KATEDRA BIOCHEMII Wydział Biologii i Ochrony Środowiska ANALIZA TŁUSZCZÓW WŁAŚCIWYCH CZ II ĆWICZENIE 8 ZADANIE 1 HYDROLIZA LIPIDÓW MLEKA ZA POMOCĄ LIPAZY TRZUSTKOWEJ Lipazy (EC 3.1) to enzymy należące do klasy hydrolaz, katalizujące reakcję hydrolizy wiązań estrowych występujących między glicerolem, a kwasami tłuszczowymi w tłuszczach prostych. Najważniejszym enzymem lipolitycznym przewodu pokarmowego człowieka jest lipaza trzustkowa (EC 3.1.1.3) Odszczepia ona kwasy tłuszczowe w pozycjach 1 i 3 w cząsteczce triacylogliceroli. Produktem działania lipazy trzustkowej są 2-acyloglicerole i wolne kwasy tłuszczowe. Aktywność lipazy wzrasta w obecności soli kwasów żółciowych, fosfolipidów i białka kolipazy. Istnieje szereg leków, zawierających skoncentrowane wyciągi z trzustki zwierzęcej, lub zestaw oczyszczonych różnych enzymów hydrolitycznych, które mają pomóc w trawieniu i przyswajaniu pokarmów. Jednym z takich leków jest Kreon. Jedna kapsułka Kreonu zawiera (oprócz innych hydrolaz) lipazę o aktywności 10 000 U. Aktywność lipazy trzustkowej określa się na podstawie ilości uwolnionych kwasów tłuszczowych w czasie działania enzymu, które w określonych odstępach czasu oznacza się przez miareczkowanie mianowanym roztworem KOH wobec fenoloftaleiny jako wskaźnika. WYKONANIE: 1. Do kolbki Erlenmeyera odmierzyć 15 ml 12% homogenizowanej słodkiej śmietanki i dodać 6 ml 0,7 M buforu fosforanowego o ph 7,7. 2. Zawartość kolbki dobrze wymieszać, a następnie kolbkę wstawić do łaźni wodnej o temperaturze 37 C i inkubować przez 5 minut. 3. W tym czasie opisać 5 kolbek stożkowych o pojemności 100 ml (0, 1, 2, 3, 4). Do każdej kolbki dodać po 5 ml skażonego etanolu. 4. Do kolbki ze śmietanką (substrat reakcji) wprowadzić 3 ml roztworu lipazy trzustkowej (nie wyjmując jej z łaźni!). 5. Kolbkę energicznie wymieszać i natychmiast pobrać 4 ml mieszaniny reakcyjnej do wcześniej przygotowanej kolbki stożkowej o pojemności 100 ml z etanolem (kolbka 1
0). Do kolbki dodać dodać kilka kropli fenoloftaleiny i roztwór miareczkować 0,05 M roztworem KOH do trwałego lekko różowego zabarwienia (próba zerowa). 6. W analogiczny sposób pobrać kolejne próby w ciągu 60 minut w odstępach 15- minutowych (łącznie 4 próby). 7. Z próbami postępować tak jak opisano w punkcie 5. Uwaga! Wszystkie próby miareczkować do barwy o takiej samej intensywności. 8. Uzyskane wyniki z miareczkowania zestawić w Tabeli 1: Tabela 1 Numer próby Czas, min Ilość KOH zużytego do miareczkowania próby, ml 0 0 1 15 2 30 3 45 4 60 Obliczyć: 1. Ilość roztworu KOH potrzebną do zobojętnienia kwasów tłuszczowych w próbkach (C). Od objętości zużytej do zobojętnienia badanej próbki (A) odjąć objętość KOH zużytą do obojętnienia próby ślepej (B). 2. Ilość uwolnionych kwasów tłuszczowych przy założeniu, że 1 ml 0,05 M KOH zobojętnia 50 μmoli kwasów tłuszczowych. Tabela 2 Numer probówki 1 2 3 4 Ilość KOH potrzebna do zobojętnienia kwasów tłuszczowych, ml (C) Ilość uwolnionych kwasów tłuszczowych, mol 3. Sporządzić wykres zależności ilości uwalnianych kwasów tłuszczowych od czasu inkubacji. 2
