Materiały biologiczne. Materiały biologiczne: prawidłowe zabezpieczanie śladów. Materiały biologiczne

Materiały biologiczne Materiały biologiczne: prawidłowe zabezpieczanie śladów Warunki Materiały suche: temp. pokojowa, dostęp powietrza Ciecze, tkanki miękkie: -20 o C do -80 o C (kości) Inne: paznokcie, wymazy z pochwy tkanki zatopione w parafinie, utrwalone w formalinie Metody Krew na antykoagulant (-20 o C) lub bibuła / płótno / FTA (+20 o C) Wymazy (-20 o C lub + 20 o C po wysuszeniu) Wysuszenie / zapakowanie w papierową kopertę; temperatura pokojowa niedopałki, znaczki, odzież (pobranie fragmentów lub w całości), paznokcie wraz z materiałem znajdującym się pod nimi Materiały biologiczne prawidłowe zabezpieczanie śladów Materiały biologiczne nieprawidłowe zabezpieczanie śladów - praca w niesterylnych warunkach brak rękawiczek, masek; używanie niejałowej wody dest. kontaminacja przy zabezpieczaniu - zabezpieczanie krwi na heparynę (inhibicja PCR) - niedosuszenie wymazów / zabezpieczanych śladów / przechowywanie w szczelnie zamkniętych foliowych workach rozwój mikroorganizmów i późniejsze zgnicie - zabrudzenie materiałów glebą (kwasy humusowe), rdzą, detergentami, chemikaliami (kwasy / zasady) degradacja / inhibicja DNA - pozostawianie w nasłonecznionym miejscu degradacja (UV) A. Ślina test niespecyficzny test płytkowy (agar + skrobia) test specyficzny test immunochromatograficzny test odciskowy A. Ślina (aktywność α-amylazy) test niespecyficzny test skrobiowy płytkowy B. Krew testy niespecyficzne (luminol, H 2 O 2 ) testy specyficzne - immunochromatograficzne C. Sperma test niespecyficzny UV / test bardziej specyficzny Bluemaxx test specyficzny - immunochromatograficzny (obecność PSA) 1

A. Ślina (obecność α-amylazy) test specyficzny test immunochromatograficzny A. Ślina (aktywność α-amylazy) test specyficzny test odciskowy Phadebas B. Krew test niespecyficzny - luminol B. Krew test niespecyficzny - H 2 O 2 Emisja światła odbywa się po kontakcie z utleniaczem i śladem krwi (hem - aktywator) w środowisku zasadowym. Katalaza 2 H 2 O 2 2 H 2 O + O 2 Komponentami zdolnymi do generacji energii w postaci światła są hem oraz peroksydaza. B. Krew test specyficzny - immunochromatograficzny C. Sperma test niespecyficzny UV (254nm/365nm) test bardziej specyficzny Bluemaxx (390-520nm) 2

Etapy analizy w genetyce medyczno-sądowej C. Sperma test specyficzny - immunochromatograficzny (obecność PSA) 1. Pobranie materiału do badań / Testy jakościowe 2. Izolacja DNA 3. Pomiar stężenia DNA 4. Amplifikacja DNA metodą PCR 5. Detekcja / Rozdział elektroforetyczny produktów PCR 6. Genotypowanie / Ocena wartości uzyskanych wyników IZOLACJA DNA jest kluczowym etapem analizy próbek biologicznych głównym celem jest uzyskanie jak największej ilości niezdegradowanego, wysokocząsteczkowego DNA od tego etapu zależy możliwość przeprowadzenia dalszych analiz IZOLACJA DNA jałowość pracy METODY IZOLACJI DNA 3 najczęściej stosowane metody izolacji DNA: Metoda kolumienkowa Metoda magnetyczna Metoda organiczna w układzie: fenol : chloroform : alkohol izoamylowy LIZA ADSORPCJA NA MEMBRANIE PRZEMYWANIE DNA ELUCJA METODA KOLUMIENKOWA Próbki poddawane są lizie w obecności proteinazy K i odpowiedniego buforu lizującego. Adsorpcję DNA do membran jonowo wymiennych umożliwia obecność soli chaotropowej o wysokim stężeniu. Za pomocą roztworów płuczących DNA przemywane jest z inhibitorów reakcji PCR, białek i innych zanieczyszczeń. Uwalnianie DNA z membrany następuje dzięki działaniu buforu o niskiej zawartości soli, który powoduje zmianę warunków wiązania. 3

