Preparaty krwiozastępcze
Idealne środki krwiozastępcze powinny: wypełniać objętościowo układ naczyniowy mieć lepkość podobną do krwi wytwarzać ciśnienie onkotyczne w celu utrzymania przez dłuższy czas wody w naczyniach zastępować krwinki czerwone w przenoszeniu tlenu.
Podział środków krwiozastępczych 1. Środki zastępcze osocza stosowane w celu zwiększenia objętości krwi krążącej Roztwory koloidowe, np. dekstran Preparaty żelatynowo-skrobiowe, np. hydroksyetyloskrobia Krystaloidy
2. Preparaty posiadające zdolność odwracalnego wiązania tlenu Roztwory wolnej hemoglobiny Koloidalne połączenia hemoglobiny, np. krosfumaryl hemoglobiny, rafimer hemoglobiny, glutamer hemoglobiny Fluorokarbonowe substytuty krwi
Dekstrany Dekstran polimer glukozy o wysokim ciężarze cząsteczkowym rozpuszczalny w wodzie. Wiązania: (1-6)-a-D-glikozydowe (90-95%) (1-4) i (1-3)-a-D-glikozydowe łańcuchy boczne M. cząsteczkowa 5 10 4 do 3 10 8 Da
Dekstran jest uzyskiwany głównie w wyniku fermentacji sacharozy przez pewne rodzaje bakterii kwasu mlekowego np. Leuconostoc
Dotychczas opisane dekstrany można umownie zaliczyć do trzech klas: klasa I - należy tu większość dekstranów. Zbudowane są z łańcucha głównego - α-1,6- glukanowego - do którego poprzez wiązania α-1,2, α- 1,3 lub α-1,4-glikozydowe przyłączone są łańcuchy boczne np. dekstran z Leuconostoc mesenteroides B512F - proste łańcuchy zawierają wiązania α-1,6-glikozydowe, natomiast rozgałęzienia rozpoczynają się wiązaniami α-1,3 przyłączonymi do szkieletu głównego i zawierającymi najczęściej pojedynczą cząsteczkę glukozy - 40% (ewentualnie dwie - 45%). Stopień rozgałęzienia to ok. 5 %.
klasa II - alternan - łańcuch główny z na przemian występującymi wiązaniami α-1,6 i α-1,3 oraz z łańcuchów bocznych przyłączonych wiązaniem α-1,3 np. rozpuszczalny dekstran z Leuconostoc mesenteroides B 1355 - główny łańcuch zawiera ok 54% wiązań typowych i 35% wiązań α-1,3-glikozydowych.
klasa III - mutany - w łańcuchu głównym występują tylko kolejne wiązania α-1,3-glikozydowe oraz nieliczne α-1,6-glikozydowe np. nierozpuszczalny polisacharyd Sterptococcus mutans 6715, zawierający w łańcuchu głównym ok. 93% reszt glukozowych połączonych wiązaniem α-1,3.
Lepkość dekstranów Wykazują cechy cieczy newtonowskich Lepkość jest niezależna od ph i stężenia soli w roztworze Zależy od stężenia roztworu i stosunku między wiązaniami α-1,6; α-1,4 i α-1,3-dglikozydowymi Zależność lepkości różnych frakcji dekstranu od ich stężenia w temperaturze 25ºC.
Produkcja Organizmem używanym powszechnie w przemysłowej produkcji dekstranu jest: Leuconostoc mesenteroides NRRL B12(F) lub Leuconostoc mesenteroides B512. W Rosji używa się szczepu Leuconostoc SP4, a w Czechach i Polsce Leuconostoc L60A.
Podłoża hodowlane Leuconostoc mesenteroides syntetyzuje dekstran na pożywce, która może zawierać: glukozę, inwertowany cukier, maltozę, ekstrakt drożdżowy, namok kukurydziany, namok z kielków słodowych, hydrolizowaną kazeinę, pepton dodatek różnych kationów.
Metody otrzymywania dekstranu
METODA FERMENTACYJNA Proces jednoetapowy stosowany tradycyjnie do produkcji dekstranu z wykorzystaniem bogatych podłóż zawierających do ok. 10% sacharozy jako główne źródło węgla. Jedyny kontrolowany parametr tego procesu: temperatura - 20-25ºC. Podłoże nie jest natleniane Fermentacja jest prowadzona przez 2 do 6 dni. Wydajność tego procesu sięga 45% dla odpowiednio aktywowanych szczepów Leuconostoc mesenteroides. Średnia wydajność wynosi około 25% w przeliczeniu na wyjściową zawartość sacharozy. Otrzymujemy w efekcie natywny dekstran o masie cząsteczkowej z zakresu 50 kda do 500 MDa.
METODA ENZYMATYCZNA Polega na wykorzystaniu do syntezy dekstranu preparatu dekstranosacharazy otrzymywanego z Leuconostoc mesenteroides. Proces przebiega w czterech etapach: 1. namnożenie inokulum i produkcja dekstranosacharazy - niska zawartość cukru w podłożu, temp. 25ºC, ph -7 (początkowe ph pożywki wynoszące 6,7-7,2 w miarę upływu czasu hodowli spada do 6,4-6,9; wówczas obserwuje się syntezę dekstranosacharazy, która jest najintensywniejsza w ph 6,7)
2. usuwanie komórek bakterii z podłoża 3. synteza dekstranu - ph - 5,2; 10% sacharozy w podłożu (zawartość sacharozy powinna być większa niż 2%, dlatego podczas hodowli ciągłej stosuje się zasilanie hodowli sacharozą), odpowiednia ilość enzymu 4. frakcjonowanie i oczyszczanie dekstranu.
