Novabeads Food DNA Kit

Novabeads Food DNA Kit Novabeads Food DNA Kit jest nowej generacji narzędziem w technikach biologii molekularnej, umożliwiającym izolację DNA z produktów spożywczych wysoko przetworzonych. Metoda oparta jest o zastosowanie w pełni syntetycznego kompozytowego złoża magnetycznego, selektywnie wiążącego kwasy nukleinowe. Specjalnie dobrany skład buforów wiążących i płuczących umożliwia izolację DNA, pomimo wysokiej hydrolizy kwasów nukleinowych w procesie przetwarzania żywności. Izolowany DNA nie ulega fragmentacji w trakcie procesu oczyszczania. Brak inhibitorów reakcji następczych pozwala na bezpośrednie zastosowanie oczyszczonych kwasów nukleinowych w innych technikach biologii molekularnej, takich jak: reakcja PCR sekwencjonowanie DNA defosforylacja fosforylacja ligacja badanie oddziaływań DNA-białko trawienie enzymami restrykcyjnymi. Złoża magnetyczne, w odróżnieniu od standardowych złóż stosowanych do izolacji i oczyszczania DNA, umożliwiają pełną automatyzację tego procesu. W protokole przedstawiamy modyfikacje standardowego protokołu do izolacji DNA na cząstkach magnetycznych, z wysoko przetworzonych produktów spożywczych pochodzenia zwierzęcego. Protokoły zostały zmodyfikowane pod kątem następujących produktów: surowe mięso wieprzowe i wołowe surowe mięso drobiowe (kurczak, indyk) kiełbasa typu polska wędzona, kiełbasa śląska, kabanos pasztet. 1

Standardowa izolacja DNA z nieprzetworzonych tkanek zwierzęcych Novabeads Food DNA Kit Materiały wchodzące w skład zestawu: Cząstki magnetyczne Magnetic Particles Bufor do lizy - Lysis Buffer 1 Bufor do wiązania Binding Buffer Bufor do płukania wstępnego PreWash Buffer Bufor do płukania właściwego Wash Buffer Bufor do elucji TE Buffer Bufor do proteinazy K Proteinase K Buffer Proteinaza K [10 mg/ml] RNaza A [10 mg/ml] Materiały dodatkowo wymagane: Izopropanol 70% Uwagi: statyw magnetyczny worteks Przed przystąpieniem do procedury: dokładnie zworteksować cząstki magnetyczne i pozostawić probówkę w temp. pokojowej. Przed podaniem cząstek magnetycznych jeszcze raz dokładnie zworteksować zawartość probówki. dokładnie wymieszać wszystkie bufory. Opis metody: ETAP I Trawienie tkanki Proteinazą K 1. Fragment tkanki 100 µg 10 mg (*) umieścić w 1,5 ml probówce typu Eppendorf. Dodać 500 µl Proteinase K Buffer oraz 5 µl Proteinazy K. Mieszaninę dokładnie 2. Trawienie prowadzić przez 0,5 3 h w temp. 56 C z wytrząsaniem 500 rpm lub przez noc w temp. 37 C z wytrząsaniem 300 rpm. W między czasie można próby kilka razy 3. Próby dokładnie zworteksować, a następnie zwirować 10 min/12 000 rpm. 4. Supernatant przenieść do czystej probówki i przystąpić do oczyszczania DNA wg załączonej procedury. 2

