PL 213364 B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 213364 (21) Numer zgłoszenia: 372314 (22) Data zgłoszenia: 28.02.2003 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 28.02.2003, PCT/US03/006256 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: 12.09.2003, WO03/073995 (13) B1 (51) Int.Cl. C12N 1/21 (2006.01) C12N 15/85 (2006.01) C12N 15/12 (2006.01) A61K 48/00 (2006.01) A61K 39/02 (2006.01) (54) Szczepionka DNA i zastosowanie konstruktu DNA (30) Pierwszeństwo: 02.03.2002, US, 10/090,183 (73) Uprawniony z patentu: THE SCRIPPS RESEARCH INSTITUTE, La Jolla, US (43) Zgłoszenie ogłoszono: 11.07.2005 BUP 14/05 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 28.02.2013 WUP 02/13 (72) Twórca(y) wynalazku: RALPH A. REISFELD, La Jolla, US ANDREAS G. NIETHAMMER, San Diego, US RONG XIANG, San Diego, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Janina Kossowska
2 PL 213 364 B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest szczepionka DNA i zastosowanie konstruktu DNA. Kwas dezoksyrybonukleinowy w szczepionce koduje odpowiednie cząsteczki skutecznie wywołujące odpowiedź odpornościową przeciwko proliferującym komórkom śródbłonka. Szczepionki stosuje się, aby uzyskać długotrwałą ochronę przed wieloma stanami chorobowymi, przez bardzo ograniczone podawanie czynnika profilaktycznego, który stymuluje układ odpornościowy organizmu do niszczenia patogenów chorobowych zanim będą mogły namnażać się i wywoływać patologiczny skutek. Różne podejścia do szczepionek i szczepień opisali Bernard R. Glick i Jack J. Pasternak w Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA, wydanie drugie, ASM Press str. 253-276 (1998). Szczepienie jest środkiem pobudzającym własny układ odpornościowy organizmu do wyszukania i zniszczenia czynnika zakaźnego, zanim spowoduje on patologiczną odpowiedź. Typowo, szczepionki są albo żywymi, ale atenuowanymi, czynnikami zakaźnymi (wirusami lub bakteriami) albo zabitą postacią czynnika. Szczepionka składająca się z żywych bakterii lub wirusa musi być niechorobotwórcza. Typowo, hodowlę bakteryjną lub wirusową atenuuje (osłabia) się traktując ją czynnikami fizycznymi lub chemicznymi. Chociaż czynnik jest niezjadliwy, nadal jest w stanie wywołać odpowiedź odpornościową u osobnika traktowanego szczepionką. Odpowiedź odpornościowa jest wywołana przez antygeny, którymi są albo swoiste makrocząsteczki albo czynnik zakaźny. Te antygeny są na ogół albo białkami, polisacharydami, lipidami albo glikolipidami, które są rozpoznawane jako obce przez limfocyty znane jako limfocyty B lub limfocyty T. Ekspozycja obu typów limfocytów na antygen wywołuje gwałtowny podział komórek i różnicowanie skutkujące tworzeniem klonów eksponowanych limfocytów. Limfocyty B wytwarzają komórki plazmatyczne, które z kolei wytwarzają białka zwane przeciwciałami (Ab), które wybiórczo wiążą się z antygenami obecnymi na czynniku zakaźnym, w ten sposób neutralizując lub inaktywując patogen (odporność humoralna). W niektórych przypadkach, odpowiedź limfocytów B wymaga pomocy limfocytów T pomocniczych CD4. Wyspecjalizowanym klonem limfocytów T, który tworzy się w odpowiedzi na ekspozycję na antygen, są limfocyty T cytotoksyczne (CTL),które są zdolne do wiązania i eliminacji patogenów i tkanek, które prezentują antygen (odporność za pośrednictwem komórki lub odporność komórkowa). W pewnych przypadkach, komórki prezentujące antygen (APC), takie jak komórki dendrytyczne, wchłaniają przez endocytozę patogen lub inną obcą komórkę. APC następnie przetwarzają antygeny z komórek i prezentują te antygeny w postaci kompleksu cząsteczka zgodności tkankowej : peptyd receptorom limfocytów T (TCR) na CTL, w ten sposób stymulując odpowiedź odpornościową. Odporność humoralna charakteryzująca się wytwarzaniem swoistych przeciwciał jest na ogół najbardziej skuteczna przeciwko ostrym zakażeniom bakteryjnym i powtórnym zakażeniom wirusowym, podczas gdy odpowiedź komórkowa jest najskuteczniejsza przeciwko zakażeniom wirusowym, przewlekłym bakteryjnym zakażeniom wewnątrzkomórkowym i zakażeniom grzybiczym. Wiadomo również, że odporność komórkowa chroni przed rakami i jest odpowiedzialna za odrzucanie przeszczepów. Przeciwciała przeciwko antygenom z pierwotnego zakażenia pozostają wykrywalne we krwi przez bardzo długi czas, w ten sposób dając środki do określania pierwotnej ekspozycji na patogen. Po ponownej ekspozycji na ten sam patogen układ odpornościowy skutecznie zapobiega ponownemu zakażeniu przez eliminację czynnika patogennego, zanim jest on w stanie namnożyć się i wywołać patologiczną odpowiedź. Taka sama odpowiedź odpornościowa, którą może wywołać patogen, może być czasem wytworzona przez czynnik nie- chorobotwórczy, który prezentuje ten sam antygen co patogen. W ten sposób można zabezpieczyć danego osobnika przed późniejszą ekspozycją na patogen bez uprzedniego zwalczenia infekcji. Jednak nie wszystkie czynniki zakaźne mogą być łatwo hodowane i inaktywowane, co jest wymagane dla wytworzenia szczepionki. Nowoczesne techniki rekombinacji DNA umożliwiły wytworzenie nowych szczepionek w poszukiwaniu obejścia tego ograniczenia. Można utworzyć czynniki zakaźne, które nie mają genów chorobotwórczych, umożliwiając w ten sposób użycie jako szczepionek żywych niezjadliwych postaci organizmu. Jest także możliwe wytworzenie stosunkowo niechorobotwórczego organizmu, takiego jak E. coli do prezentowania antygenów powierzchniowych komórki nośnika chorobotwórczego. Układ odpornościowy osobnika traktowanego takim transformowanym nośnikiem
