Listopad 2007 QIAamp DSP Virus Kit 50 Instrukcja obsługi Wersja 1 QIAamp DSP Virus Kit jest systemem generycznym, który wykorzystuje technologię QIAamp do izolacji i oczyszczania wirusowych kwasów nukleinowych z próbek ludzkiego osocza lub surowicy krwi do procedur diagnostycznych in vitro. Do stosowania w diagnostyce in vitro 60704 1050717PL 11/2007 QIAGEN GmbH, D-40724 Hilden, Tel: +49-2103-29-0 R1 1050717PL Sample & Assay Technologies
Znaki handlowe: QIAGEN, QIAamp, QIAvac, MinElute (QIAGEN Group); AMPLICOR HBV MONITOR, AMPLICOR HCV MONITOR, AMPLICOR HIV-1 MONITOR, COBAS, TaqMan (Roche Group); artus, RealArt (artus GmbH); Eppendorf (Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH). Zarejestrowane nazwy, znaki handlowe, itd. stosowane w tym dokumencie, nawet jeżeli nie są specjalnie oznakowane, nie mogą być traktowane jako prawnie niechronione. Proces PCR chroniony jest patentami USA 4,683,195 oraz 4,683,202 i ich zagranicznymi odpowiednikami, będącymi w posiadaniu firmy Hoffmann-La Roche AG. 2004 QIAGEN, wszelkie prawa zastrzeżone.
Spis treści Zawartość zestawu 4 Symbole 5 Przechowywanie 6 Kontrola jakości 6 Przeznaczenie 6 Ograniczenia w stosowaniu produktu 7 Informacje dotyczące bezpieczeństwa 7 Wprowadzenie 9 Zasada i procedura 12 Sprzęt i odczynniki dostarczane przez użytkownika 15 Ważne uwagi 16 Ważne informacje do przeczytania przed rozpoczęciem 16 Przygotowanie RNA 17 Przechowywanie próbek 17 Przygotowanie odczynników i buforów 17 Wymywanie wirusowych kwasów nukleinowych 20 Uzysk i jakość wirusowych kwasów nukleinowych 20 Ustawianie systemu próżniowego QIAvac 24 Plus 21 Protokół: Izolacja i oczyszczanie wirusowych kwasów nukleinowych z osocza i surowicy krwi 23 Instrukcja obsługi QIAamp DSP Virus Kit 11/2007 3
Zawartość zestawu QIAamp DSP Virus Kit Numer katalogowy 60704 Liczba powtórzeń 50 QIAamp MinElute Kolumny QIAamp MinElute z probówkami do płukania (Wash Tubes, WT) (2 ml) 50 EXT Przedłużacze kolumn (3 ml) 50 ET Probówki do wymywania (1,5 ml) 50 VC Złącza VacConnectors 50 LT Probówki do lizy (2 ml) 50 WT Probówki do płukania (2 ml) 50 AL Bufor lityczny* 33 ml AW1 Bufor płuczący 1* (koncentrat) 19 ml AW2 Bufor płuczący 2 (koncentrat) 13 ml AE Bufor do wymywania (zatyczki purpurowe) 4 x 2 ml PS Rozcieńczalnik proteazy 4,4 ml Carrier Przenośnik RNA (zatyczki czerwone) 310 QP Proteaza QIAGEN 1 fiolka CD H B 1 Instrukcja obsługi 1 * Zawiera chlorowodorek guanidyny. Produkt niekompatybilny ze środkami dezynfekującymi zawierającymi wybielacz. Informacje o bezpieczeństwie znaleźć można na stronie 7. Zawiera azydek sodu jako środek konserwujący. Objętość rozcieńczenia 4,4 ml. 4 Instrukcja obsługi QIAamp DSP Virus Kit 11/2007
2 C 8 C Otworzyć Symbole i 50 Zestaw zawiera odczynniki do przygotowania 50 próbek Zobacz informacje podane w instrukcji obsługi Należy zużyć przed Urządzenie medyczne do diagnostyki in vitro Numer katalogowy Numer serii Numer materiału Elementy składowe Objętość Zakres temperatury Po otrzymaniu Producent prawny Ważna informacja? EtOH Po wykonaniu etapu protokołu oznakowanego tym znakiem należy zmienić rękawiczki po otrzymaniu; kolumny QIAamp Mini Spin przechowywać w temperaturze 2 8 C Po dodaniu etanolu do butelki zapisać bieżącą datę Dodawanie Zawiera Liofilizowane Rozrobić w Etanol Chlorowodorek guanidyny Subtylizyna Prowadzi do Instrukcja obsługi QIAamp DSP Virus Kit 11/2007 5
Przechowywanie Kolumny QIAamp MinElute należy po otrzymaniu przechowywać w temperaturze 2 8 C. Wszystkie bufory można przechowywać w temperaturze pokojowej (15 25 C). Liofilizowany przenośnik RNA można przechowywać w temperaturze pokojowej (15 25 C) do upływu daty przydatności. Przenośnik RNA można rozpuszczać wyłącznie w buforze do wymywania (AVE); rozpuszczony przenośnik RNA należy natychmiast dodać do buforu litycznego (AL) jak opisano na stronie 18. Ten roztwór powinien być przygotowywany świeży i jest stabilny w temperaturze 2 8 C przez 48 godzin. Niewykorzystaną część przenośnika RNA rozpuszczonego w buforze do wymywania (AVE) należy zamrozić w porcjach w temperaturze 20 C. Liofilizowaną proteazę QIAGEN (QP) można przechowywać w temperaturze pokojowej (15 25 C) do upływu daty przydatności, bez wpływu na jej działanie. Rozrobiona proteaza QIAGEN (QP) jest stabilna przez okres do 1 roku, ale nie dłużej niż do upływu daty przydatności, o ile przechowywana jest w temperaturze 2 8 C. Rozrobiony bufor płuczący 1 (AW1) i rozrobiony bufor płuczący 2 (AW2) pozostają stabilne przez okres do 1 roku, ale nie dłużej niż do upływu daty przydatności, o ile przechowywane są w temperaturze pokojowej (15 25 C). Kontrola jakości Zgodnie z całkowitym systemem zarządzania jakości firmy