Pracownia Biologii Molekularnej Część II Ekspresja i oczyszczanie białek Spis treści 1 Wstęp 2 Obiekt 3 Namnażanie białka w komórkach bakterii Escherichia Coli 3.1 Pożywki do hodowli 3.2 Rozwój hodowli bakteryjnych 3.3 Ekspresja w systemie T7 4 Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym białek w warunkach denaturujących 4.1 Wiadomości podstawowe 4.2 Rola niektórych odczynników stosowanych w elektroforezie denaturującej 5 Oczyszczanie bialek metodą chromatografii powinowactwa do unieruchomionych jonów metali (IMAC, Immobilised Metal Affinity Chromatography) 5.1 Rola imidazolu 5.2 Wydajność oczyszczania dodatkowo podnoszą: 6 znaczanie zawartości i stężenia białek w próbkach 6.1 Metoda Melanii Bradford 6.2 Metoda spektroskopowa Wstęp Celem II części Pracowni Biologii Molekularnej jest zapoznanie się z pełną procedurą uzyskiwania i oczyszczania białek. Zajęcia są podzielone na trzy etapy: 1. 2. 3. ekspresja białka w bakteriach Escherichia coli, oczyszczanie, ocena czystości i stężenia uzyskanego produktu. Podstawą zaliczenia Pracowni są wypełnione karty problemowe, sprawdzające wiedzę studentów niezbędną do wykonania ćwiczeń oraz karta wynikowa podsumowująca wykonane eksperymenty. Obiekt Obiektem, który będziemy eksprymować w bakteriach, izolować i oczyszczać jest wybrane białko z dołączoną 6-ścio histydynową etykietą umożliwiającą oczyszczanie na kolumnie powinowactwa do jonów niklu.
Namnażanie białka w komórkach bakterii Escherichia Coli Celem pierwszej części ćwiczenia jest namnożenie białka w komórkach bakteryjnych E. coli. W tym celu zostaną przygotowane pożywki (płynna LB i stała LB+agar) zawierające antybiotyk. Hodowane na nich bakterie E. coli zawierają plazmid białka z genem oporności na ampicylinę. Pożywki do hodowli Do płynnej hodowli bakteryjnej zastosowana zostanie pożywka LB Broth (firmy Biocorp) zawierająca chlorek sodu zapewniający odpowiednie stężenie elektrolitów, ekstrakt drożdżowy i Trypton, które są źródłem związków chemicznych umożliwiających prawidłowy i stosukowo szybki wzrost kultur bakteryjnych E. coli. W przypadku hodowli stałych dodatkowo dodany zostanie agar, wielocukier, który w temperaturze pokojowej polimeryzuje tworząc żel. Wysterylizowaną pożywkę stałą przechowujemy w lodówce rozgrzewając przed wylaniem na szalki. Zarówno do hodowli płynnej jak i stałej zostanie dodana ampicylina umożliwiająca wybiórczy wzrost bakterii zawierających gen oporności na ten antybiotyk. Dzięki temu następuje zahamowanie wzrostu bakterii niezawierających genu oporności, a tym samym plazmidu białka. Przygotowane pożywki będą sterylizowane przez asystenta parą wodną w autoklawie. Rozwój hodowli bakteryjnych Wzrost bakterii zawierających plazmid wybranego białka będzie następował w trzech etapach: 1. 2. 