezultaty. Kliniczny PMWS został powtórzony u sterylnych świń (SPF) i u świń pozbawionych siary, urodzonych przez cesarskie cięcie, zakażanych łącznie PCV2 i parwowirusem świni (PPV, ang. porcine parvovirus) (G. M. Allan i wsp., Experimental reproduction of severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus, J. Comp. Pathol. 121:1-11 (1999); S. Krakowka i wsp., Viral wasting syndrome of swine: experimental reproduction of postweaning multisystemic wasting syndrome in gnotobiotic swine by coinfection with porcine circovirus 2 and porcine parvovirus, Vet. Pathol. 37:254-263 (2000)), oraz u sterylnych świń zakażanych PCV2, kiedy ich układ odpornościowy był aktywowany hemocjaniną skałoczepu w niekompletnym adiuwancie Freunda (S. Krakowka i wsp., Activation of the immune system is the pivotal event in the production of wasting disease in pigs infected with porcine circovirus-2 (PCV-2), Vet. Pathol. 38:31-42 (2001)). Kliniczny PMWS został również powtórzony u świń urodzonych przez cesarskie cięcie/pozbawionych siary (CD/CD) zakażanych samym PCV2 (P. A. Harms i wsp., Experimental reproduction of severe disease in CD/CD pigs concurrently infected with type 2 porcine circovirus and porcine reproductive and respiratory syndrome virus, Vet. Pathol. 38:528-539 (2001)) i u zwykłych świń zakażanych równocześnie PCV2 oraz parwowirusem świni (PPV), albo wirusem zespołu reprodukcyjno-oddechowego świń (PRRSV, ang. porcine reproductive and respiratory syndrome virus) (A. Rivora i wsp., Experimental inoculation of conventional pigs with porcine reproductive and respiratory syndrome virus and porcine circovirus 2, J. Virol. 76: 3232-3239 (2002)). W przypadku łącznego zakażania PRRSV/PCV2 charakterystyczne patologiczne objawy PMWS, takie jak ubytki limfatyczne, zapalenie ziarniniakowate i nekrotyzujące zapalenie wątroby są wywoływane PCV2, a nie przez PRRSV (P. A. Harms i wsp., 2001, op. cit.). Jednakże, kliniczny PMWS nie został powtórzony u sterylnych świń zakażanych samym PCV2 (G. M. Allan i wsp., Experimental infection of colostrums deprived piglets with porcine circovirus 2 (PCV2) and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) potentiates PCV2 replication, Arch. Virol. 145:2421-2429 (2000); G. M. Allan i wsp., A sequential study of experimental infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus: immunostaining of cryostat sections and virus isolation, J. Vet. Med. 47:81-94 (2000); G. M. Allan i wsp., Experimental reproduction of severe wasting disease by coinfection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus, J. Comp. Pathol. 121:1-11 (1999); M. Balasch i wsp., 1999, op. cit.; J. Ellis i wsp., Reproduction of lesions of postweaning multisystemic wasting syndrome in gnotobiotic

PL 214 803 B1 5 piglets, J. Vet. Diagn. Invest. 11:3-14 (1999); S. Kennedy i wsp., Reproduction of lesions of postweaning multisystemic wasting syndrome by infection of conventional pigs with porcine circovirus type 2 alone or in combination with porcine parvovirus J. Comp. Pathol. 122:9-24 (2000); S. Krakowka i wsp., 2001, op. cit.; S. Krakowka i wsp., 2000, op. cit.; R. M. Pogranichny i wsp., Characterization of immune response of young pigs to porcine circovirus type infection, Viral. Immunol. 13:143-153 (2000)). Inokula wirusowe używane w tych doświadczeniach stanowiły albo homogenaty tkankowe ze świń z naturalnie występującym PMWS, albo wirus namnażany w hodowlach komórek PK-15 (G. M. Allan i wsp., Experimental infection of colostrums deprived piglets with porcine circovirus 2 (PCV2) and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) potentiates PCV2 replication, Arch. Virol. 145:2421-2429 (2000); G. M. Allan i wsp., A sequential study of experimental infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus: immunostaining of cryostat sections and virus isolation, J. Vet. Med. 47:81-94 (2000); G. M. Allan i wsp., Experimental reproduction of severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus, J. Comp. Pathol. 121:1-11 (1999); M. Balasch i wsp., 1999, op. cit.; J. Ellis i wsp., 1999, op. cit.; S. Kennedy i wsp., 2000, op. cit.; S. Krakowka i wsp., 2001, op. cit.; S. Krakowka i wsp., 2000, op. cit.; R. M. Pogranichnyy i wsp., 2000, op. cit.). Ponieważ homogenaty tkankowe mogą zawierać inne powszechne drobnoustroje świń, takie jak PPV i wirus zespołu reprodukcyjno-oddechowego świń (PRRSV) (G. M. Allan i wsp., Experimental infection of colostrums deprived piglets with porcine circovirus 2 (PCV2) and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) potentiates PCV2 replication, Arch. Virol. 