QIAGEN, poświadczonym certyfikatem, każda seria zestawu QIAamp DSP Virus Kit jest testowana ze wstępnie ustalonymi specyfikacjami w celu zapewnienia spójnej jakości produktu. Przeznaczenie QIAamp DSP Virus Kit jest systemem generycznym, który wykorzystuje technologię QIAamp do izolacji i oczyszczania wirusowych kwasów nukleinowych z próbek ludzkiego osocza lub surowicy krwi do celów diagnostycznych in vitro. Wszelkie wyniki diagnostyczne uzyskane z wykorzystaniem procedury przygotowania próbki w połączeniu z dowolnym dalszym badaniem diagnostycznym NAT należy interpretować wraz z innymi wynikami badań klinicznych i laboratoryjnych. Produkt przeznaczony jest do stosowania przez profesjonalnych użytkowników, takich jak technicy i lekarze przeszkoleni w zakresie technik biologii molekularnej. Przeznaczony jest do stosowania z dowolnym dalszym zestawem wykorzystującym powielanie enzymatyczne lub inne enzymatyczne modyfikacje DNA lub RNA, a następnie detekcję sygnału lub amplifikację. Wyizolowane i oczyszczone kwasy nukleinowe można stosować w jakościowych (np. przesiewowe badanie krwi) jak również ilościowych (np. monitorowanie puli wirusa) badaniach diagnostycznych NAT. 6 Instrukcja obsługi QIAamp DSP Virus Kit 11/2007
Aby zminimalizować nieprawidłowości wyników diagnostycznych, produkt przeznaczony jest do stosowania z kontrolą wewnętrzną, jak również z kontrolami dodatnimi i ujemnymi, przez proces przygotowania próbki, powielania i detekcji, zależnie od stosowanego dalej badania. Produkt przeznaczony jest do stosowania z systemem próżniowym QIAvac 24 Plus lub odpowiednim innym systemem próżniowym. Ograniczenia w stosowaniu produktu Zestaw nie powinien być stosowany do badania krwi, tkanek, szpiku kostnego lub hodowli komórkowych. Zestaw nie służy również do izolacji i oczyszczania bakteryjnych, grzybiczych lub pasożytniczych kwasów nukleinowych. Nie oceniono działania zestawu przy izolacji i oczyszczaniu wirusowych kwasów nukleinowych z innych bezkomórkowych płynów ustrojowych, takich jak mocz i płyn mózgowo-rdzeniowy. Informacje dotyczące bezpieczeństwa Przy pracy z substancjami chemicznymi należy zawsze nosić odpowiedni fartuch laboratoryjny, jednorazowe rękawiczki i okulary ochronne. Więcej informacje znaleźć można na odpowiednich kartach charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS). Są one dostępne w wygodnym i zwartym formacie PDF na stronie www.qiagen.com/ts/msds.asp, gdzie można znaleźć, zobaczyć i wydrukować MSDS dla każdego zestawu i składnika zestawu firmy QIAGEN. PRZESTROGA: Nie należy dolewać wybielacza lub roztworów kwasowych do odpadów powstałych z przygotowywania próbki. Bufor lityczny (AL) i bufor płuczący 1 (AW1) zawierają chlorowodorek guanidyny, który może tworzyć wysoce reaktywne związki w połączeniu z wybielaczem. Jeżeli płyn zawierający te bufory ulegnie rozlaniu, należy wyczyścić go za pomocą odpowiedniego detergentu laboratoryjnego i wody. Jeżeli rozlany płyn zawiera potencjalnie zakaźne czynniki, należy oczyścić zalany obszar najpierw detergentem laboratoryjnym i wodą, a następnie 1% roztworem (v/v) podchlorynu sodu. Jeżeli butelki zawierające bufor są uszkodzone lub nieszczelne, podczas ich wyrzucania należy stosować rękawiczki i okulary ochronne, aby uniknąć urazu osobistego lub zranienia innych osób. Firma QIAGEN nie badała odpadów płynnych powstających w procedurze QIAamp DSP Virus pod względem występowania resztek materiałów zakaźnych. Zanieczyszczenie odpadów płynnych resztkami materiałów zakaźnych jest mało prawdopodobne, ale nie może być całkowicie wykluczone. Z tego względu odpady płynne należy traktować jako zakaźne i należy postępować z nimi oraz dokonywać ich likwidacji zgodnie z lokalnymi przepisami dotyczącymi bezpieczeństwa. Instrukcja obsługi QIAamp DSP Virus Kit 11/2007 7
Składników zestawu QIAamp DSP Virus Kit dotyczą poniższe zwroty odnośnie ryzyka i bezpieczeństwa. Bufor lityczny (AL) i bufor płuczący 1 (AW1) Zawierają chlorowodorek guanidyny: środek szkodliwy, drażniący. Zwroty dotyczące ryzyka i bezpieczeństwa:* R22/-36/38, S13-26-36-46 Proteaza QIAGEN (QP) Zawiera subtylizynę (z Bacillus subtilis): środek uczulający, drażniący. Zwroty dotyczące ryzyka i bezpieczeństwa:* R37/38-41-42, S22-24-26-36/37/39-46 Informacje w nagłych przypadkach czynne 24 godziny na dobę Informacje medyczne w nagłych przypadkach są dostępne w języku angielskim, francuskim i niemieckim 24 godziny na dobę w: Centrum informacji o truciznach w Mainz, Niemcy Tel: +49-6131-19240 * R22: Środek szkodliwy w razie połknięcia; R36/38: Działa drażniąco na oczy i skórę; R37/38: Drażniąca dla układu oddechowego i skóry; R41: Niebezpieczeństwo ciężkiego uszkodzenia oczu;r42: Może powodować uczulenie przy wdychaniu; S13: Nie przechowywać razem z żywnością, napojami i paszami dla zwierząt; S22: Nie wdychać pyłu; S24: Unikać kontaktu ze skórą; S26: Zanieczyszczone oczy przemyć natychmiast dużą ilością wody i zasięgnąć porady lekarza; S36: Nosić odpowiednią odzież ochronną; S36/37/39: Nosić odpowiednią odzież ochronną, rękawice i ochronę oczu/twarzy; S46: W razie połknięcia niezwłocznie zasięgnąć porady lekarza i pokazać opakowanie lub etykietę. 8 Instrukcja obsługi QIAamp DSP Virus Kit 11/2007