PL 213 364 B1 3 oszukuje się, aby wytwarzał przeciwciała przeciwko patogenowi. Białka antygenowe czynnika chorobotwórczego mogą być zaprojektowane i wyrażone na powierzchni niechorobotwórczych gatunków i mogą być izolowane i oczyszczane do wytworzenia szczepionki podjednostkowej. Szczepionki podjednostkowe mają tę zaletę, że są stabilne, bezpieczne i dobrze określone chemicznie; jednak ich wytwarzanie może być ograniczone kosztami. W ostatnich latach pojawiło się nowe podejście do szczepionek, szeroko zwane genetyczną immunizacją. W tym podejściu, gen kodujący antygen czynnika chorobotwórczego jest funkcjonalnie wprowadzany do komórek osobnika, który ma być uodporniony. Traktowane komórki są transformowane i wytwarzają białka antygenowe patogenu. Następnie te wytwarzane in vivo antygeny wzbudzają pożądaną odpowiedź odpornościową u gospodarza. Materiał genetyczny stosowany w takich genetycznych szczepionkach może być konstruktem DNA albo RNA. Często polinukleotyd kodujący antygen jest wprowadzany w kombinacji z innymi polinukleotydowymi sekwencjami promotora, aby wzmóc insercję, replikację lub ekspresję genu. Szczepionki DNA kodujące geny antygenów można wprowadzać do komórek gospodarza u pacjenta za pomocą różnych układów ekspresyjnych. Te układy ekspresyjne obejmują układy prokariotyczne, ssacze i drożdży. Jedną z możliwości jest, na przykład, zastosowanie wektora wirusowego, takiego jak wirus krowianki z wprowadzonym nowym materiałem genetycznym, do szczepienia komórek gospodarza. Alternatywnie, materiał genetyczny może być włączony do wektora lub dostarczony bezpośrednio do komórek gospodarza jako nagi polinukleotyd, tj. po prostu jako czysty DNA. Dodatkowo, DNA może być stabilnie transfekowany do atenuowanych bakterii, takich jak Salmonella typhimurium. Gdy pacjent jest szczepiony doustnie transformowaną Salmonella, bakterie są transportowane do kępek Peyer'a w jelicie (tj. wtórnych tkanek Iimfatycznych), gdzie następnie pobudzają odpowiedź odpornościową. Szczepionki DNA dostarczają możliwości uodporniania przeciwko stanom chorobowym, które nie są wywołane przez tradycyjne patogeny, takim jak choroby genetyczne i rak. Typowo, w genetycznej szczepionce rakowej, antygeny dla konkretnego typu komórki nowotworowej muszą być wyizolowane, a następnie wprowadzone do szczepionki. Skuteczna ogólna szczepionka przeciwko pewnej liczbie raków może pociągnąć za sobą rozwój licznych, oddzielnych szczepionek dla każdego typu komórek rakowych, przeciwko którym ma powstać uodpornienie. Jedno z ogólnych podejść do terapii nowotworów obejmuje podawanie związków hamujących angiogenezę pacjentom z rosnącymi guzami. Angiogeneza jest procesem, w którym powstają nowe kapilary i naczynia krwionośne. Angiogeneza jest istotna w rozwoju zarodkowym, wzroście tkanek, gojeniu i regeneracji tkanek. Prócz tych prawidłowych i istotnych procesów, angiogeneza jest także zaangażowana w wiele nieprawidłowych, patologicznych procesów, takich jak wzrost guza, przerzutowanie nowotworów i choroby gałki ocznej, takie jak retinopatia cukrzycowa. Angiogeneza jest zaangażowana w wiele współzależnych procesów, obejmujących (a) aktywację komórek śródbłonka naczyń, (b) rozkład białek substancji międzykomórkowej przez komórki śródbłonka wyrażające aktywność proteaz, (c) migrację komórek śródbłonka do miejsc potencjalnego wzrostu, (d) proliferację komórek śródbłonka i (e) tworzenie naczyń przez różnicowanie komórek śródbłonka. Na każdy z tych procesów oddziałują różne substancje pobudzające, takie jak czynnik wzrostu fibroblastów (FGF), płytkopochodny czynnik wzrostu (PDGF) i czynniki wzrostu śródbłonka naczyń (VEGF). Czynniki wzrostu śródbłonka naczyń (zbiorczo VEGF) odgrywają kluczową rolę we wzroście komórek śródbłonka i ich różnicowaniu. VEGF działa przez związanie receptorów kinaz białkowo-tyrozynowych obecnych na powierzchni błon komórek śródbłonka, które z kolei inicjują kaskadę reakcji transdukcji sygnału, który stymuluje wzrost komórek. Hamowanie patologicznej angiogenezy zaproponowano jako sposób leczenia nowotworów. Zobacz, na przykład, Folkman et al. Science, 221, 719, (1983). Podstawowym założeniem takiego leczenia jest to, że ponieważ guzy wymagają unaczynienia do wzrostu, hamowanie tworzenia naczyń przez podawanie związków hamujących angiogenezę zapobiegnie wzrostowi guza przez odcięcie go od dopływu krwi. Wadą takiego podejścia jest to, że aby zapobiec wzrostowi guza, należy podawać inhibitory angiogenezy w sposób stosunkowo ciągły. Przerwa w dostarczaniu inhibitora może prowadzić do wznowienia wzrostu guza. Szczepionka skutecznie hamująca angiogenezę byłaby interesującym czynnikiem zapobiegawczym przed wzrostem guza.