145:2421-2429 (2000); G. M. Allan i wsp., Experimental reproduction of severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus, J. Comp. Pathol. 121:1-11 (1999); G. M. Allan and J. A. Ellis, 2000, op. cit.; J. A. Ellis i wsp., Coinfection by porcine circoviruses and porcine parvovirus in pigs with naturally acquired postweaning multisystemic wasting syndrome, J. Vet. Diagn. Invest. 12:21-27 (2000); C. Rosell i wsp., 2000, op. cit.), i ponieważ linia komórkowa ATCC PK-15 używana do namnażania PCV2 była stale zakażona PCV1 (G. C. Dulac i A. Afshar, 1989, op. cit.), choroba kliniczna i uszkodzenia patologiczne powtórzone w tych doświadczeniach mogą nie być wyłącznie związane z zakażeniem PCV2 (G. M. Allan i wsp., Experimental infection of colostrums deprived piglets with porcine circovirus 2 (PCV2) and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) potentiates PCV2 replication, Arch. Virol. 145:2421-2429 (2000); G. M. Allan i wsp., A sequential study of experimental infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus: immunostaining of cryostat sections and virus isolation, J. Vet. Med. 47:81-94 (2000); G. M. Allan i wsp., Experimental reproduction of severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus, J. Comp. Pathol. 121:1-11 (1999); G. M. Allan and J. A. Ellis, 2000, op. cit.; J. A. Ellis i wsp., 2000, op. cit.). Kliniczny PMWS został również powtórzony u świń CD/CD inokulowanych PCV2, kiedy zaszczepiono je Mycoplasma hyopneumoniae (G. M. Allan i wsp., Immunostimulation, PCV-2 and PMWS, Vet. Rec. 147:171-172 (2000)). Dwa ostatnie badania polowe, G. M. Allana i wsp., Neonatal vaccination for Mycoplasma hyopneumoniae and postweaning multisystemic wasting syndrome: a field trial, Pig J. 48:34-41 (2001), i S. C. Kyriakisa i wsp., The effects of immuno-modulation on the clinical and pathological expression of postweaning multisystemic wasting syndrome, J. Comp. Pathol. 126:38-46 (2002), sprawdziły wpływ modulacji immunologicznej przez szczepionkę Mycoplasma hyopneumoniae na rozwój PMWS w stadach endemicznych i wykazały znaczące obniżenie przypadków PMWS w grupach nieszczepionych w porównaniu ze zwierzętami szczepionymi. Jednakże, inne niedawne badanie wykorzystujące zwykłe prosięta SPF w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych nie mogło powtórzyć takiego wyniku, sugerując, że szczepienia M. hyopneumoniae może potencjalnie wpływać na rozwój klinicznego PMWS, ale z pewnością ma drugorzędne znaczenie wobec zakażania PCV2. W oparciu o te i inne badania, PCV2 jest niemniej uważany za główny, lecz nie wyłączny czynnik etiologiczny PMWS. Brak zakaźnego preparatu wirusowego biologicznie czystej postaci PCV2 zahamował zrozumienie patogenezy PCV2 i znaczenia PCV2 w PMWS. Nie wykazano jednoznacznie, że szczepienia przeciwko PPV i być może PRRSV zapobiegają wystąpieniu PMWS u świń zakażanych PCV2. W konsekwencji, znalezienie bezpiecznej, lecz skutecznej szczepionki, która jest specyficznie skierowana przeciwko PMWS było utrudnione. Istnieje zdecydowana potrzeba uznawana w dziedzinie weterynarii, aby wytworzyć skuteczną, bezpieczną szczepionkę przeciwko zakażeniom PCV2 i PMWS. Opis patentowy U.S.A. nr 6287856 (Poet i wsp.) i WO 99/45956 dotyczy kwasów nukleinowych z wirusa papuziej choroby dzioba i piór (BFDV), cirkowirusa, który zakaża gatunki ptaków oraz z cir-

6 PL 214 803 B1 kowirusa świni (PCV). Zgłoszenie patentowe proponuje kompozycje szczepionki zawierające niezwiązane DNA lub mrna i ujawnia wektor kwasu nukleinowego do przejściowej ekspresji PCV w komórce eukariotycznej, zawierający sekwencję regulatorową działającą cis na transkrypcję lub translację, pochodzącą z promotora lub wzmacniacza transkrypcji genu wczesnego ludzkiego wirusa cytomegalii, przyłączoną funkcjonalnie do kwasu nukleinowego tej sekwencji. Jednakże, ponieważ DNA PCV zostało otrzymane wyłącznie z linii PK-15, prawdopodobnie zawiera niepatogenny PCV1 ujawniony prawie 30 lat temu przez I. Tischera i wsp., 1974, op. cit., a zatem, najprawdopodobniej nie jest skuteczne w wywoływaniu reakcji immunologicznej przeciwko PCV2 lub zakażeniom wywoływanym przez PCV2. Szczepionki podjednostkowe z rekombinowanych białek wytwarzane z wektorów obejmujących otwarte ramki odczytu są również sugerowane w opisie patentowym, ale otwarte ramki odczytu z PCV nie zostały dobrze scharakteryzowane czy rozróżnione jedna od drugiej. Ponieważ źródłem DNA PCV są komórki PK-15, białka wytwarzane z tych wektorów obejmujących otwarte ramki odczytu PCV1 nie wykazywałyby właściwych cech immunogennych, jeśli w ogóle, przeciwko PCV2. Opis patentowy U.S.A. nr 6217883 (Allan i wsp.) oraz francuski opis patentowy nr 2781159B