Wprowadzenie Zestaw QIAamp DSP Virus Kit wykorzystuje dobrze ustaloną technologię do jednoczesnej izolacji i oczyszczania wirusowego DNA lub RNA. Procedura QIAamp DSP Virus łączy wybiórcze własności wiążące membrany krzemionkowej z minimalnymi objętościami wypłukiwania 20 µl lub 60 µl. Określono liniowy zakres procedury QIAamp DSP Virus dla HIV RNA i HBV DNA w kilku dalszych badaniach diagnostycznych (Tabela 1, Ryciny 1 i 2). Tabela 1. Dalsze badania diagnostyczne, w których oceniano liniowy zakres procedury QIAamp DSP Virus Badanie RT-PCR w czasie rzeczywistym dla HIV RNA PCR w czasie rzeczywistym dla HBV DNA Zestaw Badanie TaqMan oraz test COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Badanie TaqMan i test COBAS AMPLICOR HBV MONITOR Instrukcja obsługi QIAamp DSP Virus Kit 11/2007 9
Zakres liniowy procedury QIAamp DSP Virus z wykorzystaniem badań TaqMan AA log result IU/ml wynik log IU/ml B log result IU/ml wynik log IU/ml 8 6 4 2 0 6 5 4 3 2 1 0 y = 1,0042x 1.0042x + 0,0832 + 0.0832 R 2 = 0,9974 R 2 = 0.9974 1 2 3 4 5 6 7 8 log input IU/ml wejściowy log IU/ml y = 0,9725x 0.9725x + 0,0982 + 0.0982 R 2 = 0,9984 R 2 = 0.9984 1 2 3 4 5 6 log input IU/ml wejściowy log IU/ml Rycina 1. Liniowy zakres procedury QIAamp DSP Virus przy objętości wymywania 60 µl określono stosując badanie TaqMan dla A HIV RNA i B HBV DNA. 10 Instrukcja obsługi QIAamp DSP Virus Kit 11/2007
Zakres liniowy procedury QIAamp DSP Virus z wykorzystaniem testów COBAS AMPLICOR MONITOR A A wynik log IU/ml log result B 6 5 4 3 2 1 y = 1.0098x + 0.1234 R 2 = 0.9982 y = 1,0098 x + 01234 R 2 = 0,9982 2 3 4 5 wejściowy log input log IU/ml log result IU/ml wynik wynik log log IU/ml IU/ml 4 3 2 1 0 y = 0,8839x 0.8839x + 0178 + 0.1718 R 2 = 0,984 R 2 = 0.984 1 2 3 4 5 wejściowy log input log IU/ml Rycina 2. Liniowy zakres procedury QIAamp DSP Virus przy objętości wymywania 60 µl określono stosując testy COBAS AMPLICOR MONITOR dla A HIV RNA i B HBV DNA. Procedurę można stosować z osoczem lub surowicą krwi; mogą zawierać one cytrynian lub EDTA. Próbki mogą być świeże, liofilizowane lub zamrożone, pod warunkiem, że nie były zamrażane i rozmrażane więcej niż raz. Procedurę można stosować do izolacji wirusowego RNA i DNA szerokiej gamy wirusów RNA i DNA. Procedura jest skonstruowana tak, aby nie dopuścić do zanieczyszczenia krzyżowego między próbkami i pozwolić na bezpieczne postępowanie z potencjalnie zakaźnymi próbkami. Procedura jest odpowiednia do jednoczesnej obróbki wielu próbek. Wirusowe kwasy nukleinowe wymywane są buforem do wymywania (AVE) i są gotowe do stosowania w reakcjach amplifikacji lub przechowywania w temperaturze 20 C. Instrukcja obsługi QIAamp DSP Virus Kit 11/2007 11
Zasada i procedura Procedura QIAamp DSP Virus obejmuje 4 etapy: Liza cząstek wirusa w próbce Wiązanie wirusowych kwasów nukleinowych w lizacie do membrany kolumny QIAamp MinElute Płukanie membrany Wymywanie wirusowych kwasów nukleinowych z membrany Procedura prowadzona jest za pomocą kolumn QIAamp MinElute na rozgałęźniku próżniowym. Objętość próbki Poziom detekcji (DL) i poziom zliczania (QL), według wytycznych ICH 2QA i 2QB, określono dla procedury QIAamp DSP Virus (przy początkowej objętości próbki 500 µl i objętościach wymywania 20 µl i 60 µl) za pomocą różnych dalszych badań diagnostycznych (Tabele 2 i 3). Tabela 2. Poziom wykrywania procedury QIAamp DSP Virus Badanie Objętość wymywania Punkt odcięcia 95% artus RealArt HBV DNA 20 µl 2,31 IU/ml (n=240) artus RealArt HCV RNA 20 µl 24,31 IU/ml (n=192) AMPLICOR manual HIV RNA 60 µl 90,92 IU/ml (n=209) TaqMan HBV DNA 60 µl 4,73 IU/ml (n=192) Tabela 3. Poziom zliczania procedury QIAamp DSP Virus Badanie QL CV TaqMan HBV DNA 5,7 IU/ml < 70% (n=88) TaqMan HIV RNA 52 IU/ml < 60% (n=88) COBAS AMPLICOR HIV RNA 100 IU/ml < 60% (n=88) COBAS AMPLICOR HBV DNA 30 IU/ml < 60% (n=88) COBAS AMPLICOR HIV RNA 700 IU/ml < 60% (n=66) 12 Instrukcja obsługi QIAamp DSP Virus Kit 11/2007