4 PL 213 364 B1 Istnieje ciągłe zapotrzebowanie na ogólnie skuteczną szczepionkę do uodpornienia przeciwko angiogenezie, która również mogłaby skutecznie hamować wzrost różnych nowotworów bez potrzeby ukierunkowywania na swoiste antygeny nowotworowe. Niniejszy wynalazek zaspakaja tę potrzebę. Niniejszy wynalazek dotyczy szczepionki DNA do skutecznego wywoływania odpowiedzi odpornościowej przeciwko proliferującym komórkom śródbłonka, obejmującej konstrukt DNA funkcjonalnie kodujący białko receptora VEGF w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku, przy czym białko receptora VEGF jest białkiem wybranym z grupy składającej się z VEGFR-2 mającego sekwencję z SEKW. ID. Nr:2, Flk-1 mającego sekwencję z SEKW. ID. Nr:6 i receptora, który wiąże się z VEGF lub jego fragmentami i który ma sekwencję, wykazującą co najmniej 80% homologii z sekwencją z SEKW. ID. Nr:2 lub 6, a konstrukt DNA jest funkcjonalnie wprowadzony do atenuowanego wektora Salmonella typhimurium lub Salmonella typhi. Korzystnie konstrukt DNA jest zasadniczo czystym DNA o sekwencji polinukleotydowej wybranej z grupy składającej się z SEKW ID Nr:1 i SEKW ID Nr:5 i sekwencji polinukleotydowej, która ma z nimi co najmniej 80% homologii i koduje receptor, który wiąże się z VEGF lub jego fragmentami. Ponadto wynalazek dotyczy zastosowania konstruktu DNA funkcjonalnie kodującego białko receptora VEGF i farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika do wytwarzania szczepionki DNA do hamowania wzrostu nowotworu u ssaka, przy czym immunologicznie skuteczna ilość szczepionki DNA, która ma być podawana doustnie ssakowi, dzięki czemu ssak wykazuje odpowiedź odpornościową wywołaną przez szczepionkę i swoistą wobec proliferujących komórek śródbłonka, powoduje zatrzymanie wzrostu nowotworu, zmniejszenie jego wielkości lub zahamowanie rozsiewu nowotworu, a białko receptora VEGF jest wybrane z grupy składającej się z VEGFR-2 mającego sekwencję z SEKW. ID. Nr:2, Flk-1 mającego sekwencję z SEKW. ID. Nr:6 i receptora, który wiąże się z VEGF lub jego fragmentami i który ma sekwencję wykazującą co najmniej 80% homologii z sekwencją z SEKW. ID. Nr:2 lub 6, a konstrukt DNA jest funkcjonalnie wprowadzony do atenuowanego wektora Salmonella typhimurium lub Salmonella typhi. Korzystnie ssakiem jest człowiek. Szczepionka DNA według niniejszego wynalazku stymuluje tworzenie limfocytów CT aktywnych wobec proliferujących komórek śródbłonka, które nadwyrażają VEGFR-2. Komórki śródbłonka tworzą wyściółkę tkanki naczyniowej ssaków. Proliferacja komórek śródbłonka jest kluczowym procesem w angiogenezie. Szczepionka według niniejszego wynalazku dostarcza sposobu do wytworzenia długotrwałego zahamowania angiogenezy w organizmie traktowanym szczepionką przez wywołanie odpowiedzi odpornościowej przeciwko proliferującym komórkom śródbłonka. W proliferujących komórkach śródbłonka, takich jak te wyściółki dojrzałych naczyń krwionośnych nie są obecne istotne ilości antygenów receptora dla VEGF i w ten sposób pozostają one zasadniczo nienaruszone przez limfocyty CT, które są wytwarzane w odpowiedzi na szczepionkę. W celu zahamowania angiogenezy pacjentowi cierpiącemu z powodu choroby związanej z angiogenezą podaje się szczepionkę zawierającą konstrukt DNA funkcjonalnie kodujący białko receptora VEGF, w ilości wywołującej odpowiedź odpornościową. Przez szczepienie pacjenta szczepionką DNA według wynalazku można również zahamować wzrost guza. W takim przypadku pacjentowi z rosnącym guzem podaje się szczepionkę według wynalazku zawierającą konstrukt DNA funkcjonalnie kodujący białko receptora VEGF w ilości skutecznie wywołującej odpowiedź odpornościową. Szczepienie skutkuje zatrzymaniem wzrostu guza. Zniszczenie proliferujących komórek śródbłonka przez układ odpornościowy pacjenta zabezpiecza przed unaczynieniem guza, w istocie zagładzając go na śmierć. Szczepionka DNA według wynalazku może być podawana drogą dojelitową, taką jak podanie doustne, lub pozajelitową przez iniekcję lub infuzję dożylną. Szczepionka według niniejszego wynalazku nadaje się do zastosowania w celu leczenia i zapobiegania wielu stanom chorobowym. Na przykład, szczepienie szczepionką według niniejszego wynalazku przynosi korzyści pacjentom cierpiącym z powodu raka, takiego jak rak płuc, lub rak jelita grubego, lub nowotwory prostaty; retinopatii cukrzycowej, itp. Na rysunkach Figura 1 przedstawia sekwencję DNA kodującą ludzki KDR, SEKW. ID Nr:1; Figura 2 przedstawia sekwencję białkową ludzkiego KDR, SEKW. ID Nr:2; Figura 3 przedstawia sekwencję DNA kodującą ludzki Fit-1, SEKW. ID Nr:3; Figura 4 przedstawia sekwencję białkową ludzkiego Flt-1, SEKW. ID Nr: 4; Figura 5 przedstawia sekwencję DNA kodującą mysi Flk-1, SEKW. ID Nr: 5; Figura 6 przedstawia sekwencję białkową ludzkiego Flk-1, SEKW. ID Nr:6;