odnoszą się do wyodrębnienia pięciu szczepów PCV z próbek płucnych lub torbielowych pobranych od świń zakażonych PMWS w Kanadzie, Kalifornii i Francji (Bretania), i ich wykorzystania w połączeniu z przynajmniej jednym antygenem parwowirusa świni w kompozycjach immunogennych. Białka kodowane przez otwarte ramki odczytu (ORF) PCV2 obejmujące ORF1 do ORF13 są szeroko opisywane w opisie patentowym, ale nie ma przykładu specyficznego białka wykazującego właściwości immunogenne. Opis patentowy ponadto ujawnia wektory składające się z plazmidów DNA, liniowych cząsteczek DNA i rekombinowanych wirusów, które zawierają i wytwarzają in vivo cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą antygen PCV. Szereg innych odnośników literaturowych, na przykład opisy patentowe U.S.A. nr 6391314 B1; 6368601 B1; francuskie opisy patentowe nr 2769321; 2769322; zgłoszenia międzynarodowe WO 01/96377 A2; WO 00/01409; WO 99/18214; WO 00/77216 A2; WO 01/16330 A2; WO 99/29871; itd., również opisują podawanie polipeptydów albo kwasów nukleinowych kodujących polipeptydy PCV1 lub PCV2 różnych szczepów. Jednakże, niepatogenny PCV1 nie będzie użyteczny przeciwko zakażeniom PCV2 i patogenne szczepy PCV2 opisane w dziedzinie, nawet jeśli atenuowane, najprawdopodobniej będą miały ograniczoną wartość ze względu na zwykłą tendencję żywego wirusa do powrotu do postaci zjadliwej. Zatem, nadal istnieje zapotrzebowanie w dziedzinie na żywy, zakaźny, niepatogenny antygen do szczepienia świń przeciwko poważnemu zakażeniu lub PMWS powodowanemu przez PCV2, który jest skuteczny i pozostaje bezpieczny w szczepionkach weterynaryjnych. Cele te są realizowane przez skonstruowanie nowego, żywego, chimerowego cirkowirusa świni opisanego niniejszym, który jest oparty o szkielet genomowy niepatogennego PCV1 wyodrębnionego przez I. Tischera i wsp. prawie 30 lat temu. Nowy chimerowy cirkowirus świni według wynalazku jest w stanie zaspokoić istniejącą od dawna potrzebę przez wyjątkowe i korzystne zachowanie niepatogennego fenotypu PCV1, lecz wywołując specyficzną odpowiedź immunologiczną przeciwko patogennemu PCV2. Streszczenie wynalazku Niniejszy wynalazek dotyczy zakaźnych chimerowych klonów DNA cirkowirusa świni (PCV) i żywych chimerowych wirusów otrzymanych z klonów DNA, które są użyteczne jako szczepionki. Te nowe, żywe, chimerowe. genetycznie niezjadliwe wirusy zostały wykonane ze struktury genomowej niepatogennego PCV1, w której immunogenny gen szczepu patogennego PCV2 zastępuje gen PCVl, zazwyczaj w tej samej odpowiadającej pozycji. W szczególności przedmiotem wynalazku jest zakaźna chimerowa cząsteczka kwasu nukleinowego cirkowirusa świni (PCV1-2) obejmująca cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą zakaźny, niepatogenny PCV1, która w miejsce genu otwartej ramki odczytu 2 (ORF2) cząsteczki kwasu nukleinowego PCV1 zawiera gen immunogennej ORF2 kapsydu patogennego PCV2. Korzystnie chimerowa cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku obejmuje sekwencję nukleotydową przedstawioną w Sekw. nr Id: 2, jej nić komplementarną lub sekwencję nukleotydową o przynajmniej 95% homologii do sekwencji nukleotydowej z Sekw. nr Id: 2. Wynalazek obejmuje ponadto biologicznie funkcjonalne plazmidy, wektory wirusowe i im podobne, które zawierają nowe rekombinowane cząsteczki kwasów nukleinowych według wynalazku, odpowiednie komórki gospodarza transfekowane wektorami zawierającymi DNA. Biologicznie funkcjonalny plazmid lub wektor wirusowy według wynalazku zawiera chimerową cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku, a korzystnie stanowi plazmid o numerze depozytu dokonanego dla celów patentowych ATCC PTA-3912.

PL 214 803 B1 7 Izolowana prokariotyczna lub eukariotyczna komórka gospodarza według wynalazku jest transfekowana wektorem zawierającym chimerową cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku. Przedmiotem wynalazku jest również niezjadliwy, zakaźny, chimerowy cirkowirus świni zawierający chimeryczną cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku. Korzystnie zakaźny chimerowy cirkowirus świni według wynalazku zawiera chimerową cząsteczkę kwasu nukleinowego, która jest zawarta lub pochodzi z plazmidu o numerze depozytu dokonanego dla celów patentowych ATCC PTA-3912. W kolejnym aspekcie wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania immunogennego produktu polipeptydowego, który obejmuje: wzrost, w odpowiednich warunkach odżywczych, prokariotycznych lub eukariotycznych komórek gospodarza transfekowanych cząsteczką kwasu nukleinowego według wynalazku, umożliwiający ekspresję produktu polipeptydowego oraz izolację pożądanego produktu