Katedra Mikrobiologii PG. Publikacja współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Wielkość: px

Rozpocząć pokaz od strony:

Download "Katedra Mikrobiologii PG. Publikacja współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego"

Alicja Adamczyk
7 lat temu
Przeglądów:

1 Nowoczesne metody diagnostyczne Molekularne metody fenotypowe analiza białek dr hab. Beata Krawczyk Katedra Mikrobiologii PG Publikacja współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

2 Metody fenotypowe oparte o analizę białek Elektroforetyczne techniki analizy białek drobnoustrojów : profile białkowe uzyskane z całych ł komórek k profile białkowe błony zewnętrznej bakterii gram ujemnych metody elektroforetyczne rozdzielające izoenzymy komórkowe (Multilocus Enzyme Electrophoresis MLEE) różne odmiany immunoblottingu Typowanie serologiczne oparte na reakcji antygen przeciwciało i ł 2

3 Analiza profili białkowych techniki elektroforetyczne Cząsteczki ą białek w polu elektrycznym y migrują z szybkością ą zależną od ich masy cząsteczkowej, wypadkowego ładunku, od ładunku zależy też ich kierunku ruchu. PAGE elektroforeza natywna Ograniczeniem jest: potrzebna standaryzacja kompleksy białek dają profile trudne do interpretacji, stosunkowo słaba rozdzielczość metody. 3

4 Elektroforeza w obecności SDS (strefowa) Zastosowanie SDS (dodecylu siarczan sodu) substancji powierzchniowo czynnej przyczynia się do znacznego poprawienia rozdzielczości techniki elektroforetycznej. Potraktowanie cząsteczki białka przez SDS skutkuje powstaniem kompleksów białko SDS o ustalonym stosunku ładunku elektrycznego do masy. 4

5 Obecność SDS przynosi szereg korzyści: zdecydowana d większość białek ł jest rozpuszczalna w elektrolitach zawierających SDS, szczególnie po redukcji mostków disiarczkowych separacja białek odbywa się zgodnie z ich masami cząsteczkowymi barwienia kompleksów białko SDS jest znacznie wydajniejsze niż samego białka obecność SDS skutecznie eliminuje enzymatyczną degradację białek w trakcie separacji. Rys. Podstawy biologii komórki, Bruce Alberts i in. PWN

6 Schemat metody SDS PAGE Dodanie SDS; podgrzanie białka 1 2 Naniesienie próbki białka na SDS- PAGE ścieżka 2; ścieżka 1 marker molekularny l SDS wiąże się do reszt aminokwasowych i nadaje ujemny ładunek, po podgrzaniu białka ulegają linearyzacji 6

7 Elektroforeza nieciągła Połączenie izotachoforezy z elektroforezą strefową Nośnik elektroforetyczny składa się z dwóch kontaktujących się ze sobą części wypełnionych elektrolitami o różnym składzie di i różnej wartości ś ph (ang. discontinue electrophoresis or disc electrophoresis). izotachoforeza Elektroforeza strefowa 7

8 Detekcja żeli białkowych Można w ten sposób znaleźć 1 μg białka w prążku. Coomassie Brillant Blue Metoda ta pozwala oznaczyć 10 ng białka w prążku. ą Barwienie srebrem 8

9 Nowości - DualColor Protein Loading Buffer Pack (Fermentas Science) DualColor zapobiega degradacjibiałek podczas podgrzewania próbek do SDS PAGE jak i podczas prowadzenia elektroforezy. W skład obciążnika wchodzą dwa barwniki: bromofenol blue oraz pironina Y, dzięki czemu można śledzić przemieszczanie się próbek podczas elektroforezy oraz Western blotting. Zawarty w DualColor SDS i DTT niszczy wyższe struktury białkowe. SDS przyłącza się do hydrofobowych regionów białka powodując rozwijanie struktury tym samym nadając ładunek ujemny. DTT niszczy mostki dwusiarczkowe oraz pozostałe struktury dwurzędowe. Zastosowanie: Przygotowanie białek do SDS PAGE Monitorowanie transferu białek podczas Western blotting Śledzenie próbek z DualColor Protein Loading Buffer Pack Zwiększona stabilność białka dzięki DualColor Protein Loading Buffer Pack M PageRuler Unstained Protein Lauder (#SM0661) 1,3 próbka białka przygotowana z DualColor Protein Loading Buffer Pack 2,4 próbka białka przygotowana z konwencjonalnym buforem obciążającym Leammli (ph 6.8) i DTT. Fermentas. 9

10 Elektroforeza dwukierunkowa k białek Łączy w sobie dwie techniki: ogniskowanie izoelektryczne i elektroforezę SDS PAGE 10