ETAP II Oczyszczanie DNA 1. Do 25-100 µl lizatu komórkowego (w przypadku trudno lizujących się tkanek podwoić objętość lizatu). Dodać 300 µl Lysis Buffer 1 oraz 5 µl RNazy A. Dokładnie zworteksować zawartość probówki. 2. Mieszaninę inkubować przez 10 min w temp. 65 0 C, a następnie zwirować 10 min/12 000 rpm. 3. Po wirowaniu ostrożnie przenieść supernatant do nowej probówki, osad odrzucić. Do supernatantu dodać 300 µl Binding Buffer i 25 µl Magnetic Particles (cząstek magnetycznych). Mieszaninę dokładnie zworteksować i inkubować 10 min w temp. pokojowej. 4. Probówkę umieścić w statywie magnetycznym. Po zebraniu się cząstek magnetycznych odrzucić supernatant. Uwaga! W kolejnych punktach, po podaniu każdego z buforów do przemywania (PreWash Buffer, Wash Buffer, 70% Izopropanol) zawartość probówki mieszać delikatnie przez odwracanie, do czasu całkowitego oderwania się cząstek magnetycznych od ścian probówki. Nie worteksować probówek! 5. Cząstki magnetyczne zawiesić w 1 ml PreWash Buffer. Po całkowitym oderwaniu cząstek od ścian probówki, inkubować 5 min. w temp. pokojowej. Probówkę umieścić w statywie magnetycznym, a po zebraniu się cząstek magnetycznych odrzucić supernatant. 6. Powtórzyć czynności z punktu 5 z pominięciem inkubacji. Probówkę umieścić w statywie magnetycznym. Po zebraniu się cząstek magnetycznych odrzucić supernatant. 7. Cząstki magnetyczne zwiesić w 1ml Wash Buffer. Po całkowitym oderwaniu cząstek od ścian probówki nie inkubować. Probówkę umieścić w statywie magnetycznym, a po zebraniu się cząstek magnetycznych odrzucić supernatant. 8. Cząstki magnetyczne zawiesić w 1 ml 70% izopropanolu. Po całkowitym oderwaniu cząstek od ścian probówki nie inkubować. Probówkę umieścić w statywie magnetycznym, a po zebraniu się cząstek magnetycznych jak najdokładniej odrzucić supernatant. 9. W celu odparowania pozostałości izopropanolu probówkę umieszczoną w statywie magnetycznym należy pozostawić otwartą przez 10-15 min w temp. pokojowej lub razem ze statywem odwrócić do góry dnem i pozostawić na bibule. 10. Cząstki magnetyczne zawiesić przez worteksowanie w 50 l H 2 0 MiliQ lub w 50 l TE Buffer. Mieszaninę inkubować w temp. 65 C/ 5 min/ 800 rpm, a następnie przy otwartej probówce w temp. 65 C / 5 min/ 800 rpm. 11. Po inkubacji, probówki umieścić w statywie magnetycznym, a po zebraniu się cząstek magnetycznych przenieść supernatant zawierający DNA do nowej probówki. 12. Preparat zawierający wyizolowany DNA można stosować bezpośrednio do reakcji PCR. (*) Ilość tkanki należy dobrać eksperymentalnie w zależności od jej typu i struktury. 3

Modyfikacje standardowego protokołu do izolacji DNA z tkanki zwierzęcej: Materiały wchodzące w skład zestawów: Cząstki magnetyczne Magnetic Particles Bufor do lizy - Lysis Buffer 1 Bufor do wiązania Binding Buffer Bufor do płukania wstępnego PreWash Buffer Bufor do płukania właściwego Wash Buffer Bufor do elucji TE Buffer Proteinaza K [10 mg/ml] RNaza A [10 mg/ml] Materiały dołączone opcjonalnie (w zależności od materiału): Bufor do trawienia (PBS?%, SDS 10%) Bufor do lizy - Lysis Buffer 2 Bufor do precypitacji Precipitation Buffer Materiały dodatkowo wymagane: Izopropanol 70% statyw magnetyczny worteks Uwagi: Przed przystąpieniem do procedury: dokładnie zworteksować cząstki magnetyczne i pozostawić probówkę w temp. pokojowej. Przed podaniem cząstek magnetycznych jeszcze raz dokładnie zworteksować zawartość probówki. dokładnie wymieszać wszystkie bufory. 4

