Nowe sposoby wykrywania patogenów w populacji świń: tańsze, lepsze i łatwiejsze

Transkrypt

1 1 Nowe sposoby wykrywania patogenów w populacji świń: tańsze, lepsze i łatwiejsze WSTĘP J Zimmerman, J Prickett, J Johnson Department of Veterinary Diagnostic and Production Animal Medicine, College of Veterinary Medicine, Iowa State University, Ames, Iowa Płyn, obecny w jamie ustnej, składa się ze śliny i przesięku błony śluzowej jamy ustnej. Ślina wydzielana jest przez gruczoły ślinowe (ślinianki), natomiast przesięk przedostaje się przez śluzówkę z naczyń włosowatych do ust. W płynach ustnych obecne są patogenny, a także przeciwciała pochodzące z surowicy i produkowane przez tkanki jamy ustnej. W 1909 roku Pollaci i Ceraulo wykazali, że płyn ustny pobrany od pacjenta ze zdiagnozowaną gorączką maltańską (bruceloza) zdolny jest do czułej i specyficznej aglutynacji z Brucella melitensis. Dopiero później w płynie ustnym wykryto obecność przeciwciał (IgA, IgM, IgG) pochodzenia ogólnego jak i miejscowego. Pozwaliło to na zastosowanie go jako materiału diagnostycznego. Ostatecznie rozwój diagnostyki płynów ustnych w medycynie ludzkiej ugruntowany został oraz upowszechnił się w momencie izolacji wirusa HIV od pacjenta chorego na AIDS (Groopman i wsp., 1984). Obecnie, w ludzkiej medycynie diagnostycznej wykorzystuje się próbki płynu ustnego do wykrywania różnorodnych czynników infekcyjnych, hormonów, toksyn i leków (Streckfus i Bigler, 2002; Tabak, 2001, 2007). W badaniach kontrolnych chorób zakaźnych użycie płynu ustnego jako materiału diagnostycznego, pozwala zgromadzić niskim kosztem dużą liczbę próbek: w Departamencie Zdrowia i Higieny Psychicznej Miasta Nowy York (New York City Department of Health and Mental Hygiene). Testem tym przebadano w kierunku obecności przeciwciał dla wirusa HIV próbek płynu uzyskanych z 10 klinik typu walk-in (otwarte dla wszystkich). Próbki te zebrano w okresie marzec maj 2008 (Rothman i Kalish, 2009). W Wielkiej Brytanii pobrano w domach próbki od dzieci i przesłano do laboratorium w celu okreslenia miana przeciwciał (Bartington et al., 2009). Główne wnioski z prac dotyczących wykrywania przeciwciał i patogenów w płynie z jamy ustnej zwierząt domowych wykazują podobieństwo do konkluzji zawartych w publikacjach poświęconych człowiekowi. Badanie płynu ustnego oferuje możliwość łatwego i regularnego zbierania danych dotyczących statusu zdrowotnego stada. Łączenie informacji o chorobach uzyskanych z badań przeglądowych z dokumentacją stada (zabiegi, zachorowalność, śmiertelność, parametry produkcji) zapewniłoby (1) właściwie synchronizowanie i ukierunkowanie zabiegów; (2) rzeczywistą ( real time ) ocenę zabiegów; i (3) udoskonaloną ocenę zabiegów, zależną od stada ocenę wpływu określonych patogenów na zdrowie i produktywność świń. To pro aktywne podejście do monitorowania chorób ukierunkowane jest na polepszanie wydajności między innymi przez ograniczenie kosztów próbkobrania. Nasze laboratorium (Iowa State University) pracuje nad wykorzystaniem zasad diagnostyki, pierwotnie opracowanej w medycynie ludzkiej, do nadzoru opisanych poniżej patogenów świń. 1