polipeptydowego ekspresji cząsteczki kwasu nukleinowego. Wynalazek dostarcza również szczepionki wirusowej chroniącej świnię przed infekcją wirusową lub wielonarządowym poodsadzeniowym zespołem wyniszczającym (PMWS) wywoływanym przez PCV2, zawierającej nietoksyczny, dopuszczalny fizjologicznie nośnik i immunogenną ilość składnika wybranego z grupy składającej się z: (a) chimerowej cząsteczki kwasu nukleinowego o sekwencji nukleotydowej przedstawionej w Sekw. nr Id: 2, jej nici komplementarnej lub sekwencji nukleotydowej o przynajmniej 95% homologii do sekwencji nukleotydowej z Sekw. nr Id: 2; (b) biologicznie funkcjonalnego plazmidu lub wektora wirusowego zawierającego chimerową cząsteczkę kwasu nukleinowego, nić komplementarną lub sekwencję nukleotydową o przynajmniej 95% homologii do sekwencji nukleotydowej z Sekw. nr Id: 2; (c) niezjadliwego, zakaźnego chimerowego cirkowirusa świni zawierającego chimerową cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku. Korzystnie szczepionka wirusowa według wynalazku zawiera żywego, chimerowego cirkowirusa świni. Również korzystnie szczepionka wirusowa według wynalazku obejmuje ponadto immunogenną ilość dodatkowego antygenu świni, a korzystniej co najmniej jeden antygen wybrany z grupy składającej się z wirusa zespołu reprodukcyjno-oddechowego świń (PRRSV) i parwowirusa świni (PPV). Twórcy wynalazku przedstawili także sposoby ochrony świń przed zakażeniem wirusowym lub wielonarządowym poodsadzeniowym zespołem wyniszczającym (PMWS), powodowanym przez PCV2, obejmujące podawanie świni wymagającej takiej ochrony immunologicznie skutecznej ilości szczepionki zawierającej, na przykład, sklonowane chimerowe DNA w plazmidzie, chimerowego wirusa pochodzącego z chimerowego klonu DNA, polipeptydowe produkty wytwarzane z DNA opisanego niniejszym itp. Przedmiotem wynalazku jest zatem zastosowanie szczepionki według wynalazku do wytwarzania leku do ochrony świni przed infekcją wirusową lub wielonarządowym poodsadzeniowym zespołem wyniszczającym u świń (PMWS) wywoływanym przez PCV2, przy czym lek jest przeznaczony do podawania świni potrzebującej takiej ochrony w immunologicznie skutecznej ilości. W korzystnej postaci wykonania lek otrzymany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku dostarcza świni chimerową cząsteczkę kwasu nukleinowego lub żywego chimerowego cirkowirusa świni. Również korzystnie, lek otrzymany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku jest przeznaczony do podawania parenteralnego, donosowego, śródskórnego, przezskórnego, domięśniowo lub do układu limfatycznego. W kolejnym aspekcie wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania zakaźnej, chimerowej cząsteczki kwasu nukleinowego PCV1-2 według wynalazku, który obejmuje usuwanie genu otwartej ramki odczytu 2 (ORF2) cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej zakaźny, niepatogenny PCV1; zastąpienie pozycji genu ORF2 PCV1 genem immunogennej ORF2 z patogennego PCV2; oraz odzyskanie chimerowej cząsteczki kwasu nukleinowego. Korzystnie gen ORF2 PCV2 stosowany w sposobie według wynalazku jest otrzymany z molekularnej cząsteczki kwasu nukleinowego PCV2 zawartej w wektorze ekspresyjnym zdeponowanym dla celów patentowych pod numerem ATCC PTA-3913. Przedmiotem wynalazku jest także zakaźna odwrotna chimerowa cząsteczka kwasu nukleinowego PCV2-1 objemująca cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą zakaźny, patogenny PCV2, który posiada gen immunogennej ORF2 z niepatogennego PCV1 w miejscu genu ORF2 cząsteczki kwasu nukleinowego PCV2. Niniejszym opisany został także zakaźny molekularny DNA PCV2 i odpowiadające chimerowe klony DNA PCV, które znajdą zastosowanie jako modele eksperymentalne w otrzymywaniu lub charakteryzowaniu nowych awirulentnych szczepionek wirusowych.

8 PL 214 803 B1 Krótki opis rysunków Fig. 1 przedstawia konstrukcję zakaźnego molekularnego klonu DNA PCV2. Względne pozycje par starterów używanych do amplifikacji całkowitego genomu PCV2 są wskazane strzałkami (starter dolny PCVSAC2, starter górny PCVSAC2). Genomowe DNA PCV2 amplifikowane w PCR jest trawione enzymem restrykcyjnym SacII i oczyszczane. Oczyszczone i strawione SacII genomowe DNA jest łączone w celu utworzenia konkatamerów. Połączone konkatamery są rozdzielane przez elektroforezę żelową, tandemowy dimer genomu PCV2 jest oczyszczany i klonowany w wektorze psk, który wcześniej jest strawiony enzymem SacII, aby otrzymać molekularny klon DNA PCV2. Fig. 2A i 2B pokazują, że sklonowane plazmidowe DNA PCV2 jest zakaźne, gdy transfekowane in vitro do komórek PK-15. Fig. 2A przedstawia wykrywanie antygenu PCV2 przez oznaczenie