Liza cząstek wirusowych Próbki poddawane są lizie w warunkach denaturujących w wysokich temperaturach. Liza zachodzi w obecności proteazy QIAGEN (QP) i buforu litycznego (AL), które wspólnie zapewniają inaktywację RNaz. Wiązanie kwasów nukleinowych do membrany kolumny QIAamp MinElute Aby zoptymalizować wiązanie wirusowego DNA i RNA do membrany kolumny QIAamp MinElute, do lizatów dodaje się najpierw etanol. Każdy lizat nanosi się następnie na kolumnę QIAamp MinElute, a wirusowe kwasy nukleinowe ulegają adsorpcji na membranie z żelu krzemionkowego w miarę przesączania lizatu pod wpływem ciśnienia próżni. Usuwanie resztkowych zanieczyszczeń Podczas gdy wirusowe kwasy nukleinowe pozostają związane z membraną kolumny QIAamp MinElute, zanieczyszczenia są skutecznie wypłukiwane za pomocą najpierw buforu płuczącego 1 (AW1), następnie roztworu płuczącego 2 (AW2) i wreszcie etanolu. Wymywanie czystych kwasów nukleinowych Wirusowe kwasy nukleinowe są wymywane z membrany kolumny QIAamp MinElute za pomocą buforu do wymywania (AVE). Kolumny QIAamp MinElute pozwalają na uzyskanie objętości wymywania 20 µl lub 60 µl. W zależności od stosowanych dalej badań, odciek kwasu nukleinowego może stanowić do 50% objętości reakcji bez żadnych skutków hamujących. Instrukcja obsługi QIAamp DSP Virus Kit 11/2007 13
Procedura QIAamp DSP QIAamp Virus DSP Procedure Virus Próbka Sample LyseLiza Bind Wiązanie Przed rozpoczęciem należy dokładnie przeczytać protokół (strona 23) Do LT, dodać 75 µl QP, 500 µl próbki i 500 µl AL Mieszać na mieszadle przez 15 s Inkubować 15 min (±1 min) w temperaturze 56 C (±1 C) Dodać 600 µl etanolu Mieszać na mieszadle przez 15 s Inkubować 5 min (±1 min) w temperaturze (15 25 C) Próżnia Vacuum Przenieść lizat na kolumnę QIAamp MinElute z dołączonym przedłużeniem (EXT) Próżnia Vacuum Płukanie Wash (AW1) (AW1) Remove Usunąć EXT before EXT przed vacuum is zastosowaniem applied próżni Płukanie Wash (AW2) (AW2) Dodać 600 µl rozrobionego AW1 Usunąć EXT Dodać 700 µl rozrobionego AW2 Vacuum Próżnia Wash Płukanie (ethanol) (Etanol) Dodać 750 µl etanolu Vacuum Próżnia Dry Odwirowanie spin do sucha Elute Wymywanie Czyste Pure wirusowe viral nucleic kwasy acids nukleinowe Umieścić kolumnę QIAamp MinElute w WT Wirować 1 min z prędkością 14 000 rpm Umieścić kolumnę QIAamp MinElute w WT Inkubować 3 min w temperaturze 56 C Umieścić kolumnę QIAamp MinElute w ET Dodać 20 µl lub 60 µl AVE Inkubować 3 min w temperaturze pokojowej (15 25 C) Wirować 1 min z prędkością 14 000 rpm 14 Instrukcja obsługi QIAamp DSP Virus Kit 11/2007
Sprzęt i odczynniki dostarczane przez użytkownika Przy pracy z substancjami chemicznymi należy zawsze nosić odpowiedni fartuch laboratoryjny, jednorazowe rękawiczki i okulary ochronne. Więcej informacji znaleźć można na odpowiednich kartach charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS), które są dostępne u dostawcy produktu. Etanol (96 100%) Pipety* i końcówki do pipet (aby nie dopuścić do zanieczyszczenia krzyżowego zaleca się stosowanie końcówek do pipet z barierami aerozolowymi) Rękawiczki jednorazowego użytku Blok grzewczy* do lizy próbek w temperaturze 56 C (zaleca się stosowanie Eppendorf Thermomixer comfort z termoblokiem dla mikroprobówek po 2,0 ml ) Mikrowirówka* Cylinder pomiarowy (50 ml) Mieszadło System próżniowy QIAvac 24 Plus (QIAvac 24 Plus, nr kat. 19413, system łączący QIAvac Connecting System, nr kat. 19419 i pompa próżniowa, nr kat. 84020) lub równorzędny laboratoryjny system próżniowy * Aby zapewnić odpowiednią obróbkę próbek w procedurze QIAamp DSP Virus, zaleca się, aby urządzenia (tzn. pipety i bloki grzewcze) były kalibrowane zgodnie z zaleceniami producenta. Nie jest to pełna lista dostawców i nie obejmuje wielu ważnych sprzedawców towarów biologicznych. Dostępny w połowie roku 2004; proszę sprawdzić w witrynie www.qiagen.com/products/accessories. Instrukcja obsługi QIAamp DSP Virus Kit 11/2007 15
Ważne uwagi Ważne informacje do przeczytania przed rozpoczęciem Po otrzymaniu zestawu należy sprawdzić czy elementy zestawu nie są uszkodzone. Jeżeli uszkodzone są opakowania listkowe lub butelki z buforami, należy skontaktować się z obsługą techniczną firmy QIAGEN lub lokalnym przedstawicielem firmy. W razie rozlania płynu, zobacz Informacje dotyczące bezpieczeństwa (strona 7). Nie należy używać uszkodzonych elementów zestawu, ponieważ ich użycie może prowadzić do słabego działania zestawu. Zawsze należy stosować sprzęt bez RNaz. Podczas procedury etanol (96 100%) należy przechowywać na lodzie. Zawsze należy zmieniać końcówki pipet pomiędzy przenoszeniami płynów. Aby uniknąć zanieczyszczenie krzyżowego, zaleca się stosowanie końcówek do pipet z barierą aerozolową. Wszystkie etapy wirowania należy przeprowadzać w temperaturze pokojowej (15 25 C). Zawsze należy stosować rękawiczki jednorazowego użytku i regularnie sprawdzać czy nie