2 2 BADANIA NA ŚWINIACH Wykrywanie PRRSV w płynie jamy ustnej pobranym od eksperymentalnie zainfekowanych świń (projekt finansowany przez Narodowa Radę Producentów Świń Stanów Zjednoczonych US National Pork Board). Celem badań było (1) określenie obecności PRRSV lub przeciwciał dla wirusa PRRS (PRRSV) w płynach z jamy ustnej (2) określenie czasu przetrwania i półtrwania, odpowiednio PRRSV i przeciwciał dla PRRSV i/lub określenie ich miana. Plan doświadczenia: Zbadano trzy grupy wiekowe (4-, 8- i 12-tygodniowe świnie). W regularnych odstępach czasu na przestrzeni 63 dni po inokulacji (DPI days post inoculation) pobrano próbki płynu ustnego oraz surowicy. Po zakończeniu okresu obserwacji, losowe próbki zbadano metodą ilościową PCR (qrt-pcr) na obecność wirusa PRRS oraz metodą ELISA i metodą immunofluorescencji pośredniej (IFA) na występowanie przeciwciał dla PRRSV. Wyniki: Po analizie danych wykazano (1) Brak znaczących różnic w występowaniu wirusa lub przeciwciał w zależności od wieku; (2) Poziom miana PRRSV w płynie ustnym z czasem dostosował się do poziomu w surowicy (Ryc. 1); (3) >75% próbek płynu z jamy ustnej świń w 28 dniu od zainfekowania PRRSV w teście PCR było dodatnich; (4) Przy użyciu komercyjnie dostępnego testu PRRS ELISA wykryto przy niskiej wartości S/P (surowica badana/pozytywna kontrola) przeciwciała specyficzne dla PRRSV. Wnioski: Przy użyciu metody PCR bez trudu wykryto wirusa PRRS w płynie ustnym. Obecne były również przeciwciała dla PRRSV. Niemniej jednak aktualny, komercyjny test PRRS ELISA nie został wystarczająco zoptymalizowany by wiarygodnie wykryć niski poziom przeciwciał w płynie z jamy ustnej. Więcej informacji na powyższy temat znajduje się w artykule Prickett i wsp. (2008a). Wykrywanie PRRSV i PCV2 w próbkach płynu z jamy ustnej (projekt finansowany przez wyżej wymieniona instytucję). Celem badań była uprawomocnienie nadzoru z wykorzystaniem płynu ustnego w powszechnych ustaleniach produkcji. Plan doświadczenia: Badania zostały przeprowadzone w 3 miejscach w końcowym stadium produkcyjnym. Każdy kojec zajmowany był przez około 25 świń, od których w czasie infekcji PRRSV wielokrotnie pobierano próbki płynu ustnego i surowicy. W okresie 13 tygodni pobrano 5 krotnie próbki. Losowe próbki badano metodą qpt-pcr i testem IFA na obecność odpowiednio PRRSV oraz specyficznych przeciwciał dla PRRSV. Dodatkowo, metodą PCR badano obecność cirkowirusa typu 2 (PCV2). Wyniki: Jak zaobserwowano w warunkach doświadczalnych, (1) miana PRRSV (qrt-pcr) w surowicy i płynie z jamy ustnej były dodatnio skorelowane; (2) Odnośnie do statusu zdrowotnego kojców wyniki jakościowe (poz/neg) między surowicą i płynem ustnym wykazały dobrą zgodność; (3) W próbkach płynu ustnego wykryto specyficzne przeciwciała dla PRRSV; (4) Również obecny był wirus PCV2 (qrt-pcr). Wnioski: W próbkach płynu z jamy ustnej zakażonych świń (prosięta, warchlaki lub tuczniki) można metodą PCR wykryć materiał genetyczny PRRSV do okołó 4 tygodni. Przez co w programach stałego nadzoru płyn ustny powinien być pobierany co 2-4 tygodnie. Badając próbki terenowe metoda PCR specyficzną dla PCV2 stwierdzić można obecność danego wirusa. Wyniki sugerują, że próbki płynu ustnego świń z różnych kojców mogłyby zostać wykorzystane do monitoringu występowania PRRSV, PCV2 i być może innych patogenów w populacji trzody chlewnej. Więcej informacji na przedstawiony temat w artykule Prickett i wsp. (2008b). 2