immunofluorescencyjne (IFA) w komórkach PK-15 transfekowanych plazmidowym DNA ze sklonowanym PCV2. Intensywne znakowanie immunologiczne antygenu PCV2 jest uwidocznione w jądrze, i w mniejszym stopniu, cytoplazmie transfekowanych komórek. Fig. 2B przedstawia kontrolnie transfekowane ujemnie komórki PK-15. Fig. 3A przedstawia płuca świni zakażonej drogą wewnątrz-limfatyczną DNA PCV2 w 21 dni po inokulacji (DPI). Płuca są gumowate, nie zapadają się, i są cętkowane jasnobrązowo-czerwone. Węzły limfatyczne oskrzelowe są znacznie powiększone i jasnobrązowe (strzałki). Fig. 3B przedstawia przekrój mikroskopowy pawidłowego płuca ze świni kontrolnej (25X). Fig. 3C przedstawia przekrój mikroskopowy płuca ze świni z Fig. 3A. Należy zauważyć wokół-oskrzelowe limfocystolityczne zapalenie tkanki i łagodne nekrotyczne zapalenie oskrzelików (25X). Fig. 3D przedstawia barwienie immunohistochemiczne płuca z Fig. 3A. Należy zauważyć antygen PCV2 w makrofagach (strzałki) i komórki podobne do fibroblastów (końcówki strzałek) wokół dróg oddechowych (64X). Fig. 4A przedstawia prawiłdowy węzeł limfatyczny ze świni kontrolnej. Należy zauważyć dobrze wyodrębnione pęcherzyki limfatyczne (strzałki) (25X). Fig. 4B przedstawia przekrój mikroskopowy węzła limfatycznego tchawiczno-oskrzelowego ze świni z Fig. 3A zakażonej 21 dni wcześniej drogą wewnątrz-limfatyczną sklonowanym genomowym DNA PCV2. Pęcherzyki limfatyczne są słabo wyodrębnione, jest tu słaby do średniego zanik tkanki limfatycznej, i słabe wieloogniskowe zapalenie ziarniniakowate (25X). Fig. 4C przedstawia przekrój mikroskopowy węzła limfatycznego z Fig. 4B w większym powiększeniu skupionym na jednym pęcherzyku. Należy zauważyć słabo wyodrębniony pęcherzyk z makrofagami i komórkami olbrzymimi (strzałka) zastępującymi limfocyty pęcherzykowe (64X). Fig. 4D przedstawia wyniki wykrywania immunohistochemicznego antygenu PCV2 w tym samym węźle limfatycznym, co na Fig. 4B w makrofagach (strzałki) i komórkach olbrzymich (małe końcówki strzałek), i komórkach podobnych do dendrytycznych (duże końcówki strzałek) w pęcherzykach (64X). Fig. 5 przedstawia konstrukcję chimerowego klonu DNA PCV1-2 (PCV1/PCV2) z niepatogennym genomem PCV1 zawierającym immunogenną ORF2 genu białka kapsydu patogennego PCV2. Dimeryzowany klon DNA jest stosowany do transfekcji in vitro komórek PK-15 w celu wytworzenia żywych wirusów chimerowych produkujących białko ORF 2 PCV2, i eksperymentów in vivo na zwierzętach do potwierdzenia aktywności. Fig. 6 przedstawia konstrukcję i organizację zakaźnych molekularnych klonów DNA PCV1, PCV2, chimerowego PCV1-2 i odpowiadającego chimerowego PCV2-1. Klon DNA PCV2 jest skonstruowany przez połączenie dwóch pełnej długości liniowych genomów PCV2 tandemowo w wektorze Bluescript SK (psk) z użyciem ogólnych metod opisanych uprzednio (M. Fenaux i wsp., 2002, op. cit.). Klon DNA PCV1 jest skonstruowany przez połączenie dwóch pełnej długości liniowych genomów PCV1 tandemowo w wektorze psk. Chimerowy klon PCV1-2 DNA jest skonstruowany przez zastąpienie ORF 2 genu białka kapsydu PCV1 przez ten z PCV2 w szkielecie genomowym niepatogennego PCV1 w wektorze psk. Odpowiadający chimerowy klon DNA PCV2-1 DNA jest skonstruowany przez zastąpienie ORF 2 genu białka kapsydu patogennego PCV2 przez jego odpowiednik z niepatogennego PCV1 w szkielecie genomowym patogennnego PCV2 w wektorze psk. Oba klony chimerowe są dimerami w wektorze psk. Strzałki przedstawiają odpowiednie położenia starterów PCR do wykrywania wiremii PCV1, PCV2, PCV1-2 i PCV2-1 w inokulowanych zwierzętach. Fig. 7A-7J pokazują, że klony DNA PCV1, PCV2, chimerowego PCV1-2 i odpowiadającego chimerowego PCV2-1 są zakaźne i wytwarzają odpowiednie antygeny wirusowe, gdy zostaną transfekowane in vitro do komórek PK-15. Lewa część (7A, 7C, 7E, 7G i 7I) jest barwiona przeciwciałem monoklonalnym przeciwko ORF2 PCV1. Prawa część (7B, 7D, 7F, 7H i 7J) jest barwiona przeciwciałem przeciwko PCV2. Części 7A i 7B to transfekowane kontrolnie ujemnie komórki PK-15. Części 7C i 7D to komórki PK-15 transfekowane klonem DNA PCV1. Części 7I i 7F to komórki PK-15 transfeko-