zostały zanieczyszczone materiałem próbki. Rękawiczki należy wyrzucić jeżeli zostaną zabrudzone, a przynajmniej w tych wszystkich etapach, które oznakowane są symbolem rękawiczki. Aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego, należy otwierać jednorazowo tylko jedną probówkę. Nie należy stosować elementów z innych zestawów z aktualnie stosowanym zestawem, chyba że numery serii są identyczne. Należy unikać zanieczyszczenia odczynników zestawu drobnoustrojami. Aby zapewnić bezpieczeństwo przed potencjalnie zakaźnym materiałem, zaleca się pracę w warunkach laminarnego przepływu powietrza do czasu lizy próbek. Zestaw powinien być stosowany wyłącznie przez personel wyszkolony w zakresie laboratoryjnych procedur diagnostycznych in vitro. Procedura zawiera instrukcje dotyczące obróbki pojedynczej próbki osocza lub surowicy krwi. W systemie próżniowym QIAvac 24 Plus można jednak jednocześnie prowadzić obróbkę do 24 próbek. 16 Instrukcja obsługi QIAamp DSP Virus Kit 11/2007
Przygotowanie RNA Podczas przygotowywania wirusowego RNA, należy szybko pracować podczas ręcznych etapów procedury. Bufor do wymywania (AVE) zawiera azydek sodu*, czynnik przeciwbakteryjny, który zapobiega wzrostowi organizmów produkujących RNazy. Ponieważ jednak bufor ten nie zawiera żadnych czynników chemicznych powodujących degradację RNaz, nie będzie aktywnie hamował RNaz wprowadzonych wskutek nieprawidłowego postępowania. Należy niezwykle uważać, aby uniknąć zanieczyszczenia RNazami buforu do wymywania (AVE). Przechowywanie próbek Po pobraniu i odwirowaniu, osocze lub surowicę krwi można przechowywać w temperaturze 2 8 C do 6 godzin. W celu długotrwałego przechowywania, zaleca się zamrożenie w porcjach w temperaturze 20 C lub 80 C. Nie wolno więcej niż raz rozmrażać zamrożonych próbek osocza lub surowicy krwi. Wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie prowadzi do denaturacji i wytrącania białek, co powoduje zmniejszenie miana wirusów i z tego względu zmniejszone odzyskanie wirusowych kwasów nukleinowych. Ponadto, krioprecypitaty powstałe podczas zamrażania-rozmrażania zatykają membranę kolumny QIAamp MinElute. Jeżeli krioprecypitaty są widoczne, należy je zebrać przez odwirowanie z prędkością około 6800 x g przez 3 minuty. Oczyszczony supernatant należy zaaspirować i natychmiast poddać obróbce, bez naruszania osadu. Przygotowanie odczynników i buforów Przygotowanie proteazy QIAGEN Należy dodać całą zawartość fiolki zawierającej 4,4 ml rozpuszczalnika proteazy (PS) do fiolki z liofilizowaną proteazą QIAGEN (QP) i dokładnie wymieszać. Aby uniknąć spieniania, wymieszać przez kilkakrotne odwrócenie fiolki. Sprawdzić czy proteaza QIAGEN (QP) jest całkiem rozpuszczona. i Nie należy dodawać proteazy QIAGEN (QP) bezpośrednio do buforu litycznego (AL). * Przy pracy z substancjami chemicznymi należy zawsze nosić odpowiedni fartuch laboratoryjny, jednorazowe rękawiczki i okulary ochronne. Instrukcja obsługi QIAamp DSP Virus Kit 11/2007 17
Dodawanie przenośnika RNA i kontroli wewnętrznej do buforu litycznego Przenośnik RNA służy dwóm celom. Przede wszystkim wzmacnia wiązanie wirusowych kwasów nukleinowych do membrany kolumny QIAamp MinElute, zwłaszcza, jeżeli w próbce jest bardzo niewiele cząstek docelowych. Poza tym, dodanie dużych ilości przenośnika RNA zmniejsza ryzyko degradacji wirusowego RNA w rzadkich sytuacjach, kiedy cząsteczki RNazy nie ulegną denaturacji pod wpływem soli chaotropowych i detergentu zawartego w buforze litycznym (AL). Jeżeli do buforu litycznego (AL) nie jest dodawany przenośnik RNA, może to powodować zmniejszenie odzysku wirusowego RNA lub DNA. Przenośnik RNA może również znajdować się w niektórych odczynnikach kontroli wewnętrznej w dostępnych w handlu dalszych badaniach. W takich przypadkach, proszę zapoznać się z odpowiednimi instrukcjami obsługi dalszych badań. Przy stosowaniu zestawu QIAamp DSP Virus Kit w połączeniu z diagnostycznymi systemami amplifikacji, zaleca się stosowanie kontroli wewnętrznej. Kontrolę wewnętrzną RNA lub DNA oraz rozrobiony przenośnik RNA należy dodać do buforu litycznego (AL) i dokładnie wymieszać poprzez odwrócenie probówki 10 razy. Nie mieszać na mieszadle, aby uniknąć spienienia. Optymalne stężenie kontroli wewnętrznej podano w instrukcjach producenta. Stosowanie stężeń innych niż zalecane może prowadzić do nieprawidłowych wyników. Obliczając prawidłową ilość kontroli wewnętrznej należy wziąć pod uwagę objętość początkową próbki i objętość wymywania. Proszę pamiętać, że zestaw QIAamp DSP Virus Kit wykorzystuje objętość początkową wynoszącą 500 µl. W celu przygotowania roztworu przenośnika RNA, należy dodać 310 µl buforu do wymywania (AVE) do