3. Hodowla na pożywce Hodowla nocna w pożywce płynnej Hodowla dzienna w pożywce Kontrola wzrostu bakterii w pożywce płynnej w 3-cim etapie pracy będzie się odbywać poprzez pomiar absorpcji hodowli w kuwecie przy długości fali 600 nm Ekspresja w systemie T7 Wektory ekspresyjne zawierające gen wybranego białka są wprowadzane do bakterii w procesie transformacji. Umieszczenie dodatkowo genu oporności na antybiotyk umożliwia wyselekcjonowanie bakterii zawierających transformowany plazmid. Istnieje kilka typów systemów ekspresyjnych, a wśród nich system T7, w którym wektor ekspresyjny prset został zastosowany w celu ekspresji wybranego białka w E. coli. System ekspresji T7 uruchamiany jest przez dodanie do pożywki induktora izopropylo-β-d-1- tiogalaktopiranozydu (IPTG) w momencie gdy bakterie osiągną odpowiednią fazę wzrostu (log). IPTG, po dostaniu się do środka komórek bakterii, wiąże się do represora laktozowego, powodując
jego inaktywację. Powoduje to uruchomienie produkcji polimerazy RNA z faga T7, a następnie eksprymowanego białka. Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym białek w warunkach denaturujących Wiadomości podstawowe Do oceniania masy i zawartości zanieczyszczeń w próbce białek lub kwasów nukleinowych stosuje się techniki elektroforetyczne wykorzystujące właściwość rozdzielania naładowanych składników mieszanin pod wpływem pola elektrycznego w specjalnie przygotowanych żelach poliakryloamidowych lub agarozowych. Żele pełnią rolę sita molekularnego przez które, dzięki przyłożonemu polu elektrycznemu cząsteczki migrują z szybkością zależną od ich wielkości, kształtu i ładunku. W zależności od konkretnego problemu można zastosować różne rodzaje elektroforezy, w tym elektroforezę denaturująca (SDS-PAGE, SDS-polyacrylamide gel elektrophoresis). Dodajemy wtedy do próbki białka siarczan dodecylu sodu (SDS) silny detergent anionowy, który rozbija cząsteczki białka na podjednostki, opłaszcza je, nadając formę liniową i silny ujemny ładunek, niezależny od ładunku cząsteczki w stanie natywnym. Szybkość migracji w żelu w obecności SDS zależy głównie od wielkości cząsteczki białka. Pod wpływem przyłożonego napięcia w granicach 100 300 V cząsteczki mieszaniny ulegają rozdziałowi, po którym są lokalizowane poprzez barwienie (np. solami srebra, kumasyną, bromkiem etydyny) i identyfikowane przy użyciu odpowiedniej metody detekcji. Celem ćwiczenia jest wykonanie denaturującej elektroforezy białkowej (SDS-PAGE) z zastosowaniem żeli poliakryloamidowych tworzonych dzięki polimeryzacji monomerów akryloamidowych w długie łańcuchy, które następnie są łączone kowalencyjnie przez N,N -metyleno-bisakrylamid. Proces ten zachodzi w obecności nadsiarczanu amonu (APS) i tetrametyloetylenodiaminy (TEMED). Uwaga! Przy przygotowywaniu żeli należy zachować szczególna ostrożność ponieważ akryloamidy używane do ich przygotowania są neurotoksyczne. Należy pracować w rękawiczkach, pod wyciągiem, uważając aby nie rozlać mieszaniny akryloamidu z N,N -metyleno-bisakrylamidem. Unikać kontaktu ze skórą i błonami śluzowymi. Wielkość porów zależy od stężenia akryloamidu. Przyjęto konwencję w której żele są nazywane w zależności od stężenia procentowego całkowitej ilości akryloamidu i bis-akryloamidu [%T]. Stęzenie procentowe wskazuje jaka jest względna wielkość porów. Wielkość porów zmniejsza się wraz ze zwiększaniem stężenia akryloamidów. W ćwiczeniu zastosujemy nieciągły gradient stężenia żelu, mianowicie układ będzie składał się z dwóch żeli 4%-ego ściągającego (żel górny, który koncentruje nakładaną próbkę w cienkie pasmo) i 12%-ego separującego (żel dolny, w którym następuje rozdział białek w zależności od ich masy).