LIZA WIĄZANIE DNA PRZEMYW ANIE DNA ELUCJA METODA MAGNETYCZNA Procedura izolacji rozpoczyna się od lizy komórek. Próbki poddawane są lizie w obecności proteinazy K oraz odpowiedniego buforu lizującego. Następnie do roztworu dodaje się zawiesinę zawierającą kulki magnetyczne. Ligandy znajdujące się na powierzchni kulek wiążą cząsteczki DNA. Kulki magnetyczne ze związanym materiałem osadzają się na ścianie probówki od strony magnesu. Supernatant usuwa się za pomocą pipety. DNA przytwierdzone do kulek przemywa się kilkakrotnie. DNA odzyskuje się w postanie eluatu przy pomocy odpowiedniego buforu elucyjnego. METODA FENOLOWA Liza komórek Próbki poddawane są lizie z wykorzystaniem detergentu jonowego np. SDS, która rozpuszcza błony komórkowe Trawienie Oczyszczanie białek przy lizatu użyciu mieszaniną proteinazy Fenol K : Chloroform: Alkohol Izoamylowy Fenol i chloroform rozdziela DNA od zintegrowanych z nim białek (odbiałcza), alkohol izoamylowy redukuje pienienie i stabilizuje granicę fazową. Otrzymujemy dwie fazy: ORGANICZNĄ I WODNĄ W fazie organicznej znajdują się: fenol, chloroform, lipidy błon komórkowych i zdenaturowane białka. W fazie wodnej znajdziemy DNA i sól fizjologiczną. Precypitacja DNA (wytrącanie) 96% etanolem Etanol 96% wytrąca DNA z roztworu, który podczas wirowania osadza się na dnie probówki. Zawieszenie preparatu DNA w buforze Izolacja DNA jądrowego z materiału kostnego INNE METODY IZOLACJI DNA Do rzadziej wykorzystywanych metod izolacji DNA zaliczamy m.in.: Metoda Chelex Metoda Kart FTA Metoda Solna METODA CHELEX Chelex-100 jest żywicą chelatującą o wysokim powinowactwie do jonów metali wielowartościowych. Wiążąc i usuwając jony metali podczas izolacji DNA zapobiega uszkodzeniom DNA i redukuje inhibitory PCR. Procedura izolacji DNA oparta na wykorzystaniu żywicy Chelex-100 jest uniwersalną, stosunkowo szybką i prostą do wykonania metodą. Proces Izolacji DNA Do bibuły filtracyjnej zawierającej zasuszoną krew obwodową dodajemy sterylną wodę. Po odwirowaniu i całkowitym usunięciu supernatantu dodajemy żywicy Chelex-100. METODA KART FTA Karty FTA zawierają substancje chemiczne które powodują lizę komórek, denaturację białek oraz zabezpieczają kwasy nukleinowe przed działaniem nukleaz, utleniaczy oraz promieniowania UV. Pobieranie próbki, polega na umieszczeniu jej na karcie FTA, dzięki czemu dna może być archiwizowane przez wiele lat w temperaturze pokojowej. Jest stosunkowo prostą, szybką i bezpieczną metodą. Chelex-100 używa się do odzyskiwania DNA z różnych próbek biologicznych m.in.: Próbkę poddajemy inkubacji. Śladów biologicznych, śliny na bibule Zaschniętych plam krwi Zaparafinowanych tkanek stałych Otrzymany supernatant wykorzystujemy w dalszej analizie. 1. Nanieść próbkę na matrycę FTA 2. Wycisnąć krążek z próbką 3. Dodać wody deuterowanej 4. Usunąć wodę sterylną pipetą 5. Dodać sterylnej wody 6. Gotowy izolat 4

METODA SOLNA Liza komórek w obecności buforu ekstrakcyjnego, proteinazy K oraz roztworu SDS. Pomiar stężenia DNA Odbiałczanie DNA zachodzi na skutek odsalania białek komórkowych, poprzez zastosowanie odwodnienia i wytrącania z użyciem nasyconego roztworu NaCl. Zalety metody niskie koszty, możliwość uzyskania wysokocząsteczkowego DNA np. 1 ml. krwi Wady metody wieloetapowość, czasochłonność, niska czystość DNA Próbki poddajemy ponad 12h inkubacji Po izolacji dodajemy nasyconego roztworu NaCl Po odwirowaniu otrzymujemy górną fazę wodną do której dodajemy 96% etanol w celu wytrącenia DNA Usuwamy supernatant i osad przepłukujemy 70% etanolem - zestaw: bufor specyficzny dla zestawu barwnik fluorescencyjny 2 standardy stężenia DNA -źródłem światła są diody wykrywające fluorescencję dsdna w badanej próbie Po usunięciu supernatantu osad DNA zawieszamy w odpowiednim buforze Pomiar stężenia DNA Pomiar stężenia DNA PCR PCR jałowość pracy komora laminarna ok. 28-30 cykli PCR Podwojenie ilości DNA w każdym cyklu 1, 2, 4, 8,16, 32, 64, 128, 256, 512, 1024, 2048, 4096, 8192, 16384, 32768, 65536, 131072, 262144, 524288 (20), 1.048.576 (21), 2097152, 4194304, 8388608, 16777216 (25), 33554432, 67108864, 134217728, 268435456, 536870912 (30), 1.073.741.824 (31) 5

