Czynniki warunkujące aktywność enzymów na przykładzie fosfatazy kwaśnej (EC 3.1.3.2 fosfohydrolaza monoestrów ortofosforanowych kwaśne optimum). Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest wykazanie na przykładzie fosfatazy kwaśnej, że czynniki takie jak stężenie enzymu, temperatura, stężenie jonów wodorowych (ph) oraz inhibitory wpływają na szybkość reakcji enzymatycznych. Wprowadzenie Fosfatazy (fosfomonoesterazy) należą do enzymów klasy hydrolaz, podklasy esteraz i katalizują hydrolizę różnych estrów fosforanowych, zgodnie z reakcją: Rys.1. Ogólna reakcja katalizowana przez fosfatazy. Fosfatazy kwaśne charakteryzują się niską specyficznością substratową. Mogą katalizować defosforylację różnych naturalnych substratów, takich jak 3-fosfoglicerynian, fosfoenolopirogronian (PEP), fityna, ATP, czy ufosforylowane na tyrozynie białka. Ze względu na optimum ph działania fosfatazy zostały podzielone na dwie grupy: fosfatazy kwaśne, aktywne w zakresie ph 4,0 do 7,0; fosfatazy alkaliczne, aktywne w zakresie ph 9,0 do 11,0. Fosfatazy kwaśne występują w różnych organach roślin: w bulwach, nasionach, owocach, liścieniach, brodawkach korzeniowych i liściach. Na terenie komórki fosfatazy kwaśne zlokalizowane są w cytosolu, wakuolach lub ścianie komórkowej.. Funkcje biochemiczne fosfataz kwaśych w komórkach roślin nie zostały dokładnie poznane. Przypuszcza się, że uwalniają fosforan ze związków organicznych w warunkach niedoboru fosforanów, w warunkach stresu zasolenia lub deficytu wody, w warunkach stresu wywołanego atakiem patogenów, w ontogenezie. Do najbardziej poznanych enzymów roślinnych należą: fitaza oraz fosfatazy należące do nadrodziny fosfataz tyrozynowych. U zwierząt fosfataza kwaśna występuje głównie w lizosomach komórek kości, gruczołu krokowego, jelit, trzustki i nerek, w płytkach krwi i krwinkach czerwonych. Fosfataza kwaśna jest enzymem wskaźnikowym, wykorzystywanym w diagnostyce medycznej. Aktywność fosfatazy kwaśnej silnie wzrasta w niektórych chorobach nowotworowych, chorobach wątroby oraz w chorobach kości. Metody oznaczania aktywności fosfataz In vitro, aktywność fosfataz oznacza się zazwyczaj używając sztucznych substratów, takich jak: 2-glicerofosforan, fenylofosforan, fosforan fenoloftaleiny, p-nitrofenylofosforan (pnpp). Aktywność enzymu mierzy się ilością uwolnionego fosforanu lub części organicznej estru, po reakcji enzymu z substratem prowadzonej w ściśle określonych warunkach. Szczególnie dogodnym substratem jest p-nitrofenylofosforan, gdyż jeden z produktów reakcji po zalkalizowaniu środowiska przechodzi w formę barwną. Zasada metody oznaczania aktywności fosfatazy kwaśnej na ćwiczeniach Na ćwiczeniach wykorzystuje się wodny wyciąg fosfatazy kwaśnej z siewek pszenżyta. Substratem stosowanym na ćwiczeniach jest p-nitrofenylofosforan dwusodowy (pnpp). Reakcję hydrolizy tego związku przedstawia rysunek 2. Powstający produkt reakcji, p-nitrofenol (pnp), przyjmuje w środowisku zasadowym barwę żółtozieloną, a jego ilość jest miarą aktywności fosfatazy. 1
