Ćwiczenie 5. Spektroskopia w podczerwieni w badaniu struktury biomakromolekuł Metody spektroskopowe polegają na obserwacji oddziaływania promieniowania elektromagnetycznego z materią. Można je podzielić na metody: emisyjne, w których uzyskujemy informacje na temat promieniowania emitowanego przez próbkę; absorpcyjne, gdzie informacje uzyskiwane są na podstawie tej części promieniowania, która została zaabsorbowana oraz metody polegające na analizie promieniowania rozproszonego przez próbkę (spektroskopia Ramana). Spektroskopia w podczerwieni bada absorpcję promieniowania związaną ze wzbudzeniem poziomów oscylacyjnych cząsteczek. 5.1. Spektroskopia w podczerwieni podstawy teoretyczne W widmie promieniowania elektromagnetycznego zakres podczerwieni znajduje się pomiędzy promieniowaniem widzialnym i mikrofalowym. Najbardziej istotny z punktu widzenia spektroskopii biocząsteczek jest zakres podstawowy podczerwieni 4000 400 cm -1, otoczony przez bliską (powyżej 4000 cm -1 ) i daleką podczerwień (poniżej 400 cm -1 ). Energia wewnętrzna cząsteczek występuje w różnych formach, m. in.: (a) energii translacji, związanej z nieuporządkowanym ruchem molekuł; (b) energii rotacyjnej, wynikającej z wirowania cząsteczek wokół własnych osi; (c) energii oscylacyjnej, związanej z oscylacjami wokół położeń równowagi atomów cząsteczek oraz (d) energii elektronowej, w której skład wchodzi energia kinetyczna ruchu elektronów w cząsteczce oraz energia potencjalna oddziaływania elektronów z jądrami oraz sąsiednimi elektronami. Absorpcja promieniowania podczerwonego powoduje zmiany energii oscylacyjnej i rotacyjnej cząsteczki. Kształt widm w tym zakresie promieniowania w przypadku ciał stałych i cieczy zależy głównie od wzbudzeń oscylacyjnych, ponieważ rotacje cząsteczek są w tym przypadku częściowo lub całkowicie hamowane przez oddziaływania międzycząsteczkowe. Widma ciał stałych i cieczy są w związku z tym nazywane widmami oscylacyjnymi, natomiast widma cząsteczek w fazie gazowej noszą nazwę widm oscylacyjno-rotacyjnych ze względu na dużą swobodę zarówno rotacji jak i oscylacji cząsteczek. Drgania molekuł wieloatomowych mają złożony charakter, można je jednakże przedstawić jako superpozycję pewnej liczby drgań prostych, zgodnych w fazie i o jednakowej częstości. Drgania te nazywane są drganiami normalnymi. Wyróżniamy wśród nich drgania rozciągające związane ze zmianą długości wiązań i drgania deformacyjne wynikające ze zmiany kątów płaskich pomiędzy wiązaniami podczas ruchu w płaszczyźnie lub poza płaszczyznę wiązań. Każdy z rodzajów drgań może być dodatkowo symetryczny lub niesymetryczny. H 2 O symetryczne rozciągające (ν s OH) 3652 cm -1 asymetryczne rozciągające (ν as OH) 3756 cm -1 deformacyjne nożycowe (δ s OH) 1596 cm -1 Rys. 1. Drgania normalne izolowanej cząsteczki H 2 O.