Multiplex PCR Multiplex PCR Jednoczesna amplifikacja kilku loci na DNA matrycowym Rozdział produktów PCR w zależności od wielkości Multiplex PCR metoda pośrednia metoda bezpośrednia izolat DNA Dodanie badanej próby do sporządzonej mieszaniny reakcyjnej Elektroforeza kapilarna badanie spornego ojcostwa 6

Variable number of tandem repeat (VNTR) Variable number of tandem repeat (VNTR) 9 powtórzeń 9 powtórzeń lokus allel 5,9 genotyp 5-9 HETEROZYGOTA = allele różnią się od siebie lokus allel 7,7 genotyp 7-7 HOMOZGOTA = allele jednakowej długości Analiza VNTR w ojcostwie Analiza STR w ojcostwie 1 2 3 1 2 3 1-domniemany ojciec 2- dziecko 3-matka dziecka Brak wyłączenia Wyłączenie / Mutacja Zasady wyłączania ojcostwa Opiniowanie w analizie ojcostwa i U dziecka pojawia się nowa cecha, nieobecna u pozwanego o ojcostwo mężczyzny ani u matki lub WYŁĄCZENIE MINIMUM 4 NIEZGODNOŚCI Dziecko nie dziedziczy żadnej cechy po pozwanym o ojcostwo mężczyźnie Wyniki badań polimorfizmu DNA w y k l u c z a j ą o j c o s t w o. względem. 7

Opiniowanie w analizie ojcostwa WYŁĄCZENIE MINIMUM 4 NIEZGODNOŚCI EKSPERTYZA DNA POTWIERDZENIE Z PRAWDOPODOBIEŃSTWEM >99,9999% (PI>1 000 000) DNA Comission of the International Society of Forensic Genetics Komisja Hemogenetyki Polskiego Towarzystwa Medycyny Sadowej i Kryminologii Szansa ojcostwa - PI Ocenia, ile razy bardziej prawdopodobne jest ojcostwo badanego pozwanego w porównaniu do ojcostwa losowo wybranego mężczyzny dla konkretnego wyniku ekspertyzy Prawdopodobieństwo ojcostwa Szansa ojcostwa - PI Prawdopodobieństwo ojcostwa - P PI = P PI + 1 Łączna szansa ojcostwa PI c Zasada iloczynu PRODUCT RULE PI c = PI 1 lokus x PI 2 lokus x PI 3 lokus x... Szansa ojcostwa 10 100 1000 10 000 100 000 1 000 000 Prawdopodobieństwo ojcostwa 90 % 99 % 99,9 % 99,99 % 99,999 % 99,9999 % Wartość wymagana w opinii potwierdzającej ojcostwo Opiniowanie w analizie ojcostwa POTWIERDZENIE Z PRAWDOPODOBIEŃSTWEM >99,9999% (PI>1 000 000) Wyniki badań polimorfizmu DNA pozwalają na stwierdzenie, że j e s t o j c e m... z prawdopodobieństwem graniczącym z pewnością. 8

Analiza porównawcza uzyskanego profilu DNA identyfikacja osobnicza Niezgodność Zgodność Analiza statystyczna - CZĘSTOŚCI POPULACYJNE OPINIA P r a w d o p o d o b i e ń s t w o przypadkowej zgodności prawo Hardy ego i Weinberga STRUKTURA GENETYCZNA POPULACJI odpowiednio liczna kojarzenie losowe brak doboru naturalnego brak selekcji, mutacji i migracji STAN DYNAMICZNEJ RÓWNOWAGI Częstość występowania różnych genotypów w populacji jest stała i zależna jedynie od częstości występowania alleli w populacji Jeżeli allel a w lokus A ma częstość a a allel b w lokus B ma częstość b HWE w populacji AA = a 2 CZĘSTOŚCI GENOTYPÓW BB = b 2 AB = 2ab CZĘSTOŚCI GENOTYPÓW GF CZĘSTOŚĆ PROFILU PF PF = GF 1 lokus x GF 2 lokus x GF 3 lokus x... 1 CZĘSTOŚĆ PROFILU = 1 PROFIL NA... OSÓB ILOCZYN CZĘSTOŚCI GENOTYPÓW = CZĘSTOŚĆ PROFILU PRAWDOPODOBIEŃSTWO PRZYPADKOWEJ ZGODNOŚCI 9