PL 213 364 B1 5 Figura 7 przedstawia mysie płuca o różnym stopniu zajęcia przez nowotwór, w zakresie od >50% zajęcia do <10% zajęcia. Figura 8 przedstawia dane pokazujące, że myszy szczepione szczepionką DNA według wynalazku (ciągła, czarna linia) i prowokowane dożylną iniekcją komórek raka jelita grubego CT-26, wykazały znacznie zmniejszoną śmiertelność w odniesieniu do dwóch grup kontrolnych myszy ( naiwne myszy: ciągła cienka linia; szczepionka kontrolna: linia przerywana); Figura 9 przedstawia graficznie dane pokazujące zahamowanie wzrostu guza raka płuc D121 Lewis u myszy szczepionych szczepionką DNA według wynalazku (pcdna3.1-flk-1) w odniesieniu do dwóch grup kontrolnych myszy; Figura 10 przedstawia graficznie dane pokazujące zahamowanie wzrostu czerniaka B16 u myszy szczepionych szczepionką DNA według wynalazku ( ) w odniesieniu do grupy kontrolnej (O); a Figura 11 przedstawia graficznie dane pokazujące zwiększenie liczby CD25, CD69 i CD2 pozytywnych limfocytów T CD8+ u myszy szczepionych szczepionką DNA według wynalazku w odniesieniu do grupy kontrolnej myszy. Szczepionka DNA skutecznie hamująca proliferację komórek śródbłonka obejmuje konstrukt DNA, który funkcjonalnie koduje białko receptora dla naczyniowego czynnika wzrostu śródbłonka (VEGF). Pojęcie konstrukt DNA, w znaczeniu tu stosowanym i w dołączonych zastrzeżeniach, oznacza syntetyczną strukturę DNA, która może ulec transkrypcji w komórkach docelowych. Konstrukt może obejmować liniowy kwas nukleinowy, taki jak oczyszczony DNA DNA w nieszkodliwy, atenuowany wektor bakteryjny. Odpowiednimi DNA są te, które kodują białko receptora dla VEGF, takie jak, odpowiednio VEGFR-2 (KDR; SEKW ID Nr:2), i Flk-1 (SEKW ID Nr:6), np., sekwencje DNA według SEKW ID Nr:1, SEKW ID Nr:3 i SEKW ID Nr:5. Zidentyfikowano 5 podtypów VEGF obejmujących VEGF-1 (znany również jako VEGF-A), VEGF-2 (znany również jako VEGF-C), VEGF-B, VEGF-D i VEGF-E. Zobacz, na przykład, opis patentowy USA Nr 6,235,713 Achen i in. oraz odnośniki w nim cytowane. Receptory VEGF są kinazami białkowo-tyrozynowymi swoistymi dla komórek śródbłonka. Zidentyfikowano kilka receptorów kinaz białkowo-tyrozynowych swoistych dla komórek śródbłonka, w tym Flt-1 (receptor 1 VEGF; VEGFR-1), KDR (VEGFR-2), Flk-1 (mysi homolog KDR), Flt-4 (VEGFR-3), Tie, Tie-2 i Tek, z których kilka jest receptorami VEGF. Szczepionka DNA według niniejszego wynalazku, stymuluje wytwarzanie limfocytów CT, aktywnych wobec proliferujących komórek śródbłonka, które nadwyrażają VEGFR-2. Ponieważ receptory VEGF są wyrażane zasadniczo tylko na proliferujących komórkach śródbłonka, limfocyty CT wytworzone w odpowiedzi na szczepionkę będą zasadniczo skierowane tylko przeciwko tym tkankom, w których występuje czynna angiogeneza (tj. unaczynienie). Nieproliferujące komórki śródbłonka, takie jak komórki wyściełające dojrzałe naczynie krwionośne, są zasadniczo pozbawione antygenów receptora VEGF i z tego powodu nie są atakowane przez limfocyty CT pobudzone przez szczepionkę. Szczepionka DNA według wynalazku obejmująca sekwencję polinukleotydową funkcjonalnie kodującą białko receptora VEGF, może nasilać aktywację naiwnych limfocytów T, zarówno bezpośrednio jak i pośrednio, przez działanie komórek dendrytycznych. W stosowanym znaczeniu pojęcie odporność oznacza długotrwałą ochronę odpornościową przeciwko zjadliwym formom czynnika w zakaźnego lub antygenowi nowotworowemu. Termin szczepienie odnosi się do profilaktycznej ekspozycji na antygen czynnika chorobotwórczego pochodzącego z niezjadliwego źródła, która powoduje wytworzenie odporności na patogen u traktowanego osobnika. Konstrukt DNA w szczepionce według niniejszego wynalazku korzystnie obejmuje sekwencję nukleotydową kodującą białko receptora VEGF funkcjonalnie powiązaną z elementami regulatorowymi potrzebnymi do ekspresji genu. Nadające się do zastosowania konstrukty DNA korzystnie obejmują elementy regulatorowe konieczne do ekspresji nukleotydów. Takie elementy obejmują, na przykład, promotor, kodon inicjujący, kodon stop i sygnał poliadenylacji. Dodatkowo, często potrzebne są wzmacniacze ekspresji sekwencji kodujących docelowe immunogenne białko. Jak wiadomo w dziedzinie te elementy są korzystnie połączone funkcjonalnie z sekwencją, która koduje żądane białko. Elementy regulatorowe korzystnie są dobrane tak, że działają w gatunkach, którym mają być podawane. W szczepionce genetycznej według niniejszego wynalazku kodony inicjujące i kodony stop są korzystnie włączone jako części sekwencji nukleotydowej, która koduje białko receptora VEGF. Kodony inicjujące i kończące muszą być w ramce z sekwencją kodującą.