Liczba stopni swobody cząsteczki jest równa sumie stopni swobody tworzących ją atomów. Każdy atom ma trzy stopnie swobody ruchu, odpowiadające współrzędnym kartezjańskim. Zatem cząsteczka składająca się z n atomów ma 3n stopni swobody. W przypadku cząsteczek nieliniowych trzy stopnie swobody dotyczą translacji, a trzy kolejne ruchu obrotowego. Pozostałe 3n-6 stopnie swobody opisują ruchy oscylacyjne i odpowiadające im drgania normalne. Cząsteczki liniowe mają tylko dwa rotacyjne stopnie swobody, więc ich drganiom odpowiada 3n-5 drgań normalnych. Przykładem nieliniowej drobiny jest cząsteczka wody, która składa się z trzech atomów, ma zatem 3 3 6 = 3 stopnie swobody oscylacyjnej. Odpowiadające im trzy drgania normalne przedstawiono na Rys. 1. Do przybliżonego opisu oddziaływania cząsteczki dwuatomowej z promieniowaniem elektromagnetycznych wykorzystuje się model oscylatora harmonicznego. Oscylatorem harmonicznym jest w tym przypadku układ dwóch mas (atomów lub rdzeni atomowych), drgających doskonale sprężyście wokół środka masy układu. Częstość drgań własnych takiego oscylatora (ν osc ) wyraża się wzorem: ν osc 1 f = π, (1) 2 m r gdzie f to stała siłowa, będąca miarą siły wiązania, natomiast m r oznacza masę zredukowaną, równą iloczynowi mas obu atomów podzielonemu przez ich sumę. Energia mikrooscylatora jest kwantowana i dla poszczególnych poziomów energetycznych oscylacji wyraża się wzorem: 1 E osc = hν osc υ +, (2) 2 gdzie υ oscylacyjna liczba kwantowa, która może przyjąć wartości υ = 0, 1, 2, 3, Oddziaływanie promieniowania podczerwonego z oscylującymi cząsteczkami jest możliwe tylko wtedy, gdy spełnione są pewne warunki nazywane regułami wyboru. Zgodnie z pierwszą regułą, energia fotonu promieniowania elektromagnetycznego, która może zostać pochłonięta przez cząsteczkę musi odpowiadać różnicy energii poziomów energetycznych cząsteczki (dla spektroskopii oscylacyjnej E osc = hν). W przypadku oscylatora harmonicznego dozwolone są tylko przejścia absorpcyjne lub emisyjne, dla których oscylacyjna liczba kwantowa zmienia się o υ = ±1. Przedstawiony model oscylatora harmonicznego wyjaśnia występowanie tak zwanych pasm podstawowych, czyli intensywnych pasm absorpcyjnych w widmach cząsteczek heteroatomowych, którym towarzyszy zmiana oscylacyjnej liczby kwantowej υ = 1. W widmach obserwowane są również pasma o niskiej intensywności i o częstościach zbliżonych do wielokrotności częstości pasma podstawowego, są to tzw. nadtony. Ich występowanie wyjaśnia model oscylatora anharmonicznego. Najważniejszą konsekwencją zastosowania tego modelu jest rozszerzenie reguły wyboru dotyczącej zmiany liczby kwantowej oscylacji dozwolone stają się przejścia, dla których oscylacyjna liczba kwantowa zmienia się o kilka jednostek ( υ = ±1, ±2, ±3, ). Warunek ten stanowi drugą regułę wyboru obowiązującą w spektroskopii w podczerwieni. Z trzeciej reguły wyboru wynika natomiast, że w podczerwieni można obserwować tylko te przejścia oscylacyjne, którym towarzyszy zmiana momentu dipolowego cząsteczki. Drgania te nazywa się drganiami aktywnymi w podczerwieni. Rzadko obserwuje się teoretyczną liczbę drgań normalnych tonów podstawowych, ponieważ nadtony i drgania złożone, czyli suma lub różnica kilku drgań, zwiększają liczbę pasm, natomiast inne zjawiska zmniejszają ich liczbę. Gdy dwa oscylujące wiązania mają wspólny atom, pomiędzy utworzonymi oscylatorami istnieje oddziaływanie mechaniczne i z tego względu rzadko zachowują się jak odrębne oscylatory, chyba że częstości ich drgań są