Rys. 2. Reakcja hydrolizy p-nitrofenylofosforanu katalizowana przez fosfatazę kwaśną. Sposoby wyrażania aktywności enzymów Miarą aktywności enzymu jest szybkość reakcji enzymatycznej (v 0 ) mierzona ilością substratu przekształconego w jednostce czasu lub ilością produktu wytworzonego w jednostce czasu. Aktywność enzymu wyraża się w jednostkach aktywności. Podstawową jednostką jest jednostka uniwersalna (standardowa). Za taką jednostkę przyjęto ilość enzymu, która katalizuje przemianę 1 µmola substratu w ciągu 1 min., w temperaturze 30 C i optymalnych warunkach ph oraz stężenia substratu. Na szybkość reakcji enzymatycznych wpływa szereg czynników, przede wszystkim stężenie substratu, stężenie enzymu, stężenie jonów wodorowych w środowisku reakcji, temperatura a także obecność inhibitorów. Odczynniki: 1. Ekstrakt enzymu z siewek pszenżyta 2. 0.0075 M p-nitrofenylofosforan disodowy (pnpp) (substrat) 3. 0,1 M bufor Tris-octan o ph 4,0 4. 0,1 M bufor Tris-octan o ph 5,5 5. 0,1M bufor Tris-octan o ph 6,5 6. 0,1 M bufor Tris-octan o ph 8,0 7. 0,1 M NaOH 8. 0,02 M molibdenian amonu Studenci wykonują ćwiczenie w zespołach dwuosobowych. Na ćwiczeniach trzygodzinnych studenci badają wpływ stężenia enzymu, ph oraz inhibitorów na szybkość reakcji enzymatycznej. Na ćwiczeniach czterogodzinnych studenci badają wpływ wszystkich czynników na szybkość reakcji enzymatycznej. 1. Wpływ stężenia enzymu na szybkość przebiegu reakcji. W warunkach optymalnych szybkość reakcji enzymatycznej zmienia się proporcjonalnie do stężenia enzymu: im więcej jest cząsteczek enzymu, tym więcej cząsteczek substratu zostanie przekształconych w jednostce czasu. Badanie zależność szybkości reakcji od stężenia enzymu prowadzimy przy stałym wysokim stężeniu substratu, bo wówczas szybkość reakcji jest proporcjonalna do stężenia enzymu. Wykresem zależności szybkości reakcji od stężenia enzymu jest linia prosta (Rys. 3). Rys.3. Wpływ stężenia enzymu na szybkość reakcji. 2
Wykonanie. Do czterech ponumerowanych probówek (próby właściwe) odmierzyć kolejno po 0,25; 0,5; 0,75; i 1,0 ml ekstraktu enzymu (1), po 0,75 ml buforu Tris-octan o ph 5,5 (4), a następnie uzupełnić ich zawartość wodą destylowaną do objętości 2 ml. Do probówki numer 5 (próba kontrolna) odmierzyć 0,75 ml buforu Tris-octan o ph 5,5 (4) i 1,25 ml wody destylowanej. Wszystkie probówki umieścić na 5 min. w łaźni wodnej o temperaturze 30 o C. Po preinkubacji, nie wyjmując probówek z łaźni! dodać kolejno do wszystkich po 0,5 ml roztworu substratu (2), wymieszać i inkubować w łaźni jeszcze przez 15 min., licząc czas reakcji od momentu dodania substratu. Następnie przerwać reakcję dodając do wszystkich prób po 2,5 ml 0,1M NaOH (7), wymieszać. Zmierzyć absorbancję prób właściwych przy długości fali 420 nm w fotometrze ustawionym na zero wobec próby kontrolnej. Obliczenia: stężenia enzymu, dzieląc zmierzoną absorbancję przez współczynnik absorbancji dla 1µg p-nitrofenolu (p-np) równy 0,002, masę cząsteczkową p-nitrofenolu równą 139 oraz czas reakcji wynoszący 15 min., zgodnie z równaniem: 2. Wpływ ph na szybkość reakcji enzymatycznych. Enzymy białkowe zawierają w swoich cząsteczkach aminokwasy, których łańcuchy boczne mogą ulegać jonizacji, przez co umożliwiają zachowanie prawidłowej struktury przestrzennej. Ponadto, aminokwasy w centach aktywnych enzymów mogą pełnić swoje funkcje tylko w określonym stanie jonizacji. Jonizacja substratów oraz kompleksów ES także wpływa na szybkość reakcji enzymatycznych (rys.4). Stąd, wpływ ph na aktywność enzymu związany jest z wartością stałych dysocjacji: 1. grup czynnych w centrum aktywnym enzymu uczestniczących w wiązaniu substratu i katalizie. 2. grup funkcyjnych w cząsteczce substratu, którymi wiąże się on z enzymem. 3. innych grup w cząsteczce enzymu, których stan zjonizowania może gwarantować katalitycznie aktywną konformację. Każdy enzym posiada optymalną wartość ph, w której szybkość katalizowanej reakcji jest maksymalna. Niewielkie odchylenia od optimum powodują zmniejszenie szybkości reakcji, a duże odchylenia prowadzą do denaturacji białka enzymu i utraty aktywności. 3