6 PL 213 364 B1 Promotory i sygnały poliadenylacji włączone do szczepionki są korzystnie wybrane tak, aby działały w komórkach osobnika poddanego szczepieniu. Przykłady promotorów przydatnych w szczepionce według niniejszego wynalazku, szczególnie w szczepionce genetycznej dla ludzi, obejmują, ale nie wyłącznie, promotory pochodzące z wirusa małpiego (SV40), promotory mysiego wirusa raka sutka (MTTV), ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV), takie jak promotor długich powtórzeń końcowych (LTR) HIV, promotor wirusa Moloney'a, promotor cytomegalowirusa (CMV), taki jak natychmiastowy wczesny promotor cytomegalowirusa, promotor wirusa Epstein Barra (EBV), wirusa mięsaka Rous'a (RSV), jak również promotory z ludzkich genów, takich jak geny ludzkiej aktyny, ludzkiej miozyny, ludzkiej hemoglobiny, ludzkiej kreatyniny mięśniowej i ludzkiej metalotioneiny. Przykłady sygnałów poliadenylacji przydatnych w szczepionce według niniejszego wynalazku, szczególnie w szczepionce genetycznej dla ludzi, obejmują ale nie wyłącznie, sygnały poliadenylacji SV40 i LTR. Oprócz elementów regulatorowych potrzebnych do ekspresji DNA, do cząsteczki DNA można włączyć inne elementy. Takie dodatkowe elementy obejmują wzmacniacze. Wzmacniaczem może być, na przykład, ludzka aktyna, ludzka miozyna, ludzka hemoglobina, ludzka kreatynina mięśniowa i wzmacniacze wirusowe, takie jak pochodzące z CMV, RSV i EBV. Sekwencje i kodony regulatorowe na ogół zależą od gatunku, a zatem w celu zwiększenia wytwarzania białka, korzystnie wybiera się sekwencje regulatorowe I kodony, które mają być skuteczne u gatunków, które mają być immunizowane. Specjalista w dziedzinie może wytworzyć konstrukty DNA, które będą działały u osobnika danego gatunku. DNA w szczepionce według wynalazku jest funkcjonalnie włączone do żywego atentowanego wektora bakteryjnego. Odpowiednie atenuowane żywe wektory bakteryjne obejmują Salmonella typhimurium i Salmonella typhi. Sposoby transformowania żywego wektora bakteryjnego egzogennym konstruktem DNA są dobrze opisane w literaturze. Zobacz, na przykład, Joseph Sambrook i David W. Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, wyd. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nowy York (2001). Szczepionkę DNA według wynalazku można podawać dootrzewnowo, podskórnie, śródskórnie lub zewnętrznie. Szczepionkę według wynalazku stosuje się również, aby doprowadzić do długotrwałego zahamowania proliferacji komórek śródbłonka u pacjenta traktowanego szczepionką Szczepionkę według wynalazku podaje się ssakowi potrzebującemu zahamowania komórek śródbłonka w ilości wystarczającej do wywołania odpowiedzi odpornościowej przeciwko proliferującym komórkom śródbłonka. Korzystnie, ssak traktowany szczepionką według wynalazku jest człowiekiem. Szczepionki według niniejszego wynalazku korzystnie formułuje się z farmaceutycznie dopuszczalnymi nośnikami lub zarobkami takimi jak woda, sól fizjologiczna, dekstroza, glicerol i im podobne i ich kombinacje. Szczepionki mogą również zawierać substancje pomocnicze, takie jak czynniki nawilżające, emulgatory, bufory i im podobne. Szczepionki według niniejszego wynalazku korzystnie podaje się doustnie ssakowi, takiemu jak człowiek, w postaci roztworu lub zawiesiny w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku, ze stężeniem DNA w zakresie od około 1 do około 10 mikrogramów na mililitr. Odpowiednie dawkowanie będzie zależeć od osobnika, który ma być zaszczepiony i w części od praktyki lekarza podającego lub zlecającego podanie szczepionki. Szczepionka według niniejszego wynalazku może być zapakowana do odpowiednich jałowych pojemników, takich jak ampułki, butelki lub fiolki, zarówno w postaci wielodawkowej, jak i pojedynczej. Korzystnie, pojemniki po wypełnieniu ich preparatem szczepionki zamyka się hermetycznie. Korzystnie szczepionki pakuje się do pojemnika z przytwierdzoną do niego etykietą, która identyfikuje szczepionkę oraz zawiera notatkę w postaci wymaganej przez agendę rządową, taką jak United States Food and Drug Administration, potwierdzającą dopuszczenie szczepionki według odpowiednich przepisów prawa, informację o dawkowaniu i tym podobnych. Etykieta korzystnie zawiera informację o szczepionce, która jest przydatna dla personelu służby zdrowia podającego szczepionkę pacjentowi. Korzystnie opakowanie zawiera również wydrukowane materiały informacyjne odnoszące się do podawania szczepionki, instrukcje, wskazania i inne konieczne ostrzeżenia.
PL 213 364 B1 7 Sekwencje aminokwasowe białek receptora VEGF jak i sekwencje kwasów nukleinowych kodujących te białka zostały ujawnione w stanie techniki. Sekwencja kwasu nukleinowego kodująca KDR (fig. 1, SEKW ID Nr:1) i odpowiadająca jej sekwencja białka (fig. 2, SEKW ID Nr:2) zostały opublikowane przez Yu i in., w bazie danych EMBL European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CBlO 1SD, UK (EMBL numer dostępu EMBL:AFO63658). Sekwencja kwasu nukleinowego kodująca Flt-1 (fig. 3, SEKW ID Nr:3) i odpowiadająca jej sekwencja białka (fig. 4, SEKW ID Nr:4) zostały opublikowane przez Yu i in., w bazie danych EMBL European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, UK (EMBL numer dostępu EMBL:AF063657). Sekwencja kwasu nukleinowego kodująca Flk-1 i odpowiadająca jej sekwencja białka zostały opublikowane przez Mathews i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991, 88:9026-9030 a struktury zostały skorygowane przez Quinn'a i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991,90:7533-7537. w. Skorygowaną sekwencję