PL 214 803 B1 9 wane klonem DNA PCV2. Części 7G i 7H to komórki PK-15 transfekowane chimerowym klonem DNA PCV1-2. Części 71 i 7J to komórki PK-15 transfekowane odpowiadającym chimerowym klonem DNA PCV2-1. Fig. 8 przedstawia pełnej długości sekwencję DNA sklonowanego molekularnego DNA PCV2 (która odpowiada Sekw. nr Id: 1). Fig. 9 przedstawia pełnej długości sekwencję DNA sklonowanego chimerowego DNA PCV1-2 (która odpowiada Sekw. nr Id: 2). Fig. 10 przedstawia sekwencję DNA ORF 2 genu immunogennego białka kapsydu sklonowanego chimerowego DNA PCV1-2 (która odpowiada Sekw. nr Id: 3). Fig. 11 przedstawia przypuszczalną translację do aminokwasów genu immunogennego białka kapsydu chimerowego DNA PCV1-2 (która odpowiada Sekw. nr Id: 4). Szczegółowy opis wynalazku Wynalazek dotyczy zakaźnych molekularnych i chimerowych cząsteczek kwasu nukleinowego cirkowirusa świni (PCV), żywych chimerowych wirusów wytwarzanych z chimerowej cząsteczki kwasu nukleinowego oraz szczepionki weterynaryjnej do ochrony świń przed zakażeniem wirusowym lub wielonarządowym poodsadzeniowym zespołem wyniszczającym u świń (PMWS), powodowanym przez PCV2. Niniejszym opisano immunogenne polipeptydowe produkty ekspresji, które mogą być wykorzystywane jako szczepionki. Niezjadliwa, zakaźna chimerowa cząsteczka DNA PCV (PCV1-2) obejmuje cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą zakaźny, niepatogenny PCV1, który w miejscu genu ORF w genomie PCV1 zawiera gen immunogennej otwartej ramki odczytu (ORF) patogennego PCV2. Zakaźny, chimerowy klon DNA PCV1-2 DNA zawiera gen immunogennego białka kapsydu (ORF2) DNA PCV2 sklonowany w szkielecie genomowym zakaźnego, niepatogennego klonu DNA PCVI. Ogólnie, gen białka kapsydu DNA PCV2 zastępuje gen ORF2 w DNA PCV1 w strukturze genomowej niepatogennego PCV1, lecz różnorodne warianty pozycyjne mogą być konstruowane metodami inżynierii genetycznej w celu otrzymania innych niezjadliwych lub atenuowanych chimerowych klonów DNA. Odwrotny chimerowy zakaźny klon DNA PCV2-1 pomiędzy PCV1 i PCV2 jest ujawniony jako kontrola do analizowania chimerowego klonu PCV1-2 według wynalazku i jest skonstruowany przez zastąpienie genu białka kapsydu PCV2 przez ten z PCV1 w szkielecie zakaźnego klonu DNA patogennego PCV2. Oprócz tego, że jest modelem doświadczalnym, odwrotny chimerowy klon DNA PCV2-1 DNA może znaleźć zastosowanie w przygotowywaniu specjalnie zaprojektowanych szczepionek. Wykazano, że sklonowane genomowe DNA PCV2 opisane niniejszym jest zakaźne in vitro i in vivo, kiedy jest transfekowane do komórek PK-15 i podawane świniom. Zakaźny klon DNA PCV2 powoduje patologiczne uszkodzenia charakterystyczne dla PMWS u świń umożliwiając ulepszoną charakteryzację choroby klinicznej i zrozumienie rozmieszczenia wirusa w komórkach tkanek. Ten nowy, łatwy do namnażania czynnik patogenny przyczynia się do rozwoju odpowiedniego programu szczepień do zapobiegania PMWS u świń. Nowy chimerowy klon DNA PCV1-2 jest zakaźny zarówno przez transfekcję in vitro komórek PK-15 jak i podanie in vivo świniom. W transfekowanych komórkach PK-15 chimerowy klon DNA PCV1-2 wytwarza antygen białka kapsydu PCV2 (immunogenne białko kapsydu PCV2), podczas gdy odpowiadający chimerowy klon DNA PCV2-1 wytwarza antygen białka kapsydu PCV1, jak wykazano w oznaczeniu immunofluorescencyjnym (IFA) z użyciem przeciwciał specyficznych wobec antygenu białka kapsydu PCV1 lub PCV2. Konwersja serologiczna do przeciwciała specyficznego wobec PCV2 jest wykrywana u świń szczepionych zakaźnym klonem PCV2, jak również chimerowym klonem PCV1-2. Wykrywanie konwersji serologicznej do przeciwciała specyficznego wobec PCV2 oznacza, że chimerowy klon DNA PCV1-2 wywołuje powstawanie przeciwciała specyficznego wobec PCV2 w infekowanych świniach i, w następstwie, przyczynia się do ochrony szczepionych świń przez zakażeniem PCV2. Poniższe przykłady opisują ocenę immunogenności i patogenności chimerowych klonów DNA w szczepionych świniach bardziej szczegółowo. Zasadniczo, konwersje serologiczne do przeciwciał przeciwko antygenowi ORF2 PCV2 są wykrywane u świń szczepionych klonem DNA PCV2 (Grupa 3) i chimerowym Klonem DNA PCV1-2 (Grupa 4). Wszystkie świnie szczepione klonem PCV1 i odpowiadającym klonem DNA PCV2-1 (Grupy 2 i 5, odpowiednio) ulegają konwersji serologicznej do przeciwciała przeciwko PCV1. Wirusy otrzymane z wybranych świń w każdej grupie są częściowo sekwencjonowane i potwierdzono, że są to autentyczne odpowiednie zakaźne klony DNA używane do szczepienia. Ogólne i mikroskopowe uszkodzenia w różnych tkankach zwierząt szczepionych klonem DNA