Rola niektórych odczynników stosowanych w elektroforezie denaturującej W typowej elektroforezie denaturującej znajdują zastosowanie następujące odczynniki: bufory o określonym ph, utrzymujące ładunek cząsteczek białka i umożliwiające ich stała migrację w kierunku elektrody, aż do zakończenia elektroforezy, siarczan dodecylu sodu (SDS) detergent anionowy o ujemnym ładunku w szerokim zakresie ph rozbijajacy białka złożone na podjednostki i nadający mu silny ładunek ujemny, 2-merkaptoetanol lub ditiotreitol (DTT) silne reduktory rozrywające wiązania dwusiarczkowe, glicerol zagęszczajscy próbki, co zapobiega ich dyfuzji w czasie nakładania do studzienek, błekit bromofenolowy zabarwiający próbkę białka, kumazyna (Coomassie Brilliant Blue R250, CBB) barwnik stosowany do zabarwiania żelu po zakończeniu elektroforezy, żel ściągający 4.0 % i separujący 12.0%. Oczyszczanie bialek metodą chromatografii powinowactwa do unieruchomionych jonów metali (IMAC, Immobilised Metal Affinity Chromatography) Chromatografia powinowactwa do unieruchomionych jonów metali (tu: niklu) jest jedną z najprostrzych jednoetapowych metod oczyszczania białek, przy zastosowaniu której, szczególnie w przypadku białek w formie zdenaturowanej, uzyskuje się próbki o wysokiej czystości. Jony niklu są stabilizowane i silnie wiązane ze złożem za pomocą mostka zbudowanego z cząsteczek kwasu nitrylooctowego (NTA). Umożliwia to związanie białka z ogonem histydynowym do niklu i dalej złoża. Po związaniu bialka wymywa się zanieczyszczenia, które nie związały sięz niklem. Ostatnim etapem jest wymycie białka za pomocą buforu do elucji zawierającego imidazol, w którym, pod wpływem konkurencji o miejsce wiązania pomiędzy histydyną a imidazolem, białko odczepia się od kolumny. Procedura umożliwia oczyszczenie białka do stanu 95% homogenności w jednym etapie. Kolumna Ni- NTA jest wypełniona złożem zawierającym Ni-NTA połaczonym z sefarozą. Jest stabilna i łatwa do przechowywania. W ćwiczeniu wykorzystamy kolumienki wirownicze umożliwiające oczyszczenie do 150 μg białka z lizatu komórkowego z wykorzystaniem mikrowirówki. Procedura oczyszczania białek metodą powinowactwa do unieruchomionych jonów metali składa się z następujących etapów: 1. Nałożenie białka na kolumnę zawierającą złoże połączone z Ni-NTA. 2. Odseparowanie białka oczyszczonego od zanieczyszczeń niespecyficznie związanych ze złożem, poprzez przemycie buforem zawierającym imidazol o stężeniu około 20 mm. 3. Wymycie właściwego białka buforem do elucji zawierającym imidazol o stężeniu 250 mm.
Rola imidazolu Pierścień imidazolowy jest fragmentem histydyny, która wiąże się na kolumnie do unieruchomionego jonu niklu. Imidazol konkuruje z histydyną i w niewielkim stężeniu powoduje odłączanie niespecyficznie związanych ze złożem białek. Przy niskim stężeniu imidazolu białko z ogonem sześciohistydynowym nadal pozostaje przyłączone do kolumny. Dopiero znacznie podwyższone stężenie imidazolu powoduje odłączenie białka będącego obiektem oczyszczania. Wydajność oczyszczania dodatkowo podnoszą: Betamerkaptoetanol zapobiegający tworzeniu mostków siarczkowych pomiędzy białkiem z ogonem histydynowym a innymi białkami, które chcemy usunąć. Detergenty (Triton X-100, Tween 20) lub NaCl redukujące niespecyficzne oddziaływania białek ze złożem oparte na oddziaływaniach hydrofobowych bądź jonowych. znaczanie zawartości i stężenia białek w próbkach Metoda Melanii Bradford Metoda Melanii M. Bradford wykorzystuje fakt przesunięcia maksimum absorpcji roztworu kumazyny (Coomassie Brillant Blue) z 465 nm do 595 nm po związaniu z białkiem. Cząsteczka barwnika oddziałuje poprzez grupy SO3ˉ z dodatnio naładowanymi resztami aminokwasowymi. Z barwnikiem reagują głównie reszty argininy, w mniejszym stopniu reszty histydyny, lizyny, tyrozyny, tryptofanu i fenyloalaniny. W środowisku kwaśnym kumazyna ma brunatne zabarwienie, które po reakcji z białkiem zmienia się na błękitne. Natężenie barwy jest proporcjonalne do zawartości białka w roztworze. Metoda spektroskopowa Spektroskopowe metody oznaczania stężeń białek opierają się na właściwościach absorpcyjnych naturalnych chromoforów występujących w białkach takich jak tyrozyna, tryptofan i fenyloalanina, które absorbują promieniowanie ultrafioletowe w zakresie 240 340 nm. Znając zawartość tych aminokwasów w białku możemy wyznaczyć współczynnik ekstynkcji i, korzystając z prawa Lamberta- Beera, stężenie białek w próbce. Dla krótszych fal (ok. 200 nm) absorbują wiązania peptydowe w białkach. Znając współczynnik ekstynkcji dla długości fali w tym zakresie możemy również wyznaczyć stężenie białka. Metoda ta jest jednak znacznie rzadziej stosowana ze względu na często spotykaną absorpcję buforów w tym zakresie.