3 3 Pobieranie próbek płynu z jamy ustnej świń z chlewni gospodarczych (od odsadzonych do tuczników) (projekt finansowany przez Murphy-Brown LLC, Pfizer Animal Health i Narodową Radę Producentów Świń Stanów Zjednoczonych). Celem badań było (1) określenie czy personel chlewni mógłby pobierać próbki płynu ustnego i (2) nadzorować krążenie wirusa PRRS, PCV2, wirusa grypy, wirusa przenoszonego drogą transfuzji (TTV) i nowo odkrytego pestiwirusa świń w stadach (Pogranichniy i wsp., 2008). Plan doświadczenia: Personel 10 chlewni ze Środkowego Zachodu pobrał próbki płynu ustnego zwierząt z 6 kojców każdej z placówek. Próbki pobrano w 2-tygodniowych odstępach czasu od odsadzenia do przekazania świń do uboju: Personel pobrał i dostarczył próbki według harmonogramu do ISU VDL (Iowa State University, Veterinary Diagnostic Laboratory Uniwersytet Stanu Iowa, Weterynaryjne Laboratorium Diagnostyczne) próbki o dobrej jakości. Próbki przebadano metodą PCR w kierunku PRRSV, PCV2 i grypy. Badania na wykrywanie TTV i pestiwirusa nadal trwają. Wnioski: Choć badania i analiza są w toku, na bieżąco uzyskiwane wyniki wykazują, że personel dużej placówki może skutecznie gromadzić, przetwarzać i przekazywać próbki płynu z jamy ustnej o dobrej jakości. Ogólnie rzecz biorąc, wyniki testu PCR dowiodły, że krążenie patogenów (PRRSV, PCV2, wirusa grypy i TTV) w rosnącej populacji trzody chlewnej może być śledzone za pomocą próbek płynu ustnego. PODSUMOWANIE I WNIOSKI Przeprowadzone badania na próbkach płynu ustnego świń koncentrują się na wykrywaniu w populacji trzody chlewnej odpowiednimi metodami PCR, takich drobnoustrojów jak: PRRSV, PCV2 i wirusa grypy. Badania będące w toku rozszerzą dany zakres patogenów o, TTV, nowo opisany pestiwirus (Pogranichniy i wsp., 2008) i inne. Obiecujące badania (niepublikowane) sugerują, że nowe i/lub ulepszone testy diagnostyczne do wykrywania swoistych przeciwciał dla patogenów, np. PRRSV, PCV2, dostępne będą w przyszłym roku. Będzie to miało miejsce zwłaszcza, gdy dostępne staną się testy oparte na przeciwciałach, monitoring populacji świń z wykorzystaniem płynu z jamy ustnej zapewni mniejsze koszty w programach kontroli/eliminacji, redukcję jego negatywnych stron, przestrzeganie terminów szczepień, monitorowanie ekspozycji świń na działanie czynników patogennych oraz kontrolę efektywności szczepień oraz prowadzenia badań epidemiologicznych. UZUPEŁNIENIE DOTYCZĄCE POBIERANIA PRÓBEK PŁYNU Z JAMY USTNEJ Jak pobierać próbki płynu ustnego Zawiesić kawałek sznura bawełnianego w łatwo dostępnym dla świń miejscu. Sznur bawełniany, w porównaniu ze sznurem zrobionym z włókien syntetycznych, jest bardziej chłonny. W przypadku prosiąt użyć sznura o średnicy około 13 mm, do starszych zwierząt wykorzystać sznura o średnicy około 16 mm. Sznur należy zawiesić na łatwych do zrobienia wspornikach z otworami o średnicy 25,4 mm. Przeciągnąć sznur przez otwór, a następnie zawiązać węzeł w celu zabezpieczenia go podczas pobierania próbek. Sznur umieścić w czystym obszarze kojca, z dala od wody i paszy. Zawiesić go na wysokości świni. Uzyskanie próbki płynu ustnego następuje w wyniku żucia sznura przez świnię. W większości przypadków, wystarczający czas próbkobrania wynosi od 10 do 20 minut. Wytyczne dotyczące przechowywania i postępowania z próbkami płynu ustnego 3

4 4 Sznur nasączony śliną przesłać do badania w schłodzonym termosie w celu zachowania integralności próbki. Próbka może zostać zamrożona. Próbki płynu ustnego przekazywane w dniu pobrania mogą być jedynie schłodzone. Przygotowanie próbek i obchodzenie się z nimi w trakcie transportu do laboratorium jest podobne jak w przypadku próbek surowicy. Próbki z wkładami chłodniczymi i absorbantem (do przechwytywania wycieków) umieszczane są w izolowanych, szczelnych kontenerach transportowych pokrytych plastikową torbę. Interpretacja wyników laboratoryjnych Próbki płynu ustnego pobrane z danego kojca odzwierciedlają