probówki zawierającej 310 µg liofilizowanego przenośnika RNA, aby uzyskać roztwór o stężeniu 1 µg/µl. Dokładnie rozpuścić przenośnik RNA, podzielić na porcje wygodnej wielkości i przechowywać w temperaturze 20 C. Nie zamrażać i rozmrażać porcji przenośnika RNA więcej niż 2 razy. Proszę zwrócić uwagę, że przenośnik RNA nie rozpuszcza się w buforze litycznym (AL). Należy go najpierw rozpuścić w buforze do wymywania (AVE) a następnie dodać do buforu litycznego (AL). Przed wymieszaniem z buforem litycznym (AL) należy sprawdzić, czy przenośnik RNA jest całkowicie rozpuszczony w prawidłowej objętości buforu do wymywania (AVE). i W dalszym badaniu należy zawsze stosować właściwą kontrolę wewnętrzną. Więcej informacji znaleźć można w instrukcjach producenta. Z tabeli 4 (strona 19) należy obliczyć objętość mieszaniny bufor lityczny (AL)/przenośnik RNA potrzebną dla serii próbek, poprzez wybranie liczby próbek, które mają być jednocześnie poddawane obróbce. Objętości oblicza się stosując następujący wzór do obliczania próbek: 18 Instrukcja obsługi QIAamp DSP Virus Kit 11/2007
n x 0,55 ml = y ml y ml x 11,2 µl/ml = z µl gdzie: n = liczba próbek poddawanych jednocześnie obróbce y = obliczona objętość buforu litycznego (AL) z = objętość przenośnika RNA/buforu do wymywania (AVE), którą należy dodać do buforu litycznego (AL) Tabela 4. Objętości buforu litycznego (AL) oraz przenośnika RNA/buforu do wymywania (AVE) potrzebne do procedury QIAamp DSP Virus Liczba próbek Objętość AL (ml) Objętość przenośnika RNA/AVE (µl) Liczba próbek Objętość AL (ml) Objętość przenośnika RNA/AVE (µl) 1 0,55 6,2 13 7,15 80,0 2 1,10 12,3 14 7,70 86,0 3 1,65 18,5 15 8,25 92,4 4 2,20 24,6 16 8,80 98,6 5 2,75 30,8 17 9,35 104,7 6 3,30 37,0 18 9,90 110,9 7 3,85 43,1 19 10,45 117,0 8 4,40 49,3 20 11,00 123,2 9 4,95 55,0 21 11,55 129,4 10 5,50 61,6 22 12,10 135,5 11 6,05 67,8 23 12,65 141,7 12 6,60 73,9 24 13,20 147,8 Przygotowanie buforu płuczącego 1 Za pomocą cylindra pomiarowego należy dodać 25 ml etanolu (96 100%) do butelki zawierającej 19 ml koncentratu buforu płuczącego 1 (AW1). Rozrobiony bufor płuczący (AW1) przechowywać w temperaturze pokojowej (15 25 C). i Przed rozpoczęciem procedury należy zawsze wymieszać rozrobiony bufor do płukania 1 (AW1) poprzez kilkakrotne odwrócenie butelki. Instrukcja obsługi QIAamp DSP Virus Kit 11/2007 19
Przygotowanie buforu płuczącego 2 Za pomocą cylindra pomiarowego dodać 30 ml etanolu (96 100%) do butelki zawierającej 13 ml koncentratu buforu płuczącego 2 (AW2). Rozrobiony bufor płuczący (AW2) przechowywać w temperaturze pokojowej (15 25 C). i Przed rozpoczęciem procedury należy zawsze wymieszać rozrobiony bufor płuczący 2 (AW2) poprzez kilkakrotne odwrócenie butelki. Przygotowanie buforu do wymywania W zestawie dostarczono cztery probówki z roztworem do wymywania (AVE). Należy uważać, aby nie zanieczyścić buforu RNazami. Jeżeli podczas stosowania jednego zestawu dokonywane są nie więcej niż 4 procedury oczyszczania, zaleca się, aby wyrzucić probówkę z buforem do wymywania (AVE) po zakończeniu każdej procedury. Wymywanie wirusowych kwasów nukleinowych W dalszych badaniach, które wymagają małych objętości początkowych (np. niektóre badania PCR i RT-PCR), wykorzystanie wirusowych kwasów nukleinowych wymywanych w 20 µl buforu do wymywania (AVE) może zwiększyć czułość badania. Objętość wirusowych kwasów nukleinowych wymywanych z kolumny QIAamp MinElute może być do 5 µl mniejsza niż objętość buforu do wymywania (AVE) naniesionego na kolumnę. Na przykład, wymywanie wirusowych kwasów nukleinowych za pomocą 60 µl buforu do wymywania (AVE) daje odciek o objętości około 55 µl, a wymywanie za pomocą 20 µl daje około 15 µl odcieku. Objętość odzyskanego odcieku zależy od rodzaju próbki. Jeżeli objętość odzyskanego odcieku jest zbyt mała dla dalszego badania, należy zwiększyć objętość dodając więcej buforu do wymywania (AVE). Wymyte wirusowe kwasy nukleinowe są zbierane w probówkach do wymywania (ET). Zaleca się, aby wirusowe kwasy nukleinowe przechowywać do 24 godzin w temperaturze 2 8 C. Uzysk i jakość wirusowych kwasów nukleinowych Uzysk i jakość wyizolowanych kwasów nukleinowych są odpowiednie dla wszystkich rodzajów dalszych procedur detekcji w diagnostyce molekularnej. Badania diagnostyczne należy wykonywać zgodnie z instrukcjami producenta. 20 Instrukcja obsługi QIAamp DSP Virus Kit 11/2007