Optymalny czas trwania takiej hodowli wynosi ok. 24-48 h. Obniżenie temperatury hodowli powoduje spadek syntezy wysokocząsteczkowego dekstranu, a jednocześnie wzrost syntezy dekstranu niskocząsteczkowego. Po zakończeniu hodowli dekstran wytrąca się poprzez dodanie alkoholu metylowego, lub etylowego. Po rozpuszczeniu dekstran poddaje się hydrolizie do wymaganej masy cząsteczkowej, a następnie oczyszcza na wymiennikach jonowych i węglu aktywnym.
Zalety: 1. możliwość rozdzielenia fazy produkcji enzymu od fazy fermentacji, przez co proces łatwiej kontrolować 2. otrzymany produkt jest bardziej homogenny 3. łatwiejsze oczyszczanie 4. wydajność ok 28-30% 5. może być użyta do syntezy dekstranu klinicznego o określonej, niskiej masie cząsteczkowej
Produkcja dekstranu klinicznego Możliwości zastosowania dekstranu zależą ściśle od jednej konkretnej cechy biopolimeru - od jego masy cząsteczkowej. Również właściwości pochodnych dekstranu zależą znacznie od jego masy. Momentem krytycznym dla produkcji dekstranu przemysłowego jest otrzymanie czystych preparatów tego polimeru o kontrolowanej, w wąskim przedziale, masie cząsteczkowej. Podstawową metodą uzyskiwania dekstranów o określonej, niskiej masie cząsteczkowej jest proces hydrolizy kwasowej połączony z frakcjonowaniem dekstranu natywnego rozpuszczalnikami organicznymi (kosztowny i uciążliwy ).
Po hydrolizie dekstran kliniczny wytrąca się przez dodanie alkoholu etylowego do stężenia 39-46% lub alkoholu metylowego do stężenia 42-50%, a następnie suszy. Inne możliwości częściowej depolimeryzacji dekstranu: przy użyciu zasad enzymów ultradzwięków temperatury Żadna z tych metod nie została jednak wprowadzona do praktyki przemysłowej
Udoskonalone metody otrzymywania niskocząsteczkowych dekstranów - znajdujących zastosowanie kliniczne zastosowanie oczyszczonej dekstranosacharazy w połączeniu z odpowiednimi akceptorami glikozylowymi. - Zaobserwowano, że wprowadzenie niektórych cukrów do mieszaniny reakcyjnej zawierającej enzym i sacharozę prowadzi do syntezy oligosacharydów kosztem wysokocząsteczkowego dekstranu. - Najbardziej efektywne w tym procesie okazały się maltoza, izomaltoza i dekstrany o niskiej masie. - Opisana metoda nie została jednak zastosowana na szeroką skalę, ponieważ pojawiają się znaczne trudności w analizie i oczyszczaniu produktów reakcji, a także występuje konieczność użycia drogiego wysoce oczyszczonego enzymu - dekstranosacharazy.
Zaproponowana w latach 90-tych metoda produkcji dekstranu opiera się na wykorzystaniu kultury mieszanej dekstranotwórczych bakterii Leuconostoc mesenteroides oraz drożdży Lipomyces starkeyi rozkładających dekstran. Metoda ta pozwala wykluczyć etap hydrolizy kwasowej, a uzyskiwany produkt niskocząsteczkowy jest bardziej jednorodny niż otrzymywany na drodze tradycyjnej.
Zastosowanie dekstranu i jego pochodnych kliniczne - Roztwory dekstranu wywierają znaczne ciśnienie osmotyczne dzięki zdolności wiązania wody. Wpływa to na zwiększenie objętości osocza, a tym samym na polepszenie przepływu krwi w naczyniach włosowatych oraz zmniejszenie jej lepkości. -Zaletą tego środka krwiozastępczego jest to, że utrzymuje się w organizmie dostatecznie długo, aby spełnić swoją rolę, a jednocześnie nie odkłada się w tkankach w takim stopniu jak inne środki. - Ponadto przy jego stosowaniu nie trzeba uwzględniać grupy krwi ani obawiać się zakażeń krwiopochodnych oraz możliwe jest jego długie przechowywanie (w odróżnieniu od krwi).
-Dekstran do zastępowania osocza powinien mieć masę od 50 kda do 100 kda, a stosowany jako regulator przepływu krwi od 20 kda do 60 kda - Najpowszechniej stosowany jest dekstran 40 (masa 40 kda), dekstran 70 oraz dekstran 1 używany jako hapten przed podaniem dekstranu o wyższej masie, który znacznie zmniejsza częstość występowania niepożądanych reakcji. - Otrzymano również produkt stanowiący połączenie dekstranu z hemoglobiną, który można zastosować jako substytut krwi, ponieważ taki kompleks łączy funkcję zamiennika osocza i przenośnika tlenu.
Dalsze kliniczne zastosowania dekstranu składnik roztworów stosowanych w krioprezerwacji roztwory do przechowywania organów wykorzystywanych w transplantacji składnik implantów np. stomatologicznych Przykładem materiału stosowanego do regeneracji ubytków kostnych, w którego skład wchodzi dekstran jest Fisiograft Powder (proszek). antykoagulant np. zapobieganie zatorom żylnym Wykorzystany jest do tego celu siarczan dekstranu. Związek ten wchodzi w reakcje z β-lipoproteinami. znalazł on również zastosowanie w różnych metodach analitycznych i preparatywnych, m.in. w oznaczaniu zawartości cholesterolu i innych lipoprotein w surowicy oraz procedurze oczyszczania przeciwciał IgM. http://micro.org.pl/doku.php/grupa5:index