10 PL 214 803 B1 PCV2 są znacząco cięższe niż te u świń szczepionych klonami DNA PCV1, chimerowego PCV1-2 i odpowiadającego chimerowego PCV2-1. Nieoczekiwanie i korzystnie, chimerowy zakaźny klon DNA PCV1-2 posiadający immunogenny gen białka kapsydu (ORF2) z patogennego PCV2 sklonowany w szkielecie genomowym niepatogennego PCV1 wywołuje specyficzną odpowiedź humoralną wobec antygenu białka kapsydu patogennego PCV2, podczas gdy wyjątkowo zachowuje on niepatogenne właściwości PCV1 u świń. Zwierzęta szczepione chimerowym zakaźnym klonem DNA PCV1-2 przechodzą łagodne zakażenie przypominające to u zwierząt szczepionych PCV1, podczas gdy ulegają konwersji serologicznej do przeciwciała przeciwko białku ORF2 kapsydu patogennego PCV2. Przeciętna długość wiremii obserwowana u zwierząt szczepionych PCV1 i chimerowym PCV1-2 jest krótsza, odpowiednio 0,625 tygodnia i 1 tydzień, niż ta u zwierząt szczepionych patogennym PCV2, która wynosi około 2,12 tygodnia. Brak wykrywalnej wiremii chimerowego PCV1-2 u niektórych szczepionych zwierząt nie wpływa na konwersję serologiczną do przeciwciała przeciwko białku kapsydu ORF2 PCV2 u świń szczepionych PCV1-2 (Grupa 4). Wyniki te wskazują, że nawet jeśli wiremia chimerowego PCV1-2 jest krótka lub niewykrywalna u niektórych szczepionych zwierząt, chimerowy wirus PCV1-2 jest zdolny do wywołania odpowiedzi humoralnej przeciwko białku kapsydu ORF2 PCV2. Szczególna zdolność chimerowego zakaźnego klonu DNA PCV1-2 do wywołania odpowiedzi immunologicznej specyficznej wobec immunogennego białka kapsydu ORF 2 patogennego PCV2 przy pozostaniu niepatogennym dla świń czyni chimerowy klon PCV1-2 szczególnie użytecznym jako genetycznie zmodyfikowaną żywą, atenuowaną szczepionkę oraz jako inne typy szczepionek. Nowe, oczyszczone i izolowane cząsteczki kwasów nukleinowych według wynalazku obejmują pełnej długości sekwencję DNA sklonowanego chimerowego DNA PCV1-2 ujawnioną w Sekw. nr Id: 2, przedstawioną na Fig. 9 i zdeponowaną w American Type Culture Collection (ATCC) pod depozytowym numerem dostępu PTA-3912; jej nić komplementarna (tzn. odwrócone i przeciwstawne pary zasad) lub sekwencje nukleotydowe posiadające przynajmniej 95% homologii do chimerowej sekwencji nukleotydowej (tzn., znaczącą aktywną część całego genu). Typowe metody, które są dobrze znane w dziedzinie mogą być używane do przygotowania nici komplementarnych lub sekwencji nukleotydowych o wysokiej homologii, na przykład, przez uznawane w dziedzinie standardowe lub wysoko specyficzne techniki hybrydyzacyjne. Oczyszczona i izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego obejmująca sekwencję DNA genu immunogennego białka kapsydu sklonowanego chimerowego DNA PCV1-2 jest również ujawniona w Sekw. nr Id: 3 i na Fig. 10. Odpowiednie komórki zawierające cząsteczkę chimerowego kwasu nukleinowego specyficznie wytwarzają żywe, zakaźne chimerowe cirkowirusy świni. Żywy, zakaźny chimerowy wirus jest otrzymywany z chimerowego klonu DNA przez transfekcję komórek PK-15 przez transfekcje in vitro i in vivo jak pokazano niniejszym. Korzystnym przykładem sklonowanego chimerowego DNA PCVl-2 jest sekwencja nukleotydowa przedstawiona w Sekw. nr Id: 2 i na Fig. 9. Wynalazek ponadto przewiduje, że chimerowy wirus jest otrzymywany z nici komplementarnej lub sekwencji nukleotydowych posiadających wysoką homologię, przynajmniej 95% homologii, do chimerowej sekwencji nukleotydowej. Również zawarte w zakresie niniejszego wynalazku są biologicznie funkcjonalne plazmidy, wektory wirusowe i im podobne, które zawierają nowe rekombinowane cząsteczki kwasów nukleinowych opisane niniejszym, odpowiednie komórki gospodarza transfekowane wektorami zawierającymi chimerowe i molekularne klony DNA oraz immunogenne polipeptydowe produkty ekspresji. Niniejszym opisano immunogenne białko posiadające sekwencję aminokwasową ujawnioną w Sekw. nr Id: 4 i na Fig. 11. Osoba o przeciętnych umiejętnościach w dziedzinie będzie wiedzieć bez nadmiernego wysiłku, jak zmodyfikować, zamieniać, usuwać itp., aminokwas(y) z sekwencji polipeptydu i wytwarzać biologicznie aktywne warianty, które zachowują taką samą, albo zasadniczo taką samą, aktywność jak sekwencja wyjściowa. Sposób wytwarzania immunogennych produktów polipeptydowych według niniejszego wynalazku może obejmować następujące etapy: wzrost, w odpowiednich warunkach odżywczych, prokariotycznych lub eukariotycznych komórek gospodarza transfekowanych cząsteczkami nowych rekombinowanych kwasów nukleinowych opisanych niniejszym, w sposób umożliwiający wytwarzanie produktów polipeptydowych oraz izolację pożądanych produktów polipeptydowych ekspresji cząsteczek kwasów nukleinowych standardowymi metodami znanymi w dziedzinie. Immunogenne białka mogą być przygotowywane innymi metodami, takimi jak, na przykład, synteza biochemiczna i podobne. Szczepionki z chimerowych wirusowych i molekularnych klonów DNA oraz ich zastosowanie są również objęte zakresem niniejszego wynalazku. Szczepione świnie są chronione przed poważnym