DNA Flk-1 dostarczono na fig. 5 jako SEKW. ID Nr:5, a skorygowaną sekwencję białka Flk-1 dostarczono na fig. 6 jako SEKW. ID Nr:6. Z powodu naturalnej degeneracji kodu genetycznego w praktyce wynalazku można zastosować inne sekwencje DNA kodujące zasadniczo taką samą lub funkcjonalnie równoważną im sekwencję aminokwasową białek receptora VEGF. Takie sekwencje DNA obejmują sekwencje zdolne do hybrydyzacji z sekwencjami receptora VEGF. Korzystnie, funkcjonalnie równoważne homologi DNA białka receptora VEGF mają co najmniej 80% homologii z DNA kodującym wspomniane białka receptora VEGF. Zmienione sekwencje DNA, które można stosować zgodnie z wynalazkiem, obejmują delecje, addycje lub substytucje różnych reszt nukleotydowych, w wyniku których uzyskuje się sekwencje, które kodują taki sam lub funkcjonalnie równoważny produkt genowy. Sam produkt genu może zawierać delecje, addycje lub substytucje reszt aminokwasowych w sekwencjach receptora VEGF, które dają cichą zmianę, wytwarzając funkcjonalnie równoważne białka receptora VEGF. Takie substytucje aminokwasów mogą być dokonane na podstawie podobieństw w polaryzacji, ładunku elektrycznym, rozpuszczalności, hydrofobowości, hydrofilności i/lub amfipatycznej natury zaangażowanych reszt. Na przykład, ujemnie naładowane aminokwasy obejmują kwas asparaginowy i glutaminowy; dodatnio naładowane aminokwasy obejmują lizynę i argininę; aminokwasy z polarnymi grupami głównymi bez ładunku o podobnej wartości hydrofilności obejmują: leucynę, izoleucynę, walinę, glicynę, alaninę, asparaginę, glutaminę, serynę, treoninę, fenyloalaninę, tyrozynę. W znaczeniu tu stosowanym, funkcjonalnie równoważny receptor VEGF odnosi się do receptora, który wiąże VEGF lub jego fragment, ale niekoniecznie z takim samym powinowactwem jak jego naturalne odpowiedniki KDR, Flk-1 lub Flt-1. Sekwencje DNA do szczepionki według wynalazku, można modyfikować technikami inżynierii genetycznej w celu zmiany sekwencji kodującej receptor VEGF dla różnych końców, w tym, ale nie wyłącznie zmiany, które modyfikują obróbkę i ekspresję produktu genowego. Na przykład, mutacje można wprowadzać stosując techniki dobrze znane w tej dziedzinie, np. ukierunkowaną mutagenezę, insercję nowych miejsc restrykcji, zmianę wzorca glikozylacji, fosforylację itd. Mysia Flk-1 (SEKW ID Nr:6) posiada około 85% homologii z ludzką KDR (SEKW ID Nr:2) i odgrywa analogiczną rolę w fizjologii myszy jak KDR u człowieka. Rzeczywiście, VEGFR-2 określa się często jako KDR/Flk-1, odnosząc się do bliskiej analogii pomiędzy dwoma homologami receptora VEGF. Z tego powodu, traktowanie myszy szczepionką DNA według wynalazku, kodującą Flk-1 (np. DNA SEKW. ID Nr:5) wybrano jako odpowiedni model dla ludzkiej szczepionki DNA kodującej KDR. Poniższe przykłady dalej ilustrują cechy i wykonania niniejszego wynalazku i nie należy ich rozumieć jako jego ograniczenie. Materiały, Sposoby i Przykłady Materiały. Myszy C57/BL/6J i Balb/C pozyskano z zakładu hodowlanego Scripps Research Institute. Wszystkie linie mysich komórek nowotworowych zastosowane do oceny, obejmujące linię komórkową czerniaka B16 i linię komórkową raka jelita grubego CT26 uzyskano od Dr I. J. Fidler, MD Anderson Cancer Center, Houston, TX. Linię komórkową mysiego raka płuc Lewis'a D121 uzyskano od Dr Lea Eisenbach, Weizmann Institute, Rehovot, Izrael. DNA kodujący Flk-1 dostarczono dzięki uprzejmości Dr Lemischka (Princeton, University, Princeton, NJ) i sklonowano do eukariotycznego wektora ekspresyjnego pcdna3.1 dostarczonego przez Invitrogen, Huntsville, Alabama, z wykorzystaniem miejsc restrykcyjnych Kpnl i Xbal. Atenuowany szczep Salmonella typhimurium został dostarczony przez B.A.D. Stocker (Stanford University, Stanford, CA). Przeciwciała uzyskano od BD Biosciences, Bedford, MA. Suplement hodowli T-STIM uzyskano od BD Biosciences, Bedford, MA. Izotiocyjanian fluoresceiny (FITC) i R-fikoerytrynę
8 PL 213 364 B1 (PE) uzyskano od Molecular, Probes, Eugene, OR. Przeciwciała znakowane FITC i znakowane PE przygotowano zgodnie z protokołami zalecanymi przez producenta. P r z y k ł a d 1. Wytwarzanie szczepionki DNA kodującej Flk-1 Wektor pcdna3.1 zawierający DNA Flk-1 (SEKW. ID Nr: 5; około 10 pg do około 0,1 µg pdna) elektroporowano do świeżo przygotowanej, atenuowanej Salmonella typhimurium, stosując pulser Bio- Rad z 2,5 kv, 25 µf i 200 omów zgodnie z procedurami zalecanymi przez producenta. Salmonella zawierającą wektor selekcjonowano na płytkach zawierających ampicylinę. Kolonie pobierano następnego dnia i hodowano przez noc w bulionie LB (EM Science, Gibbstown, NJ) z dodatkiem ampicyliny. Bakterie izolowano i płukano w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS). Wypłukane bakterie zawieszano następnie w podłożu PBS w stężeniu około 1 x 10 9 rekombinowanej Salmonella na mililitr PBS, w celu wytworzenia roztworu szczepionki do późniejszego stosowania. Do czasu zastosowania szczepionkę przechowywano w zatopionych ampułkach. Szczepionkę kontrolną składającą się z Salmonella typhimurium transformowanej samym wektorem pcd- NA3.1 (bez DNA Flk-1) wytworzono według tej samej procedury. DNA plazmidowe przechowywano w temperaturze około -80 C przed stransformowaniem Salmonella. P r z y k ł a d 2. Szczepienie myszy szczepionką DNA kodującą Flk-1 Myszy Balb/C (około 6 myszy w każdej traktowanej grupie) szczepiono szczepionką DNA z przykładu 1 (około 1 x 10 8 rekombinowanych Salmonella w około 100 µl PBS) drogą doustną, trzykrotnie z odstępem dwóch tygodni. Kolejna grupa myszy była szczepiona kontrolną szczepionką (składającą się z atenuowanej Salmonella zawierającej pusty wektor) zgodnie z tym samym schematem, jak myszy szczepione szczepionką według wynalazku. P r z y k ł a d 3. Ocena odporności na nowotwór u szczepionych myszy Około dwóch tygodni po trzecim szczepieniu, myszy Balb/C z przykładu 2 (około 6 myszy w traktowanej grupie) prowokowano około 1 x 10 5 komórek czerniaka B16 (podskórnie), około 1 x 10 5 komórek raka płuc Lewis'a D121 (podskórnie), albo około 7,5 x 10 4 komórek raka jelita grubego CT26 (dożylnie). Podskórne guzy płuc Lewis'a usuwano chirurgicznie po około dwóch tygodniach wzrostu, aby umożliwić samoistny rozsiew do płuc. Wzrost guzów podskórnych mierzono co drugi dzień w dwóch wymiarach, a objętość każdego guza obliczano według wzoru: Objętość= (szerokość 2 ) (dlugość 2). Liczbę samoistnych przerzutów D121 do płuc oceniano około 30 dni po usunięciu pierwotnego guza podskórnego. Myszy zabijano i przeprowadzano sekcję, a obciążenie płuc nowotworem oceniano w odniesieniu do powierzchni płuca zajętej przez nowotwór, w skali: 0 dla braku nowotworu, 1 dla zmian nowotworowych zajmujących mniej niż 20%, 2 dla zmian zajmujących od około 20 do około 30% i 3 dla zmian zajmujących więcej niż 50%. Na fig. 7 przedstawiono obraz płuc trzech myszy sprowokowanych komórkami raka płuc Lewis'a D121. Niższe płuco oceniono na 1, podczas gdy oba wyższe oceniono na 3, jako mające znaczny obszar płuc zajęty przez nowotwór. Zwierzęta, które zeszły przed 30 dniem oceny otrzymywały wynik +. Wyniki tych badań przedstawiono w tabelach 1-4 i na fig. 8-10 i omówiono w szczegółach poniżej. T a b e l a 1. Przerzuty nowotworowe u myszy Balb/C prowokowanych komórkami raka płuc Lewis'a D121 Grupa szczepionych myszy Wyniki przerzutów Kontrola - szczepione nietransformowaną 3,3,3,3,+,+ Salmonella Kontrola - szczepione kontrolną szcze- 3,3,3,3,+,+ pionką (zawierająca pusty wektor) Szczepione szczepionką DNA z przykładu 1 0,0,1,1,1,2,2 (zawierającą Flk-1) Myszy Balb/C, które prowokowano przez dożylną iniekcję komórek raka jelita grubego CT-26, oceniano pod względem śmiertelności przez okres około 63 dni (7 tygodni). Dane o śmiertelności przedstawiono w tabeli 2 poniżej i graficznie zilustrowano na fig. 8. Na fig. 8, % przeżycia myszy traktowanych szczepionką według wynalazku z przykładu 1 wskazano grubą linią ciągłą przy 100% przeżyciu. % przeżycia myszy naiwnych (nieszczepionych) prowokowanych komórkami C26 wskazano cienką, ciągłą linią, natomiast % przeżycia myszy traktowanych szczepionka kontrolną (bez DNA Flk-1)wskazano linią przerywaną.
PL 213 364 B1 9 T a b e l a 2. Zahamowanie śmiertelności u myszy Balb/C immunizowanych szczepionką z przykładu 1 i prowokowanych rakiem CT 26 Traktowanie % przeżycia w % przeżycia w % przeżycia w 30 dniu 36 dniu 63 dniu Kontrola, bezszczepionki 50 0 0 Szczepionka kontrolna 33 0 0 Szczepionka z przykł. 1 100 100 100 Zahamowanie wzrostu pierwotnego (podskórnego) guza u myszy Balb/C prowokowanych D121 oceniano przez określenie objętości pierwotnego guza 14 dni po prowokacji. Wynik przedstawiono w tabeli 3 poniżej i zilustrowano graficznie na fig. 9. Na fig. 9, pierwszy słupek, oznakowany PBS, wskazuje myszy nieszczepione (naiwne), środkowy słupek, oznakowany pusty wektor, wskazuje myszy traktowane szczepionką kontrolną,a trzeci słupek oznakowany pcdna3.1-flk-1", oznacza myszy szczepione szczepionką według wynalazku z przykładu 1. T a b e l a 3. Zahamowanie podskórnego guza rakowego D121 u myszy Balb/C immunizowanych szczepionką z przykładu 1 Traktowanie Objętość guza mm 3 Odchylenie mm 3 standardowe Kontrola, bez szczepionki 665 227 Kontrolna szczepionka 641 157 Szczepionka z przykł. 1 183 35 Zahamowanie wzrostu podskórnego guza czerniaka B16 oceniano przez monitorowanie objętości podskórnego guza w okresie około 17 dni po prowokacji. Wyniki przedstawiono poniżej w tabeli 4 i zilustrowano graficznie na fig. 10. Na fig. 10, dane o średniej objętości guza oznaczone ( ) odpowiadają myszom immunizowanym szczepionką według wynalazku z przykładu 1, podczas gdy dane oznaczone (0) wskazują myszy traktowane kontrolną szczepionką. T a b e l a 4. Zahamowanie podskórnego guza czerniaka B16 u myszy Balb/C immunizowanych szczepionką z przykładu I Objętość guza (mm 3 ) w dniu Traktowanie 0 9 14 17 Szczepionka kontrolna 0 907 1273 4213 Szczepionka z przykł.1 0 447 462 1063 % zahamowania guza ---- 51% 64% 75% P r z y k ł a d 4. Zwiększenie ilości markerów pobudzenia CD25, CD69 i CD2 na splenocytach (limfocytach CD8+) od szczepionych myszy Myszy C5/7BL/6J (około 4 na traktowaną grupę) szczepiono szczepionką DNA z przykładu 1 i kontrolną szczepionką (bez Flk-1), jak opisano w przykładzie 2. Splenocyty izolowano od immunizowanych myszy i od myszy z grupy kontrolnej około sześć tygodni po trzecim szczepieniu. Splenocyty hodowano przez 24 godziny razem z komórkami z linii komórkowej czerniaka B16 poddawanymi transdukcji powodującej wyrażanie Flk-1 i z nietransformowanymi komórkami linii B16 w podłożu dla limfocytów T (około 5 ml na hodowlę) zawierającym 4% objętościowych suplementu hodowli T-STIM (Kat. #354115, BD Bioscience, Bedford, MA). Następnie komórki barwiono przeciwciałem przeciwko CD8+ skoniugowanym z FITC i przeciwciałami przeciwko CD25, CD69 i CD2 skoniugowanymi z PE. Zawiesinę komórkową oceniano za pomocą skanera FAC Becton Dickenson, w celu określenia odsetka limfocytów T CD8+ dodatnich pod względem CD25 i CD69 dla każdej kombinacji splenocyt/komórka czerniaka B16. Wyniki przedstawiono w tabeli 5 i graficznie zilustrowano na fig. 11.