Rys.4. Wpływ ph na aktywność enzymu. (Witwicki, Ardelt Elementy enzymologii PWN 1984). Optimum ph może ulegać pewnym zmianom zależnie od stopnia czystości preparatu enzymatycznego i temperatury środowiska. Wartość optymalnego ph działania enzymów zależy od rodzaju organizmu oraz lokalizacji enzymu w tkance, a nawet w przedziale komórkowym (Rys. 4). Dlatego wartość ph wewnątrz komórki może stanowić jeden z czynników regulacji metabolizmu. Wykonanie Do czterech kolejno ponumerowanych probówek (próby właściwe) odmierzyć po 0,5 ml enzymu, dodać po 0,75 ml wody destylowanej oraz po 0,75 ml buforów: do pierwszej buforu Tris-octan o ph 4,0 (3), do drugiej o ph 5,5 (4); do trzeciej o ph 6,5 (5) i do czwartej o ph 8,0 (6). Do probówki numer 5 (próba kontrolna) odmierzyć 0,75 ml buforu Tris-octan o ph 5,5 (4) oraz 1,25 ml wody destylowanej. Wszystkie probówki umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 30 o C na 5 min. Po preinkubacji, nie wyjmując probówek z łaźni! dodać do wszystkich probówek po 0,5 ml roztworu substratu (2), wymieszać i inkubować jeszcze przez 15 min., licząc czas reakcji od momentu dodania substratu. Następnie przerwać reakcję dodając do wszystkich prób po 2,5 ml 0,1M NaOH (7). Po wymieszaniu, zmierzyć absorbancję prób właściwych przy długości fali 420 nm w fotometrze ustawionym na zero wobec próby kontrolnej. Obliczenia: ph, zgodnie z równaniem: dzieląc zmierzoną absorbancję przez współczynnik absorbancji dla 1µg p-nitrofenolu (p-np) równy 0,002, masę cząsteczkową p-nitrofenolu równą 139 oraz czas reakcji wynoszący 15 min. 3. Wpływ temperatury na aktywność enzymów Niska temperatura hamuje działanie enzymów z powodu niskiej energii kinetycznej reagujących cząsteczek. Szybkość reakcji enzymatycznych wzrasta wraz z podwyższeniem temperatury. Wiąże się to ze wzrostem energii kinetycznej reagujących cząstek i większą częstotliwością ich zderzeń. Wzrost aktywności enzymatycznej w zależności od temperatury opisuje współczynnik temperaturowy Q10, określający jak zmienia się szybkość reakcji przy 4
wzroście temperatury o 10 o C. Zgodnie z regułą van t Hoffa podwyższenie temperatury o 10 C około dwukrotnie przyspiesza reakcje enzymatyczne. W temperaturze optymalnej szybkość reakcji jest największa (Rys.5). Zakres wartości temperatury optymalnej może się zmieniać w zależności od czasu trwania reakcji, ph oraz obecności innych substancji w mieszaninie reakcyjnej. Przy wzroście temperatury powyżej optymalnej następuje gwałtowne obniżenie szybkości reakcji, co jest związane z denaturacją cieplną białka enzymu. Rys.5. Wpływ temperatury na aktywność enzymu. Współczynnik Q 10 ma zastosowanie jedynie w zakresie temperatur nie powodujących denaturacji białka enzymu. Zazwyczaj obecność substratu i optymalne ph środowiska reakcji zmniejszają podatność białka enzymu na denaturację. Wykonanie