PL 214 803 B1 11 zakażeniem wirusowym i PMWS wywoływanym przez PCV2. Ten nowy sposób chroni świnie wymagające ochrony przed zakażeniem wirusowym lub PMWS przez podanie świni immunologicznie skutecznej ilości szczepionki, takiej jak, na przykład, szczepionka zawierająca immunogenną ilość chimerowego DNA PCV1-2, sklonowany chimerowy wirus, wektor plazmidowy lub wirusowy zawierający chimerowe DNA PCV1-2, polipeptydowe produkty ekspresji, rekombinowane DNA PCV2, itp. Inne antygeny takie jak PRRSV, PPV, inne czynniki zakaźne świń i środki immunologicznie stymulujące mogą być podawane świni równocześnie, aby dostarczyć szerokiego zakresu ochrony przed zakażeniami wirusowymi. Szczepionki zawierają, na przykład, zakaźny chimerowy DNA PCV1-2, sklonowany DNA chimerowego genomu PCV w odpowiednich plazmidach lub wektorach takich jak, na przykład, wektor psk, niezjadliwy żywy chimerowy wirus, inaktywowany chimerowy wirus, itp. w kombinacji z nietoksycznym, dopuszczalnym fizjologicznie nośnikiem oraz, ewentualnie, jednym lub więcej adiuwantem. Szczepionka może również zawierać zakaźny molekularny klon DNA PCV2 opisany niniejszym. Zakaźny chimerowy DNA PCV1-2, DNA plazmidowy zawierający zakaźny chimerowy genom wirusowy i żywy chimerowy wirus są korzystniejsze, a żywy chimerowy wirus jest najbardziej korzystny. Niezjadliwa, żywa szczepionka wirusowa według wynalazku posiada przewagę nad tradycyjnymi szczepionkami wirusowymi, które wykorzystują albo atenuowane, żywe wirusy, które przedstawiają ryzyko powrotu do stanu zjadliwego lub zabitego całego wirusa namnażanego w hodowli komórkowej, który może nie wywołać wystarczającej humoralnej odpowiedzi immunologicznej do ochrony przed chorobą wirusową. Adiuwant, który może być podawany w kombinacji ze szczepionką według niniejszego wynalazku, jest substancją, która zwiększa odpowiedź immunologiczną świni na szczepionkę. Adiuwant może być podawany w tym samym czasie i w tym samym miejscu co szczepionka, lub w innym czasie, na przykład, jako dawka wzmagająca odpowiedź immunologiczną. Adiuwanty również mogą korzystnie być podawane świni w sposób lub w miejscu innym niż sposób lub miejsce, w którym jest podawana szczepionka. Odpowiednie adiuwanty obejmują, ale bez ograniczeń, wodorotlenek glinu (alum), kompleksy immunostymulujące (ISCOMS), niejonowe polimery blokowe lub kopolimery, cytokiny (takie, jak IL-1, IL-2, IL-7, IFN-, IFN-β, IFN-, itp.), saponiny, monofosforan lipidu A (MLA), dipeptydy muramylowe (MDP) i podobne. Inne odpowiednie adiuwanty obejmują, na przykład, siarczan glinowo- -potasowy, ciepło-wrażliwą lub ciepło-trwałą enterotoksynę izolowaną z Escherichia coli, toksynę cholery lub jej podjednostkę B, toksynę błoniczą, toksynę tężcową, toksynę krztuśca, niekompletny lub kompletny adiuwant Freunda itp. Adiuwanty oparte na toksynach, takich jak toksyna błonicza, toksyna tężcowa, toksyna krztuśca, mogą być inaktywowane przed użyciem, na przykład, przez działanie formaldehydem. Szczepionki mogą ponadto zawierać dodatkowe antygeny w celu podnoszenia aktywności immunologicznej zakaźnych chimerowych klonów DNA PCV, takie jak, na przykład, wirus zespołu reprodukcyjno-oddechowego świń (PRRSV), parwowirus świni (PPV), inne czynniki zakaźne świni i środki stymulujące immunologicznie. Szczepionki według wynalazku nie są ograniczone do żadnego szczególnego typu lub sposobu przygotowania. Sklonowane szczepionki wirusowe obejmują, lecz nie są ograniczone do zakaźnych szczepionek DNA (tzn., wykorzystania plazmidów, wektorów lub innych typowych nośników do bezpośredniego wstrzyknięcia DNA do świń), żywych szczepionek, modyfikowanych żywych szczepionek, inaktywowanych szczepionek, podjednostkowych szczepionek, atenuowanych szczepionek, szczepionek modyfikowanych przez inżynierię genetyczną, itp. Te szczepionki są przygotowywane standardowymi sposobami znanymi w dziedzinie. Żywa wirusowa szczepionka jest na ogół najbardziej pożądaną szczepionką, ponieważ są pobudzane wszystkie możliwe odpowiedzi immunologiczne u przyjmującego szczepionkę, włączając odpowiedzi immunologiczne: ogólnoustrojową, miejscową, humoralną i za pośrednictwem komórek. Zabita szczepionka, z drugiej strony, może wywołać wyłącznie immunologiczną odpowiedź humoralną. Aczkolwiek najbardziej pożądane, żywe wirusowe szczepionki mają jednakże szereg wad, takich jak potencjalne ryzyko zanieczyszczenia żywym przypadkowym wirusem lub ryzyko, że wirus może powrócić do zjadliwości podczas stosowania. Znaczące jest, że wyjątkowy chimerowy DNA PCV1-2 według niniejszego wynalazku przezwycięża te trudności. Wykorzystując wyłącznie geny immunogenne z patogennego PCV2, chimerowe konstrukcje DNA, żywy, replikujący się wirus, który jest niepatogenny, wywołuje jednak całkowite, korzystne odpowiedzi immunologiczne dla żywych szczepionek wirusowych przeciwko patogennemu wirusowi PCV2. Żywa szczepionka wirusowa oparta o żywego