Ustawianie systemu próżniowego QIAvac 24 Plus Sprawdzić czy prawidłowo ustawiono przedłużenie kolumny (EXT), kolumnę QIAamp MinElute, złącze VacConnector (VC) oraz zawór VacValve (zobacz Rycina 3). 4 3 2 1 Rycina 3. Montaż elementów zestawu QIAamp DSP Virus Kit do próżniowej obróbki próbek: 1: zawór VacValve (dostarczany z systemem próżniowym) 3: kolumna QIAamp MinElute 2: złącze VacConnector (VC) 4: przedłużenie kolumny (EXT) Zaleca się oznakowanie probówek litycznych (LT), probówek do wymywania (ET) oraz kolumn QIAamp MinElute do stosowania w systemie próżniowym QIAvac 24 Plus zgodnie ze schematem przedstawionym na Rycinie 4, aby uniknąć pomieszania próbek. Można skopiować tę rycinę i oznakować nazwy próbek. Instrukcja obsługi QIAamp DSP Virus Kit 11/2007 21
Data: Operator: ID cyklu: 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Rycina 4. Schemat znakowania probówek litycznych (LT), probówek do wymywania (ET) oraz kolumn QIAamp MinElute do stosowania w systemie próżniowym QIAvac 24 Plus. 22 Instrukcja obsługi QIAamp DSP Virus Kit 11/2007
Protokół: Izolacja i oczyszczanie wirusowych kwasów nukleinowych z osocza i surowicy krwi Do izolacji i oczyszczania wirusowych kwasów nukleinowych z 500 µl osocza lub surowicy krwi pobranych na EDTA lub cytrynian. Czynności do wykonania przed rozpoczęciem pracy Doprowadzić próbki do temperatury pokojowej (15 25 C) i sprawdzić czy są dobrze wymieszane. Dodać przenośnik RNA rozrobiony w buforze do wymywania (AVE) lub kontrolę wewnętrzną do buforu litycznego (AL), zgodnie z instrukcjami podanymi na stronie 18. Sprawdzić czy bufor płuczący 1 (AW1), bufor płuczący 2 (AW2) oraz proteaza QIAGEN (QP) zostały przygotowane według instrukcji podanych w rozdziale Ważne uwagi na stronie 16. Doprowadzić bufor do wymywania (AVE) do temperatury pokojowej (15 25 C) do wykorzystania w etapie 18. W miarę możliwości stosować świeży bufor do wymywania (AVE) do każdej procedury (dostarczono 4 probówki). Ustawić blok grzewczy na temperaturę 56 C do wykorzystania w etapach 4 i 17. Aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego, wprowadzić złącze VacConnector (VC) do każdego adaptera typu luer systemu próżniowego. Sprawdzić czy butelka na odpady systemu próżniowego jest pusta i czy wszystkie złącza są prawidłowo połączone. Szczegóły dotyczące obsługi systemu próżniowego, zwłaszcza jego konserwacji, znaleźć można w dostarczonym wraz z nim podręczniku. Procedura 1. Za pomocą pipety przenieść 75 µl proteazy QIAGEN (QP) do probówki litycznej (LT). i Przed użyciem, sprawdzić datę ważności rozrobionej proteazy. 2. Dodać 500 µl osocza lub surowicy krwi do probówki litycznej (LT). 3. Dodać 500 µl buforu litycznego (AL) (zawierającego 11,2 µg/ml przenośnika RNA) do probówki litycznej (LT), zamknąć wieczko I wymieszać pulsacyjnie na mieszadle przez 15 s. Aby zapewnić efektywną lizę, istotne jest, aby próbka i bufor lityczny (AL) były dobrze wymieszane i tworzyły homogenny roztwór. Instrukcja obsługi QIAamp DSP Virus Kit 11/2007 23
i Bufor lityczny (AL) zawiera kontrolę wewnętrzną. Ponieważ bufor lityczny (AL) ma dużą lepkość, należy upewnić się, aby dodać właściwą objętość buforu, przenosząc go ostrożnie za pomocą pipety lub stosując odpowiednią pipetę, taką jak pipeta wieloetapowa Eppendorf lub analogiczna. i Nie dodawać proteazy QIAGEN (QP) bezpośrednio do buforu litycznego (AL). 4. Inkubować przez 15 min (±1 min) w temperaturze 56 C (±1 C). 5. Odwirować probówkę lityczną (LT) przez 5 s przy pełnej prędkości, aby usunąć krople z wewnętrznej powierzchni wieczka. 6. Zmienić rękawiczki i otworzyć ostrożnie probówkę lityczną (LT). 7. Dodać 600 µl etanolu (96 100%) do probówki litycznej (LT), zamknąć wieczko i dokładnie wymieszać pulsacyjnie na mieszadle przez 15 s. Inkubować przez 5 min (±1 min) w temperaturze pokojowej (15 25 C). 8. Odwirować probówkę lityczną (LT) przez 5 s przy pełnej prędkości, aby usunąć krople z wewnętrznej powierzchni wieczka. 9. Wprowadzić kolumnę QIAamp MinElute do złącza VacConnector (VC) w systemie próżniowym (patrz Rycina 3, strona 21). Wprowadzić przedłużenie kolumny (EXT) w otwartą kolumnę QIAamp MinElute. i Zachować probówkę do płukania (WT) w celu odwirowania do sucha w etapie 16. 10. Zmienić rękawiczki i otwierać zawsze tylko jedną probówkę. 11. Ostrożnie nanieść cały lizat z etapu 7 do przedłużenia kolumny (EXT) QIAamp MinElute nie powodując zamoczenia brzegu. Unikać dotykania membrany kolumny QIAamp MinElute końcówką pipety. 12. Włączyć pompę próżniową. Po przejściu lizatu przez kolumnę QIAamp MinElute, otworzyć zastawkę systemu próżniowego i zwolnić próżnię. Jeżeli jednocześnie obróbce poddawanych jest kilka kolumn QIAamp MinElute, zaleca się zamknięcie zaworu VacValve każdej kolumny po przejściu lizatu, aby zmniejszyć czas trwania etapu próżniowego. i Jeżeli lizat nie przeszedł całkowicie przez membranę w ciągu 15 min, należy wyrzucić kolumnę QIAamp MinElute i powtórzyć procedurę z nową próbką. i W celu szybkiego zwolnienia ciśnienia próżni należy użyć zawór systemu próżniowego. 13. Nanieść 600 µl buforu płuczącego 1 (AW1) na kolumnę QIAamp MinElute. Ostrożnie wyjąć i wyrzucić przedłużenie kolumny (EXT) i zamknąć zawór systemu próżniowego. Po przejściu buforu płuczącego 1 (AW1) przez kolumnę QIAamp MinElute, otworzyć zawór i zwolnić próżnię. 24 Instrukcja obsługi QIAamp DSP Virus Kit 11/2007
i Aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego, należy dopilnować, aby usunięte przedłużenie kolumny (EXT) nie przechodziło nad sąsiadującymi kolumnami QIAamp MinElute. 14. Nanieść 750 µl buforu płuczącego 2 (AW2) na kolumnę QIAamp MinElute nie powodując zamoczenia brzegu. Unikać dotykania membrany kolumny QIAamp MinElute końcówką pipety. Pozostawić otwarte wieczko kolumny i zamknąć zawór systemu próżniowego. Po przejściu buforu płuczącego 2 (AW1) przez kolumnę QIAamp MinElute, otworzyć zawór i zwolnić próżnię. 15. Nanieść 750 µl etanolu (96 100%) na kolumnę QIAamp MinElute nie powodując zamoczenia brzegu. Unikać dotykania membrany kolumny QIAamp MinElute końcówką pipety. Pozostawić otwarte wieczko kolumny i zamknąć zawór systemu próżniowego. Po przejściu etanolu przez kolumnę QIAamp MinElute, otworzyć zawór i zwolnić próżnię. i Do nanoszenia etanolu na kolumnę QIAamp MinElute należy stosować końcówki do pipet z barierą aerozolową. 16. Zamknąć wieczko kolumny QIAamp MinElute, wyjąć ją z systemu próżniowego i wyrzucić złącze VacConnector (VC). Umieścić kolumnę QIAamp MinElute w probówce do płukania (WT) zachowanej w etapie 9 i odwirować przy pełnej prędkości (około 20 000 x g lub 14 000 rpm) przez 1 min, aby całkowicie osuszyć membranę. Wyrzucić probówkę do płukania (WT) zawierającą przesącz. i Pominięcie odwirowania do sucha może prowadzić do zahamowania dalszych badań. 17. Umieścić kolumnę QIAamp MinElute w nowej probówce do płukania (WT) i inkubować z otwartym wieczkiem w temperaturze 56 C przez 3 min, aby odparować pozostały płyn. 18. Umieścić kolumnę QIAamp MinElute w czystej probówce do wymywania (ET) i wyrzucić probówkę do płukania (WT). Ostrożnie otworzyć wieczko kolumny QIAamp MinElute i nanieść 20 µl lub 60 µl buforu do wymywania (AVE) (w zależności od dalszych badań) na środek membrany. Zamknąć wieczko i inkubować w temperaturze pokojowej (15 25 C) przez 3 min. Odwirować przy pełnej prędkości (około 20 000 x g lub 14 000 rpm) przez 1 min, aby wymyć wirusowe kwasy nukleinowe. i Po zakończeniu tego protokołu postępować według procedur konserwacji dla systemu próżniowego (więcej szczegółów znaleźć można w podręczniku dostarczonym wraz z systemem próżniowym). Instrukcja obsługi QIAamp DSP Virus Kit 11/2007 25
Tę stronę celowo pozostawiono pustą 26 Instrukcja obsługi QIAamp DSP Virus Kit 11/2007
Tę stronę celowo pozostawiono pustą Instrukcja obsługi QIAamp DSP Virus Kit 11/2007 27
www.qiagen.com Australia Zamówienia 03-9840-9800 Faks 03-9840-9888 Dział techniczny 1-800-243-066 Austria Zamówienia 0800/28-10-10 Faks 0800/28-10-19 Dział techniczny 0800/28-10-11 Belgia Zamówienia 0800-79612 Faks 0800-79611 Dział techniczny 0800-79556 Kanada Zamówienia 800-572-9613 Faks 800-713-5951 Dział techniczny 800-DNA-PREP (800-362-7737) Chiny Zamówienia 021-51345678 Faks 021-51342500 Dział techniczny 021-51345678 Dania Zamówienia 80-885945 Faks 80-885944 Dział techniczny 80-885942 Finlandia Zamówienia 0800-914416 Faks 0800-914415 Dział techniczny 0800-914413 Francja Zamówienia 01-60-920-926 Faks 01-60-920-925 Dział techniczny 01-60-920-930 Oferty 01-60-920-928 Niemcy Zamówienia 02103-29-12000 Faks 02103-29-22000 Dział techniczny 02103-29-12400 Hong Kong Zamówienia 800 933 965 Faks 800 930 439 Dział techniczny 800 930 425 Irlandia Zamówienia 1800-555-049 Faks 1800-555-048 Dział techniczny 1800-555-061 Włochy Zamówienia 02-33430411 Faks 02-33430426 Dział techniczny 800-787980 Japonia Telefon 03-5547-0811 Faks 03-5547-0818 Dział techniczny 03-5547-0811 Korea Południowa Zamówienia 1544 7145 Faks 1544 7146 Dział techniczny 1544 7145 Luksemburg Zamówienia 8002-2076 Faks 8002-2073 Dział techniczny 8002-2067 Holandia Zamówienia 0800-0229592 Faks 0800-0229593 Dział techniczny 0800-0229602 Norwegia Zamówienia 800-18859 Faks 800-18817 Dział techniczny 800-18712 Singapur Zamówienia 65-67775366 Faks 65-67785177 Dział techniczny 65-67775366 Szwecja Zamówienia 020-790282 Faks 020-790582 Dział techniczny 020-798328 Szwajcaria Zamówienia 055-254-22-11 Faks 055-254-22-13 Dział techniczny 055-254-22-12 Wielka Brytania Zamówienia 01293-422-911 Faks 01293-422-922 Dział techniczny 01293-422-999 USA Zamówienia 800-426-8157 Faks 800-718-2056 Dział techniczny 800-DNA-PREP (800-362-7737) 1050717PL 11/2007 Sample & Assay Technologies