Do trzech kolejno ponumerowanych probówek (próby właściwe) odmierzyć po 0,5 ml ekstraktu enzymatycznego (1), po 0,75 ml buforu Tris-octan o ph 5,5 (4) i uzupełnić je wodą destylowaną do objętości 2,0 ml. Następnie pierwszą umieścić w łaźni lodowej o temperaturze 4 o C, drugą w łaźni o temperaturze 25 o C, trzecią w łaźni o temperaturze 35 o C. Po 5 min. preinkubacji, nie wyjmując probówek z łaźni!, do każdej dodać po 0,5 ml p- nitofenylofosforanu (2), wymieszać zawartość i prowadzić reakcję w poszczególnych temperaturach jeszcze przez 15 min. Równolegle nastawić próby kontrolne dla każdej reakcji dodając do każdej z nich po 0,5ml ekstraktu enzymatycznego (1), 0,75 ml buforu Tris-octan o ph 5,5 (4) i 1,25 ml wody destylowanej. Następnie przerwać reakcję dodając do wszystkich prób właściwych i kontrolnych po 2,5 ml 0,1M NaOH (7) i wymieszać zawartość. Zmierzyć absorbancję prób właściwych przy długości fali 420 nm w fotometrze ustawionym na zero wobec próby kontrolnej. Obliczenia ph, zgodnie z równaniem: dzieląc zmierzoną absorbancję przez współczynnik absorbancji dla 1µg p-nitrofenolu (p-np) równy 0,002, masę cząsteczkową p-nitrofenolu równą 139 oraz czas reakcji wynoszący 15 min. 5
2. Badanie termostabilności fosfatazy kwaśnej. Większość enzymów ulega powolnej denaturacji nawet w temperaturach optymalnych. Podatność enzymu na denaturację cieplną, tak zwana termostabilność zależy od struktury molekularnej oraz pochodzenia enzymu. Cecha termostabilności enzymu zapisana jest w genie. Jak wykazały badania, struktura enzymów pochodzących z organizmów termofilnych jest stabilizowana dużą ilością wiązań jonowych oraz silnym upakowaniem hydrofobowego wnętrza cząsteczki. Najwyższa temperatura, w której jeszcze nie zachodzi termiczna inaktywacja enzymu w danych warunkach określa termostabilność enzymu. Enzymy termostabilne znalazły zastosowanie w technikach rekombinacji DNA, w przemyśle papierniczym, w przemyśle chemicznym czy przetwórczym Termostabilność enzymu badamy inkubując roztwór enzymu w różnych temperaturach przez określony czas. Następnie doprowadzamy roztwór enzymu do temperatury optymalnej, dodajemy substrat i pozostałe składniki reakcji, oznaczamy aktywność i porównujemy z aktywnością tego enzymu w optymalnych warunkach. Wykonanie Do trzech kolejno ponumerowanych probówek (próby właściwe) odmierzyć po 0,5 ml ekstraktu enzymatycznego (1), a następnie pierwszą umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 30 o C, drugą w łaźni o temperaturze 45 o C, trzecią w łaźni o temperaturze 60 o C i przetrzymywać przez 30 min. Następnie, po schłodzeniu w lodzie przez 5 min., wszystkie probówki umieścić w łaźni o temperaturze 30 o C dodać do każdej z nich po 0,75 ml buforu Tris-octan o ph 5,5 (4), po 0,75 ml H 2 O dest. i po 5 min. preinkubacji, nie wyjmując probówek z łaźni!, dodać do każdej z nich po 0,5 ml p-nitrofenylofosforanu (2), wymieszać zawartość i inkubować jeszcze przez 15 min. Do probówki czwartej (próba kontrolna) odmierzyć 0,75 ml buforu Tris-octan o ph 5,5 (4) i 1,25 ml H 2 O dest. oraz 0,5 ml p-nitrofenylofosforanu (2). Próbę kontrolną inkubować razem z próbami właściwymi. Po 15 min. przerwać reakcję dodając do wszystkich czterech probówek po 2,5 ml 0,1M NaOH (7) i wymieszać. Następnie zmierzyć absorbancję prób właściwych przy długości fali 420 