Izolacja DNA na przykładzie surowego mięsa (do mięsa wieprzowego, wołowego i drobiowego) Novabeads Food DNA Kit ETAP I Trawienie tkanki Proteinazą K 5. Fragment tkanki 25 mg umieścić w 1,5 ml probówce typu Eppendorf. Dodać 200 µl Buforu do trawienia (PBS, 100 µl SDS 10%) oraz 20 µl Proteinazy K. Mieszaninę dokładnie 6. Mieszaninę inkubować przez 1 h w temp. 50 C z wytrząsaniem 500 rpm. 7. Próby dokładnie zworteksować, a następnie zwirować 10 min/12 000 rpm. 8. Supernatant przenieść do czystej probówki i przystąpić do oczyszczania DNA wg załączonej procedury. ETAP II Oczyszczanie DNA 1. Do nowej probówki Eppendorf pobrać 130 µl supernatantu (lizatu komórkowego). Dodać 300 µl Lysis Buffer 2 oraz 5 µl RNazy A. Dokładnie zworteksować zawartość probówki. 2. Mieszaninę inkubować przez 10 min w temp. 65 0 C, a następnie zwirować 10 min/12 000 rpm. 3. Po wirowaniu ostrożnie przenieść supernatant do nowej probówki, osad odrzucić. Supernatant dopełnić do maksymalnej objętości Precipitation Buffer, próbę zworteksować i inkubować przez 5 min. w temp. -20 C. 4. Próbę zwirować 10 min/12000 rpm i usunąć supernatant przez energiczne odwrócenie probówki. 5. Do osadu dodać 250 µl Binding Buffer i dokładnie zworteksować, aż do rozpuszczenia się osadu. Dodać 20 µl Magnetic Particles (cząstek magnetycznych). Mieszaninę dokładnie zworteksować i inkubować 10 min w temp. pokojowej. 6. Probówkę umieścić w statywie magnetycznym. Po zebraniu się cząstek magnetycznych odrzucić supernatant. Następnie, według wspólnej procedury opisanej w punktach 7 14 (str. 8). 5

Izolacja DNA na przykładzie kiełbasy polskiej wędzonej ETAP I Trawienie tkanki Proteinazą K 1. Fragment tkanki 50 mg umieścić w 1,5 ml probówce typu Eppendorf. Dodać 500 µl Proteinase K Buffer oraz 5 µl Proteinazy K. Mieszaninę dokładnie 2. Mieszaninę inkubować przez 0,5 3 h w temperaturze 56 C z wytrząsaniem 500 rpm lub przez noc w temp. 37 C z wytrząsaniem 300 rpm. W między czasie można próby kilka razy 3. Po trawieniu próby dokładnie zworteksować, a następnie zwirować 10 min/12 000 rpm. 4. Supernatant przenieść do czystej probówki i przystąpić do oczyszczania DNA wg załączonej procedury. ETAP II Oczyszczanie DNA 1. Do nowej probówki Eppendorf pobrać cały supernatant (lizat komórkowy). Dodać 500 µl Lysis Buffer 2 oraz 5 µl RNazy A. Dokładnie zworteksować zawartość probówki. 2. Mieszaninę inkubować przez 20 min w temp. 65 0 C, a następnie zwirować 10 min/12 000 rpm. 3. Po wirowaniu ostrożnie przenieść supernatant do nowej probówki, osad odrzucić. Supernatant dopełnić do maksymalnej objętości Precipitation Buffer, próbę zworteksować i inkubować przez 5 min. w temp. -20 C. 4. Próbę zwirować 10 min/12000 rpm i usunąć supernatant przez energiczne odwrócenie probówki. 5. Do osadu dodać 250 µl Binding Buffer i dokładnie zworteksować, aż do rozpuszczenia się osadu. Dodać 25 µl Magnetic Particles (cząstek magnetycznych). Mieszaninę dokładnie zworteksować i inkubować przez 10 min w temp. pokojowej. 6. Probówkę umieścić w statywie magnetycznym. Po zebraniu się cząstek magnetycznych odrzucić supernatant. Następnie, według wspólnej procedury opisanej w punktach 7 14 (str. 8). 6

