Ćw. 11 wersja testowa Wyznaczanie odległości krytycznej R 0 rezonansowego przeniesienia energii (FRET) Wstęp W wyniku absorpcji promieniowania elektromagnetycznego o odpowiedniej długości fali (najczęściej z zakresu nadfioletu lub promieniowania widzialnego, rzadziej bliskiej podczerwieni) cząsteczka zostaje wzbudzona do jej najniższego wzbudzonego stanu S 1 (w przypadku wzbudzenia do wyższych stanów S n, szybki proces (k IC 10 12 s - 1 ) bezpromienistej dezaktywacji prowadzi najczęściej do obsadzenia stanu S 1 ). Cząsteczka znajdująca się w najniższym singletowym stanie wzbudzonym może tracić energię w wyniku pięciu głównych procesów dezaktywacji, przedstawionych na diagramie Jabłońskiego. W zjawisku przeniesienia energii, niezmiernie ważnym w fotochemii, wzbudzona cząsteczka donora * przechodzi w stan podstawowy z jednoczesnym przeniesieniem energii wzbudzenia elektronowego na cząsteczkę akceptora (lub wygaszacza ), która tym samym ulega wzbudzeniu [ 1 ]: + + (5) Należy tu podkreślić, że akceptor może już być w stanie wzbudzonym, tak jak to się dzieje w procesie anihilacji tryplet-tryplet (patrz rozdział I.3.1.5.) Przekazywanie energii przejawia się zanikiem emisji (lub reakcji fotochemicznej) związanej z * i zastąpieniem jej emisją (lub reakcją fotochemiczną) charakterystyczną dla *. Tak więc wzbudzeniu ulega, mimo iż światło absorbowane jest przez [1]. Podstawowe mechanizmy przekazywania energii elektronowej zostały schematycznie przedstawione na rys. 1. [1] F. Wilkinson, Adv. Photochem., 3 (1964) 241
przenoszenie energii promieniste bezpromieniste oddziaływania kulombowskie wymienne oddziaływania elektronowe Rys. 1. Podstawowe rnechanizmy przenoszenia energii elektronowej Promieniste (radiacyjne) przekazywanie energii polega na zaabsorbowaniu przez akceptor fotonów wyemitowanych przez donor: + hv (6) hv + (7) Przekazywanie energii w taki sposób może oczywiście zachodzić na znaczne odległości; fotochemiczne i fotobiologiczne przemiany zachodzące na Ziemi pod wpływem światła słonecznego stanowią skrajny przykład promienistego przekazywania energii na duże odległości. Bezpromieniste przenoszenie energii wywołane oddziaływaniami kulombowskimi jest również procesem dalekiego zasięgu, tzn. zachodzi na odległości (~ 5 nm) znacznie przekraczające rozmiary cząsteczki. echanizm wymiany elektronów wymaga mniejszych odległości (ok. 1 1,5 nm), ale nie wymaga bezpośredniego kontaktu cząsteczek donora i akceptora [1]. Jeżeli cząsteczka, wygaszacza ma stan wzbudzony * o energii niższej niż energia stanu *, to energia wzbudzenia może zostać przeniesiona na sposób bezpromienisty zgodnie z uproszczonym schematem przedstawionym w równaniu (5) [11]. Znane są dwa główne procesy (mechanizmy) bezpromienistego przenoszenia
energii [11]: mechanizm wymienny (Dextera) [ 2 ] oraz mechanizm rezonansowy (Förstera) [ 3, 4 ]. Na rysunku 2, na prostym schemacie orbitali, zilustrowano proces równoczesnej wymiany elektronu pomiędzy wzbudzoną cząsteczką * i cząsteczką w stanie podstawowym (wg mechanizmu Dextera). Należy w tym miejscu zaznaczyć, iż oba procesy przeniesienia elektronu są równoczesne, zarówno jak i pozostają w trakcie wymiany elektronów cząsteczkami obojętnymi i nie obserwuje się tworzenia jonów jako tworów przejściowych. Takie podwójne przeniesienie elektronu wymaga przestrzennego nakrywania się orbitali, dlatego cząsteczki * i muszą być w bliskim kontakcie (zderzenie cząsteczek). [2] D.L. Dexter, J. Chem. Phys., 21 (1953) 836. [3] A.A. Lamola, Energy Transfer and Organic Photochemistry, Lamola, A.A. and Turro, N.J. (Editors), Interscience, New York, 1969 [4] F. Scandola, V. Balzani, J. Chem. Educ., 60 (1983) 814
E e e 3 * 3 * + + Rys. 2. echanizm Dextera przenoszenia energii w wyniku równoczesnej wymiany elektronu (tzw. orbitale HOO (Highest Occupied olecular Orbital) i LUO (Lowest Unoccupied olecular Orbital) wygaszacza muszą się mieścić pomiędzy orbitalami HOO i LUO donora energii ). E oddziaływanie kulombowskie 3 * 3 * + + Rys. 2a. echanizm Förstera przenoszenia energii w wyniku oddziaływań kulombowskich (dipol-dipol) pomiędzy cząsteczkami i. Proces ten nie wymaga bliskiego kontaktu obu cząsteczek, i może niekiedy zachodzić na odległość do 100 Å.