nm w fotometrze ustawionym na zero wobec próby kontrolnej. Obliczenia temperatury, zgodnie z równaniem: dzieląc zmierzoną absorbancję przez współczynnik absorbancji dla 1µg p-nitrofenolu (p-np) równy 0,002, masę cząsteczkową p-nitrofenolu równą 139 oraz czas reakcji wynoszący 15 min. 2. Inhibicja aktywności enzymów. Aktywność wielu enzymów może być hamowana poprzez związanie działających w sposób specyficzny inhibitorów. Inhibitory hamują działanie enzymów wywołując zmiany w obrębie centrum aktywnego. Inhibitorami mogą być metabolity komórkowe, leki, trucizny lub inne substancje obce dla organizmu (ksenobiotyki). W zależności od sposobu działania inhibitora wyróżniamy inhibicję nieodwracalną i odwracalną. 6
W inhibicji nieodwracalnej inhibitor wiąże się kowalencyjnie z enzymem. Przykładem takiego inhibitora jest penicylina, która wytwarza wiązanie kowalencyjne z grupą OH Ser w centrum aktywnym transpeptydazy peptydoglikanu, enzymu uczestniczącego w syntezie ściany komórkowej bakterii i w rezultacie powoduje śmierć bakterii. Podobne działanie wykazuje DFP diizopropylofluorofosforan, stosowany jako pestycyd, który blokuje grupy OH seryny (Ser) w centrum aktywnym esterazy acetylocholinowej (Rys.6). Esteraza acetylocholinowa jest enzymem, który uczestniczy w przekazywaniu sygnałów w układzie nerwowym zwierząt. Rys. 6. Kompleks DFP (kolor niebieski) z grupą OH Ser w centrum aktywnym esterazy cholinowej. Inhibicję odwracalną charakteryzuje szybka dysocjacja kompleksu enzym-inhibitor. Wyróżniamy dwa typy inhibicji odwracalnej: współzawodniczą (kompetycyjną) i niewspółzawodniczą (niekompetycyjną). Inhibitor kompetycyjny (Rys.7) przyłącza się tylko do wolnego enzymu (E) i blokuje jego centrum aktywne, przez co zmniejsza liczbę cząsteczek enzymu wiążących substrat. Ten typ inhibitora zwiększa wartość liczbową stałej Michaelisa (K m ) ale nie zmienia wartości Vmax (szybkości maksymalnej reakcji). Przy określonym stężeniu inhibitora można cofnąć inhibicję kompetycyjną poprzez zwiększenie stężenia substratu. Wiele leków działa jako inhibitory współzawodnicze kluczowych enzymów przemian metabolicznych. Rys. 6. Przykłady inhibitorów kom petycyjnych dehydrogenazy bursztynianowej. Stosowany na ćwiczeniach molibdenian amonu jest inhibitorem kompetycyjnym fosfatazy kwaśnej. Rys.8. Wzór molibdenianu amonu. Inhibitor niewspółzawodniczy (niekompetycyjny) może przyłączyć się zarówno do wolnego enzymu (E) jak i do kompleksu enzym-substrat (ES). Inhibitor niekompetycyjny obniża wartość V max ale nie zmienia wartości K m ponieważ nie zmniejsza liczby cząsteczek enzymu wiążących substrat. Tego typu inhibicji nie można cofnąć poprzez zwiększenie stężenia substratu, lecz należy zastosować związki reagujące z inhibitorem. Przykładem inhibitora niekompetycyjnego jest pepstatyna A (Rys.9) hamująca aktywność reniny, enzymu 7