Izolacja DNA na przykładzie kiełbasy śląskiej Novabeads Food DNA Kit ETAP I Trawienie tkanki Proteinazą K 1. Fragment tkanki 50 mg umieścić w 1,5 ml probówce typu Eppendorf i dodać 500 µl Proteinase K Buffer oraz 5 µl Proteinazy K. Mieszaninę dokładnie 2. Mieszaninę inkubować przez 0,5 3 h w temperaturze 56 C z wytrząsaniem 500 rpm lub przez noc w temp. 37 C z wytrząsaniem 300 rpm. W między czasie można próby kilka razy 3. Próby dokładnie zworteksować, a następnie zwirować 10 min/12 000 rpm. 4. Supernatant przenieść do czystej probówki i przystąpić do oczyszczania DNA wg załączonej procedury. ETAP II Oczyszczanie DNA 5. Do nowej probówki Eppendorf pobrać 100 µl supernatantu (lizatu komórkowego). Dodać 300 µl Lysis Buffer 1 oraz 5 µl RNazy A. Dokładnie zworteksować zawartość probówki. 6. Mieszaninę inkubować przez 10 min w temp. 65 0 C, a następnie zwirować 10 min/12 000 rpm. 7. Po wirowaniu ostrożnie przenieść supernatant do nowej probówki, osad odrzucić. Do supernatantu dodać 300 µl Binding Buffer i 50 µl Magnetic Particles (cząstek magnetycznych). Mieszaninę dokładnie zworteksować i inkubować 10 min w temp. pokojowej. 8. Probówkę umieścić w statywie magnetycznym. Po zebraniu się cząstek magnetycznych odrzucić supernatant. Następnie, według wspólnej procedury opisanej w punktach 7 14 (str. 8). 7

Uwaga! W kolejnych punktach, po podaniu każdego z buforów do przemywania (PreWash Buffer, Wash Buffer, 70% Izopropanol) zawartość probówki mieszać delikatnie przez odwracanie, do czasu całkowitego oderwania się cząstek magnetycznych od ścian probówki. Nie worteksować probówek! 7. Cząstki magnetyczne zawiesić w 1 ml PreWash Buffer. Po całkowitym oderwaniu cząstek od ścian probówki, inkubować 5 min. w temp. pokojowej. Probówkę umieścić w statywie magnetycznym, a po zebraniu się cząstek magnetycznych odrzucić supernatant. 8. Powtórzyć czynności z punktu 7 z pominięciem inkubacji. Probówkę umieścić w statywie magnetycznym. Po zebraniu się cząstek magnetycznych odrzucić supernatant. 9. Cząstki magnetyczne zwiesić w 1 ml Wash Buffer. Po całkowitym oderwaniu cząstek od ścian probówki nie inkubować. Probówkę umieścić w statywie magnetycznym, a po zebraniu się cząstek magnetycznych odrzucić supernatant. 10. Cząstki magnetyczne zawiesić w 1 ml 70% izopropanolu. Po całkowitym oderwaniu cząstek od ścian probówki nie inkubować. Probówkę umieścić w statywie magnetycznym, a po zebraniu się cząstek magnetycznych jak najdokładniej odrzucić supernatant. 11. W celu odparowania pozostałości izopropanolu probówkę umieszczoną w statywie magnetycznym należy pozostawić otwartą przez 10-15 min w temp. pokojowej lub razem ze statywem odwrócić do góry dnem i pozostawić na bibule. 12. Cząstki magnetyczne zawiesić przez worteksowanie w 50 l TE Buffer. Mieszaninę inkubować w temp. 65 C/ 5 min/ 800 rpm, a następnie przy otwartej probówce w temp. 65 C / 5 min/ 800 rpm. 13. Po inkubacji, probówki umieścić w statywie magnetycznym, a po zebraniu się cząstek magnetycznych przenieść supernatant zawierający DNA do nowej probówki. 14. Preparat zawierający wyizolowany DNA można stosować bezpośrednio do reakcji PCR. 8