10 PL 213 364 B1 T a b e l a 5. Zwiększenie markerów pobudzenia CD25, CD69 i CD2 w splenocytach od szczepionych myszy. % komórek CD25 % komórek CD69 komórki CD2 dodatnie Traktowanie dodatnich dodatnich średnia fluorescencyjna Szczepionka kontrolna +komórki B16-Flk-1 9 18 570 mfu Szczepionka DNA + komórki B16 12 29 550 mfu Szczepionka DNA + komórki B16-Flk01 21 35 700 mfu komórki B16-Flk-1 mfu = jednostki średniej fluorescencji. Wyniki dostarczone w tabelach 1-5 i fig. 8-11 pokazują, że szczepionka DNA z przykładu 1 zawierająca DNA kodujący Flk-1, mysi analog KDR, może skutecznie uodparniać myszy przeciwko różnym komórkom rakowym tworzącym guzy. Jakkolwiek nie zamierzamy wiązać się żadną teorią, można przyjąć, że szczepionka działa przez zahamowanie angiogenezy w guzie, tj. zapobiega tworzeniu się nowych naczyń krwionośnych i skutecznie głodzi nowotwór. Dane z tabeli 1 pokazują, iż szczepionka według wynalazku z przykładu 1 prowadzi do powstrzymania rozsiewu guza do płuc u myszy z prowokowanych rakiem płuc Lewis'a D121. Żadna z myszy immunizowanych szczepionką z przykładu 1 nie zeszła i wszystkie miały mniej niż około 50% zajęcia płuc przez nowotwór (2 miały <20%). W przeciwieństwie do nich, w każdej z grup kontrolnych zeszły dwie myszy, a wszystkie pozostałe miały ponad 50% zajęcie płuc przez nowotwór. Szczepionka według wynalazku z przykładu 1 również istotnie obniżyła śmiertelność myszy Balb/C, które prowokowano dożylnie komórkami raka jelita grubego CT-26, jak pokazują dane w tabeli 2 i fig. 8. Wszystkie myszy immunizowane szczepionką z przykładu 1 przeżyły cały 63 dniowy okres obserwacji po prowokacji. Jednak, w grupach kontrolnych wszystkie myszy zeszły do 36 dnia po prowokacji. Jak pokazują dane z tabeli 3 i fig. 9, wzrost podskórnego guza raka płuc Lewis'a D121 został zahamowany przez immunizację szczepionką według wynalazku z przykładu 1 w stopniu około 4,3 do około 4,5-krotnym, w odniesieniu do grup myszy kontrolnych, którym nie podawano szczepionki lub traktowano szczepionką kontrolną. Podobnie, jak pokazano w tabeli 4 i fig. 10, wzrost podskórnego guza czerniaka B16 został zahamowany w stopniu około 4-krotnym u myszy immunizowanych szczepionką według wynalazku z przykładu 1, w odniesieniu do wzrostu guza w grupie kontrolnej. Dane w tabeli 5 i fig. 11 pokazują, że splenocyty izolowane od myszy C57/BL/6J szczepionych szczepionką DNA z przykładu 1, wykazały wzrost markerów pobudzenia CD2, CD25 i CD69, w odniesieniu do grupy kontrolnej, podczas hodowli z komórkami czerniaka B16 transformowanymi, aby prezentować antygen Flk-1. Zastrzeżenia patentowe 1. Szczepionka DNA do skutecznego wywoływania odpowiedzi odpornościowej przeciwko proliferującym komórkom śródbłonka, znamienna tym, że obejmuje konstrukt DNA funkcjonalnie kodujący białko receptora VEGF w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku, przy czym białko receptora VEGF jest białkiem wybranym z grupy składającej się z VEGFR-2 mającego sekwencję z SEKW. ID. Nr:2, Flk-1 mającego sekwencję z SEKW. ID. Nr:6 i receptora, który wiąże się z VEGF lub jego fragmentami i który ma sekwencję, wykazującą co najmniej 80% homologii z sekwencją z SEKW. ID. Nr:2 lub 6, a konstrukt DNA jest funkcjonalnie wprowadzony do atenuowanego wektora Salmonella typhimurium lub Salmonella typhi. 2. Szczepionka DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że konstrukt DNA jest zasadniczo czystym DNA o sekwencji polinukleotydowej wybranej z grupy składającej się z SEKW. ID. Nr:1 i SEKW. ID. Nr:5 i sekwencji polinukleotydowej, która ma z nimi co najmniej 80% homologii i koduje receptor, który wiąże się z VEGF lub jego fragmentami.
PL 213 364 B1 11 3. Zastosowanie konstruktu DNA funkcjonalnie kodującego białko receptora VEGF i farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika do wytwarzania szczepionki DNA do hamowania wzrostu nowotworu u ssaka, przy czym immunologicznie skuteczna ilość szczepionki DNA, która ma być podawana doustnie ssakowi, dzięki czemu ssak wykazuje odpowiedź odpornościową wywołaną przez szczepionkę i swoistą wobec proliferujących komórek śródbłonka, powoduje zatrzymanie wzrostu nowotworu, zmniejszenie jego wielkości lub zahamowanie rozsiewu nowotworu, a białko receptora VEGF jest wybrane z grupy składającej się z VEGFR-2 mającego sekwencję z SEKW. ID. Nr:2, Flk-1 mającego sekwencję z SEKW. ID. Nr:6 i receptora, który wiąże się z VEGF lub jego fragmentami i który ma sekwencję wykazującą co najmniej 80% homologii z sekwencją z SEKW. ID. Nr:2 lub 6, a konstrukt DNA jest funkcjonalnie wprowadzony do atenuowanego wektora Salmonella typhimurium lub Salmonella typhi. 4. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że ssakiem jest człowiek.
12 PL 213 364 B1
PL 213 364 B1 13
14 PL 213 364 B1
PL 213 364 B1 15
16 PL 213 364 B1
PL 213 364 B1 17
18 PL 213 364 B1
PL 213 364 B1 19
20 PL 213 364 B1
PL 213 364 B1 21
22 PL 213 364 B1
PL 213 364 B1 23
24 PL 213 364 B1
PL 213 364 B1 25
26 PL 213 364 B1 Rysunki
PL 213 364 B1 27
28 PL 213 364 B1
PL 213 364 B1 29
30 PL 213 364 B1
PL 213 364 B1 31
32 PL 213 364 B1
PL 213 364 B1 33
34 PL 213 364 B1
PL 213 364 B1 35
36 PL 213 364 B1
PL 213 364 B1 37
38 PL 213 364 B1
PL 213 364 B1 39
40 PL 213 364 B1 Departament Wydawnictw UP RP Cena 7,38 zł (w tym 23% VAT)