4. Wyznaczyć szybkość początkową (V 0 ) reakcji enzymatycznej. Wartość V 0 uzyskuje się przez wykreślenie linii prostej, stycznej do początkowego odcinka krzywej, zaczynając od czasu zerowego. Nachylenie tej prostej ma wartość V 0. 5. Obliczyć aktywność lipazy. Aktywność lipazy wyrazić w μmolach kwasów tłuszczowych uwolnionych w ciągu 1 minuty przez enzym zawarty w 1 kapsułce leku. Należy pamiętać że jedną kapsułkę leku rozpuszczono w 25 ml 0,7 M buforu fosforanowego o ph 7,7, a do doświadczenia poprano 3 ml tego roztworu. ZADANIE 2 ILOŚCIOWE OZNACZANIE CHOLESTEROLU METODĄ KOLORYMETRYCZNĄ Cholesterol jest najważniejszym sterolem zwierzęcym. Występuje we wszystkich komórkach zwierzęcych jako składnik błon biologicznych, z wyjątkiem błon mitochondrialnych, natomiast w cytoplazmie obecny jest w postaci estrów cholesterolu z kwasami tłuszczowymi. Najbogatsze w cholesterol są nadnercza i mózg.. Do ilościowego oznaczania cholesterolu wykorzystuje się reakcję Liebermanna-Burcharda. Cholesterol pod wpływem stężonego kwasu siarkowego i w obecności bezwodnika kwasu octowego tworzy kwas monosulfonowy bicholestadienu, charakteryzujący się zielonym zabarwieniem. Intensywność zabarwienia jest proporcjonalna do stężenia cholesterolu. A) KRZYWA WZORCOWA DO OZNACZANIA STĘŻENIA CHOLESTEROLU WYKONANIE: 1. Przygotować 5 czystych i suchych probówek z korkiem, ponumerować je i ustawić w statywie. 2. Do każdej probówki pod dygestorium! dodać podane w tabeli 3 ilości wzorcowego chloroformowego (0,04%) roztworu cholesterolu i chloroformu. 3. Do każdej probówki odmierzyć pod dygestorium! po 2 ml bezwodnika octowego oraz po 0,1 ml stężonego kwasu siarkowego. 4. Zawartość probówek dokładnie wymieszać (używając worteksu) i pozostawić je w ciemnym miejscu na 10 minut. Po upływie tego czasu zmierzyć absorbancję roztworów w odniesieniu do próby ślepej (probówka nr 1) przy długości fali λ=610 nm. 5. Wyniki zamieścić w Tabeli 3. 6. Wykreślić krzywą wzorcową do oznaczania stężenia cholesterolu. 3
Tabela 3 Numer probówki 1 2 3 4 5 Wzorcowy roztwór cholesterolu, ml 0 1 2 3 4 Chloroform, ml 5 4 3 2 1 Stężenie cholesterolu w mg/100 ml Wartość absorbancji 0 8 16 24 32 Badaną krzywą kalibracyjną opisuje równanie:... B) OZNACZANIE STĘŻENIA CHOLESTEROLU 1. Przygotować 1 czystą i suchą probówkę z korkiem (opisaną numerem 6). 2. Do probówki odważyć na wadze analitycznej 0,1 g badanego tłuszczu (masło, margaryna, olej lub smalec). 3. Tłuszcz rozpuścić w 5 ml chloroformu (pod dygestorium!). Zawartość probówki dokładnie wymieszać używając worteksu. 7. Do każdej probówki odmierzyć pod dygestorium! po 2 ml bezwodnika octowego oraz po 0,1 ml stężonego kwasu siarkowego. 8. Zawartość probówki dokładnie wymieszać (używając worteksu) i pozostawić ją w ciemnym miejscu na 10 minut. Po upływie tego czasu zmierzyć absorbancję roztworu w odniesieniu do próby ślepej (probówka nr 1) przy długości fali λ=610 nm. 9. Z równania krzywej wzorcowej obliczyć stężenie cholesterolu w badanej próbie. ZAKRES MATERIAŁU Synteza kwasów tłuszczowych - schemat przemian, enzymy, bilans. Budowa i rola cholesterolu. Ketogeneza. Uwaga! Na zajęcia każda para studentów powinna przynieść 2 rodzaje tłuszczu (masło, margaryna, olej, oliwa, smalec) w ilości kilku gramów. 4
Literatura 1. Biochemia, J. M. Berg i wsp., PWN, Warszawa 2007 2. Biochemia Harpera, R. K. Murray i wsp., PZWL, Warszawa 2006 3. Cytobiochemia, L. Kłyszejko-Stefanowicz, PWN, Warszawa 2002 4. Biochemia kręgowców, W. Minakowski, S. Weidner, PWN, Warszawa 2005 5. Zarys biochemii, P. Karlson, PWN, Warszawa 1987 6. Ćwiczenia z biochemii, L. Kłyszejko-Stefanowicz, PWN, Warszawa 2005 7. Ćwiczenia z biochemii, Strzeżek J., ART, 1997 8. Ćwiczenia z biochemii, Łogin A. i in., ART, 1997 9. Materiały do ćwiczeń z biochemii,toczko M. i Grzelińska A.,SGGW, Warszawa 2001 5