status zdrowotny świń w nim przebywających. Próbki płynu ustnego, które w metodzie PCR były dodatnie odzwierciedlają aktywne wydalania/krążenie patogenów w populacji. Negatywne wyniki nie oznaczają, że świnie nie są zakażone PRRSV lub nie miały styczności z wirusem. Przeciwciała dla PRRSV lub PCV2 z płynu ustnego są dostępne w niektórych laboratoriach diagnostycznych, np. Weterynaryjne Laboratorium Diagnostyczne Uniwersytetu Stanu Iowa. W zakresie interpretacji wyników należy postępować zgodnie z ogólnymi wytycznymi dotyczącymi interpretacji wyników. Zalecenia dotyczące pobierania próbek i ich przebadania Nie pulować próbek płyn ustnego. Konieczne jest stosowanie liny bawełnianej. Inne materiały, szczególnie materiały syntetyczne, nie mają chłonności bawełny. Czasami przy pierwszym próbkobraniu świnie niechętnie podchodzą do liny. Oporne świnie można przyzwyczaić przez rzucenie im liny do zabawy (usunąć po 20 minut) lub nasączenie lin szkoleniowych roztworem cukru. Po przyzwyczajeniu zwierzęcia do liny, czekają one do następnej okazji do zabawy. Próbki należy pobierać rano, gdy świnie są najbardziej aktywne. Unikać próbkobrania w godzinach popołudniowych. Brudne próbki wskazują, że lina jest zbyt długa lub zawieszona jest w złym miejscu. Świnie podchodzą do liny, ponieważ jest to coś nowego. Należy po każdym próbkobraniu usunąć wszystkie liny, aby utrzymać zainteresowanie zwierząt w kolejnych zbiorach płynu ustnego. Po użyciu liny należy ją wyrzucić, nie wykorzystywać jej ponownie. PIŚMIENNICTWO Bartington SE, Peckham C, Brown D, Joshi, H, Dezateux C Feasibility of collecting oral fluid samples in the home setting to determine seroprevalence of infections in a largescale cohort of preschool-aged children. Epidemiol Infect 137: Pogranichniy R, Schwartz K, Yoon K Isolation of a novel viral agent associated with porcine reproductive and neurological syndrome and reproduction of the disease. Vet Microbiol 131: Prickett J, Simer R, Christopher-Hennings, J, Yoon K-J, Evans RB, Zimmerman JJ. 2008a. Detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection in porcine oral fluid samples: a longitudinal study under experimental conditions. J Vet Diagn Invest 20: Prickett J, Simer R, Yoon K-J, Kim W-I, Zimmerman J. 2008b. Oral-fluid samples for surveillance of commercial growing pigs for porcine reproductive and respiratory syndrome virus and porcine circovirus type 2 infections. J Swine Health Prod 16(2):

5 5 Rothman RE, Kalish B Update on emerging infections: news from the Centers for Disease Control and Prevention. False-positive oral fluid rapid HIV tests--new York City, Ann Emerg Med 53: Streckfus CF, Bigler LR Saliva as a diagnostic fluid. Oral Dis 8: Tabak LA A revolution in biomedical assessment: the development of salivary diagnostics. J Dent Educ 65: Tabak LA Point-of-care diagnostics enter the mouth. Ann N Y Acad Sci 1098:7-14. Pollaci G and Ceraulo S Das agglutinationsvermögen einiger körperflüssigkeiten beim Mediterranfieber. Centralblatt für Bakteriologie, Parasitenkunde und Infektionskrankheiten (I). Abt Originale 52(2): Groopman J, Salahuddin S, Sarngadharan M, et al HTLV-III in saliva of people with AIDS-related complex and healthy homosexual men at risk for AIDS. Science 226: Hoffman P, Prickett J, Zimmerman J, Karriker L, Main R. March 8-11, Implementation and validation of swine oral fluid collection in a commercial system. 38th Annual Meeting of the American Association of Swine Veterinarians. San Diego, California, pp