uczestniczącego w mechanizmie regulacji ciśnienia tętniczego krwi lub jony metali, które mogą reagować z grupami SH w białku enzymu powodując zmiany konformacyjne. Rys.9. Pepstatyna A inhibitor niekompetycyjny enzymu reniny. Wykonanie Do dwu ponumerowanych probówek (próby właściwe) odmierzyć po 0,5 ml enzymu oraz po 0,75 ml buforu Tris-octan o ph 5,5 (4). Następnie do probówki pierwszej dodać 0,25 ml molibdenianu amonu (8). Obie probówki wstawić do łaźni wodnej o temperaturze 30 o C. Po 10 min. inkubacji zawartość obu probówek uzupełnić wodą destylowaną do objętości 2,0 ml. Jednocześnie nastawić próby kontrolne. Do probówki numer 3 (pierwsza próba kontrolna) odmierzyć 0,75 ml buforu Tris-octan o ph 5,5., 0,25 ml molibdenianu amonu (8) oraz 1,0 ml wody destylowanej, a do probówki numer 4 (druga próba kontrolna) odmierzyć 0,75 ml buforu Tris-octan o ph 5,5 (4), oraz 1,25 ml wody destylowanej. Następnie nie wyjmując probówek z łaźni! do wszystkich prób, dodać po 0,5 ml p-nitrofenylofosforanu (2), wymieszać i inkubować w łaźni jeszcze przez 15 min, licząc czas reakcji od momentu dodania substratu. Po 15 min. przerwać reakcję dodając do wszystkich prób po 2,5 ml 0,1 M NaOH (7). Wymieszać zawartość probówek i zmierzyć absorbancję prób właściwych przy długości fali 420 nm w fotometrze ustawionym na zero wobec odpowiednich prób kontrolnych. Obliczenia ph, zgodnie z równaniem: dzieląc zmierzoną absorbancję przez współczynnik absorbancji dla 1µg p-nitrofenolu (p-np) równy 0,002, masę cząsteczkową p-nitrofenolu równą 139 oraz czas reakcji wynoszący 15 min. Opracowanie wyników 1. Sporządzić wykresy zależności szybkości reakcji od stężenia enzymu, wartości ph oraz temperatury odkładając na osi OY (rzędnych) szybkość reakcji (v 0 ), a na osi OX ( odciętych) odpowiednio ml enzymu, wartości ph, wartości temperatury. 2. Porównać wartości v 0 uzyskane dla poszczególnych temperatur i obliczyć ile razy wzrosła szybkość reakcji prowadzonej w t=35 o C w porównaniu do wyniku uzyskanego w t=25 o C. 3. W doświadczeniu dotyczącym badania termostabilności fosfatazy kwaśnej, wyrazić w procentach zmiany aktywności enzymu przetrzymywanego w temperaturze 45 o C i 8
60 o C w stosunku do aktywności enzymu przetrzymywanego w temperaturze 30 o i sformułować odpowiedni wniosek. 4. Porównując aktywność fosfatazy kwaśnej w reakcji bez inhibitora (probówka druga) z aktywnością enzymu w obecności inhibitora (probówka pierwsza) obliczyć procent zahamowania reakcji przez zastosowany inhibitor. Pytania 1. Podaj ogólną reakcję katalizowaną przez fosfatazy oraz klasę enzymów do której należą. 2. Wymień czynniki kinetyczne wpływające na aktywność enzymów. Omów działanie jednego z nich. 3. Podaj przykłady naturalnych substratów fosfatazy kwaśnej. Co może być miarą aktywności enzymu. Podaj definicję jednostki uniwersalnej. 4. Napisz reakcję zachodzącą podczas oznaczania fosfatazy kwaśnej na ćwiczeniach. Podaj nazwy substratu i produktów reakcji. 5. Podczas oznaczania aktywności fosfatazy kwaśnej w mieszaninie reakcyjnej wykryto 200 μmoli p-nitrofenolu. Oblicz ile μg substratu uległo rozłożeniu. 6. Oblicz ile μmoli p-nitrofenylofosforanu uległo hydrolizie z udziałem fosfatazy kwaśnej, jeżeli po 15 min. reakcji wartość absorbancji wynosiła 0,35, a 1 μg p-nitrofenolu daje absorbancję równą 0,002. Literatura 1. Berg, J.M., Tymoczko J.L., Stryer L. Biochemia. Wydawnictwo Naukowe PWN 2009 2. Witwicki J. Ardelt W. Elementy enzymologii PWN 1984 3. Senna R., Simonin V., Silva-Neto M.A.C., Fialho E.. 2006. Induction of acid phosphatase activity during germination of maize (Zea mays) seeds. Plant Phys. Bioch. 44, 467-473. 4. Van Etten R.L., Waymack D.M., Rehkop D.M. 1974 Transition metal ion inhibition of enzyme-catalyzed phosphate ester displacement reactions. J.Am. Chem. Soc. 96, 6782-6785. 9