11 Dwukierunkowa elektroforeza w żelu poliakryloamidowym zasadowe Stabilny gradient ph kwaśne a SDS (m.cz Migracja Rys. Podstawy biologii komórki, Bruce Alberts i in. PWN

12 2D electrophoresis of periplasmic fractions of E. coli BL21(DE3)/pET30b-sygDraBE (A) and E. coli BL21(DE3)/pET30b (B). [n] indicates oligomers of the DraE protein resolved on the gel; 1 corresponds to a monomer of DraE, and 2, 3, 4, 5, and 6 correspond to a dimer, a trimer, a tetramer, a pentamer and a hexamer of DraE, respectively. In panel A at ph 9 and 30 kda is a spot corresponding to the DraB protein. The IEF was performed with a linear ph 3 to 10 gradientas as indicated at the top. Separationby size was performed by using an SDS-12% polyacrylamide gel; the masses of compounds in a low-molecular-mass protein marker (Amersham Bioscience) are indicated between the gels. The gels were stained with silver. Molecular Aspects of Biogenesis of Escherichia coli Dr Fimbriae: Characterization of DraB-DraE Complexes ; Rafał Piątek i in. Infection and Immunity, January 2005, p , Vol. 73, No. 1 12

13 Elektroforeza allozymów allozymy Allel A Allel B Locus 1 izoenzymy Locus 2 Chromosomy homologiczne pojedynczego osobnika Izoenzymy enzymy o tych samych funkacjach katalitycznych, ale różniących się składem aminokwasowym, są kodowane przez geny położone w różnych locus ; Allozymy warianty enzymu, które są kodowane przez różne allele tego samego locus 13

14 Technika MLEE (ang. Multilocus Enzyme Electrophoresis) Charakterystyka gatunków drobnoustrojów poprzez relatywną mobilność elektroforetyczną ich dużej liczby enzymów komórkowych Metoda służy do badania genetycznej zmienności (wyrażonej fenotypowo) wewnątrz populacji jibk bakterii oraz stopnia pokrewieństwa ń pomiędzy izolatami, populacjami i gatunkami Używa się do badania zmienności w populacjach bakterii z rodziny Escherichia, Salmonella, Legionella, Leishmania, Neisseria i Haemophilus 14

15 Technika MLEE 1. Różnicowanie szczepów metodą MLEE polega na względnej ruchliwości elektroforetycznej rozpuszczalnych w buforach wodnych izoenzymów komórkowych 2. Rozdział elektroforetyczny białek cytoplazmatycznych w żelu poliakryloamidowym w warunkach natywnych 3. Transfer na błonę 4. Reakcja błony ze związkami substratowymi specyficznymi dla danego enzymu (procedurę powtarza się każdorazowo dla każdego białka, w zależności od ilości badanych izoenzymów) 5. Uzyskujemycharakterystyczny wzór mówiący o podobieństwach i różnicach fenotypowych 15

16 MLEE Dokumentacja KM PG 16

17 MLEE three enzymes (A) Mannitol 1-phosphate dehydrogenase in E. coli; 18 isolates. (B) Glucose 6-phosphate p dehydrogenase in N. meningitidis; 19 isolates. (C) Malate dehydrogenase in E. coli; 14 isolates. Anodal direction of migration from the origin is indicated by the Arrow. Copyright 1986, American Society for Microbiology Methods of Multilocus Enzyme Electrophoresis for Bacterial Population Genetics and Systematics ROBERT K. SELANDER,l* DOMINIQUE A. CAUGANT,' HOWARD OCHMAN,2 JAMES M. MUSSER, MARION N. GILMOUR,' AND THOMAS S. WHITTAM3 17

18 Wady MLEE: Brak odtwarzalności ś w różnych laboratoriach lb (problemy proceduralne) Użyteczna w badaniach bd hdługoterminowych (studiach epidemiologicznych globalnych) mało ł czuła ł w bd badaniach epidemiologicznych i i krótkoterminowych dla szczepów blisko spokrewnionych 18

Podobne dokumenty

- oznaczenia naukowo-badawcze. - jedna z podstawowych technik. - oznaczenia laboratoryjnodiagnostyczne. Elektroforeza. badawczych.

- oznaczenia naukowo-badawcze. - jedna z podstawowych technik. - oznaczenia laboratoryjnodiagnostyczne. Elektroforeza. badawczych. Elektroforeza - jedna z podstawowych technik badawczych - oznaczenia naukowo-badawcze - oznaczenia laboratoryjnodiagnostyczne Annals of the New York Academy of Sciences 928:54-64 (2001) 2001 New York