bardzo różne. Sprzężenie dwóch drgań normalnych powoduje powstanie dwóch nowych drgań o częstościach wyższej i niższej niż ta, gdy oddziaływania nie zachodzą (rezonans Fermiego). Oddziaływania mogą pojawiać się również pomiędzy drganiami podstawowymi, nadtonami i drganiami złożonymi. W każdym drganiu normalnym biorą udział wszystkie atomy cząsteczek, ale amplitudy ich wychyleń mogą być różne. W wielu drganiach biorą udział przede wszystkim najbliższe atomy tworzące charakterystyczną grupę funkcyjną w cząsteczce, a pozostałe atomy mają tak małą amplitudę wychyleń, że praktycznie nie wpływają na drgania. Z wymienionych powyżej powodów wiele grup funkcyjnych wykonuje drgania o charakterystycznej częstości, zmieniającej się niewiele w różnych cząsteczkach. Kształt krzywej dzwonowej pasm absorpcyjnych jest charakterystyczną cechą oddziaływania substancji z promieniowaniem. Poszerzenie pasma wynika z kilku przyczyn naturalnych, takich jak zasada nieoznaczoności Heisenberga, efekt Dopplera. Pasma w podczerwieni faz skondensowanych są poszerzone ze względu na zatartą strukturę rotacyjną widma oscylacyjnego. Zdarza się również, że sąsiadujące ze sobą pasma w widmie nakrywają się tworząc wspólny kontur. Położenie maksimum pasm w widmie w podczerwieni jest najczęściej określane w skali liczb falowych, czyli liczby drgań przypadających na 1 cm drogi promieniowania (ν = 1/λ, cm -1 ), rzadziej przy pomocy długości fali (λ, nm) lub częstości promieniowania (ν, Hz). Intensywność pasm jest natomiast wyrażona w skali transmitancji (T) lub absorbancji (A). Transmitancja jest to stosunek natężenia światła przepuszczonego przez próbkę do natężenia światła padającego na próbkę. Absorbancja jest logarytmem dziesiętnym odwrotności transmitancji A = log 10 (1/T). Pod pojęciem natężenia pasm rozumiemy pole powierzchni pomiędzy linią określającą kontur pasma a jego linią bazową. W niektórych przypadkach miarą natężenia pasma może być jego wysokość mierzona w maksimum. 5.2. Aparatura pomiarowa Współczesne spektrometry zamiast widm rejestrują bezpośrednio tzw. interferogramy. Promieniowanie obejmujące określony zakres podczerwieni (np. 4000 400 cm -1 ) rozdzielane jest na dwie wiązki (Rys. 2). Jedna z nich przebiega drogę o stałej długości, a druga generowana jest przez interferometr z ruchomym zwierciadłem poruszającym się ze stałą prędkością. Zmieniająca się różnica długości dróg obu wiązek powoduje wzajemne interferencje i w wyniku tego powstaje interferogram. Zastosowanie transformacji Fouriera pozwala na przekształcenie takiego interferogramu z domeny czasowej na bardziej użyteczną domenę częstości, czyli widmo. Jedno przejście szerokopasmowego promieniowania przez próbkę pozwala na rejestrację całkowitego widma w podczerwieni, co znacznie skraca czas analizy. Zastąpienie tradycyjnych monochromatorów interferometrami znacznie polepszyło także czułość i rozdzielczość przyrządów. Zwierciadło ruchome Źródło Dzielnik wiązki Próbka Detektor Komputer Przetwornik Zwierciadło stałe Rys. 2. Schemat spektrometru podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR).
5.3. Spektroskopia w podczerwieni w badaniach struktury i stabilności białek Spektroskopia w podczerwieni jest jedną z najbardziej wszechstronnych technik badawczych, pozwalających na obserwowanie struktury drugorzędowej białek oraz jej zmian wywołanych różnymi czynnikami zewnętrznymi. Jej niewątpliwą zaletą jest możliwość dostosowania warunków pomiarowych do konkretnego problemu. Dostępnych jest wiele odmian tej techniki (np. tradycyjna spektroskopia transmisyjna, spektroskopia ATR lub spektroskopia odbiciowa), umożliwiających pomiary roztworów białek o różnym stężeniu, żeli, cienkich filmów lub stałych preparatów. Popularnym problemem biochemicznym do którego wykorzystuje się spektroskopię FTIR jest analiza struktury drugorzędowej białek. Rozwój tej techniki eksperymentalnej w badaniach biochemicznych spowodowany jest wzrostem zainteresowania strukturą białek oraz ograniczeniami bardziej bezpośrednich technik, takich jak NMR i krystalografia rentgenowska. Wprawdzie za pomocą spektroskopii w podczerwieni nie można uzyskać informacji o absolutnej strukturze białka, to jednak, w przeciwieństwie do wymienionych wyżej technik, pozwala ona na analizę struktury białek trudno rozpuszczalnych, nie tworzących kryształu lub białek o masach cząsteczkowych powyżej kilkudziesięciu kda. Spektroskopia w podczerwieni jest także wykorzystywana