Chociaż przy wymianie elektronu całkowita kwantowa liczba spinowa układu * / musi być zachowana, to w wygaszaniu luminescencji mogą uczestniczyć stany zarówno singletowe, jak i trypletowe w dowolnej kombinacji: 1 1 + + (8) 3 3 + + (9) Oddziaływanie dipol-dipol (mechanizm Förstera): W tym przypadku mechanizm wygaszania polega na oddziaływaniu dipolowych momentów przejść * i * obu cząsteczek. W uproszczony sposób przedstawia to rys. 2a. Przejściu wzbudzonego elektronu w cząsteczce na niższy orbital towarzyszy zmiana momentu dipolowego, w wyniku której powstaje pole elektryczne proporcjonalne do dipolowego momentu przejścia i odwrotnie proporcjonalne do trzeciej potęgi odległości. A zatem elektron w cząsteczce doznaje działania siły proporcjonalnej do /r 3 i przechodząc na wyższy orbital, wytwarza swoje własne pole elektryczne, które z kolei działa na elektron w cząsteczce *. W ten sposób ruch elektronu w dół (na skali energii) w cząsteczce * i ruch elektronu w górę w cząsteczce są wzajemnie sprzężone przez ich pola elektryczne; stała szybkości przenoszenia energii jest równa 2 cφek dν k q = f 4 6 D ( ν ) ε A ( ν ) 4 (10) n τr ν 0 Ze wzoru tego wynika kilka ważnych cech procesu wygaszania [11]: 1. Zależność od odległości jak r -6. Wynika to ze sprzężenia ruchu elektronów w trakcie przejść * i *. Jest to stosunkowo łagodna zależność od odległości w porównaniu z wykładniczym spadkiem przekrywania orbitali w mechanizmie wymiany elektronów (mechanizm Dextera przenoszenia energii). Oddziaływanie dipol-dipol może działać niekiedy na odległość do około 100 Å. 2. Zależność od wydajności kwantowej emisji donora energii, φ e. Jest ona związana z wielkością momentu przejścia *.
3. Zależność od czasu życia stanu wzbudzonego donora * ; prawdopodobieństwo przeniesienia energii jest proporcjonalne do czasu życia, gdyż dezaktywacja * konkuruje z procesem przenoszenia energii. 4. Warunek nakrywania się widm emisji i absorpcji. Zgodnie z prawem zachowania energii proces przenoszenia energii będzie najbardziej wydajny wtedy, gdy przejścia * i * są izoenergetyczne. Wielkość k jest czynnikiem orientacyjnym, który uwzględnia kąt, jaki tworzą momenty przejść obu cząsteczek. Dla przypadkowego rozkładu jest on równy 2/3. Wykonanie ćwiczenia Celem ćwiczenia jest wyznaczenie tzw. odległości krytycznej R 0, tzn. odległości, dla której prawdopodobieństwo przeniesienia energii równe jest prawdopodobieństwu zajścia pozostałych procesów dezaktywacji wzbudzonej cząsteczki donora (D). Odległość ta wyznaczona zostanie z tzw. całki nakrywania wzajemnie znormalizowanych (zgodnie z wzorem Forstera) widm fluorescencji donora i absorpcji akceptora (A), zgodnie z równaniem 10 i 11: (11)
2,5 2,0 widmo abs. perylenu widmo fluorescencji DFA 1,5 Abs. 1,0 0,5 0,0 300 350 400 450 500 550 600 nm Rys. 3. Widma absorpcji A (terylen) i fluorescencji D (DFA). W tym celu należy: 1. Przygotować roztwory DFA (difenyloantracen) i perylenu o stężeniu ok. 10-4 mol/dm 3 w cykloheksanie. 2. Zarejestrować widma absorpcji przygotowanych roztworów w zakresie 300-600 nm używając czystego cykloheksanu jako roztworu odniesienia. Zapisać pliki w formacie ASCII na dyskietce. 3. Zarejestrować widma fluorescencji przygotowanych roztworów donora i akceptora energii. Zaproponować dł. fali wzbudzenia oraz zakres spektralny pomiaru widm. Zapisać pliki w formacie ASCII na dyskietce. 4. Zarejestrowane widma fluorescencji donora (DFA) i absorpcji akceptora (perylen) przenieść do dostarczonego przez prowadzącego ćwiczenie asystenta arkusza S Excel (plik FRET_TP.xls), w celu wykonania odpowiednich obliczeń odl. krytycznej R 0. Arkusz ten wykonuje automatycznie obliczenie zgodnie z równaniem 11.