w badaniach nad stabilnością białek, nad mechanizmem ich denaturacji oraz do badania molekularnych podstaw ich funkcjonowania. Na Rys. 3 przedstawiono przykładową serię widm FTIR lizozymu z białka jaja kurzego zmierzonych w różnych temperaturach (rozpuszczalnikiem była woda ciężka). Zmiany w kształcie pasm można powiązać ze zmianami w strukturze drugorzędowej białka, pojawiającymi się wraz ze wzrostem temperatury. Na podstawie zależności wartości absorbancji przy liczbie falowej 1640 cm -1 od temperatury możliwe jest wykreślenie krzywej denaturacji (we wstawce), która może posłużyć do określenie temperatury denaturacji lub pomóc w określeniu mechanizmu denaturacji białka. Absorbancja 2.5 2.0 1.5 1.0 1. 2. Abs. @ 1640 cm -1 1.7 1.6 1.5 1.4 30 40 50 60 70 80 90 Temperatura ( o C) 0.5 pasmo amidowe I' pasmo amidowe II 1700 1650 1600 1550 Liczba falowa (cm -1 ) Rys. 3. Seria widm lizozymu z białka jaja kurzego zmierzonych w zakresie temperatur 30,4 o C 83,5 o C. Strzałkami oznaczono kierunek najważniejszych zmian w natężeniu i położeniu pasm amidowych I oraz II, towarzyszących wzrostowi temperatury. Widma zmierzono w kuwecie transmisyjnej wyposażonej w okienka z CaF 2 rozdzielone przekładkami teflonowymi o grubości 56 µm. Temperatura była regulowana za pomocą zewnętrznego kontrolera. We wstawce przedstawiono krzywą denaturacji, wyznaczoną dla liczby falowej 1640 cm -1. Wykorzystanie spektroskopii różnicowej lub czasowo rozdzielczej spektrofotometrii (ang. time-resolved) z wykorzystaniem techniki zatrzymanego przepływu pozwala
przykładowo na obserwowanie zmian w centrum katalitycznym enzymu. Często wykorzystuje się w tym zakresie technikę znakowania białek ciężkimi izotopami ( 15 N) lub mutagenezę ukierunkowaną. Pozwala to na precyzyjne przypisanie określonych pasm widocznych w widmie białka konkretnym resztom aminokwasowym. 5.3.1. Określanie struktury drugorzędowej białek Białka posiadają dziewięć charakterystycznych pasm, z których największe znaczenie w analizie struktury drugorzędowej mają przedstawione na Rys.4: pasmo amidowe I (odpowiadające głównie drganiom rozciągającym wiązania C=O, ok. 1700-1600 cm -1 ), pasmo amidowe II (odpowiadające sprzężonym drganiom zginającym wiązania N-H i rozciągającym wiązania C-N, ok. 1600-1500 cm -1 ) oraz w mniejszym stopniu pasmo amidowe III (odpowiadające głównie drganiom rozciągającym wiązania C-N i drganiom zginającym wiązania N-H, ok. 1340-1200 cm -1 ). 0.15 pasmo amidowe I Absorbancja 0.12 0.09 0.06 0.03 pasmo amidowe II pasmo amidowe III 0.00 2000 1750 1500 1250 Liczba falowa (cm -1 ) Rys. 4. Charakterystyczne widmo czystego białka (lizozym z białka jaja kurzego) rozpuszczonego w wodzie wraz z zaznaczonymi najważniejszymi pasmami amidowymi, służącymi do analizy zmian w jego strukturze. Widmo jest wynikiem odjęcia zmierzonego widma ATR czystej wody od widma ATR roztworu białka. Wskaźnikiem prawidłowego odjęcia widm było uzyskanie płaskiego przebiegu linii bazowej widma wynikowego powyżej 1800 cm -1. Ograniczenia steryczne, hydrofobowy/hydrofilowy charakter reszt bocznych aminokwasów jak i samego szkieletu polipeptydowego, a także otaczający białko rozpuszczalnik powodują, że białka przyjmują w roztworach wodnych ściśle określone konformacje geometryczne, zwane strukturami drugorzędowymi. Istotnym elementem każdej z nich jest charakterystyczna sieć wiązań wodorowych między atomami tlenu karbonylowego łańcucha polipeptydowego a atomem wodoru grupy aminowej, które spinają fragmenty łańcucha polipeptydowego, często znacznie oddalone od siebie. Każda ze struktur drugorzędowych białek posiada charakterystyczną geometrię sieci wiązań wodorowych, a co za tym idzie, także charakterystyczne zakresy częstości drgań wiązań zaangażowanych w ich tworzenie. Na Rys. 5 przedstawiono zakresy częstości drgań wiązań w zakresie pasma amidowego I, najczęściej wykorzystywanego do określania zawartości poszczególnych struktur drugorzędowych, przypisane poszczególnym strukturom drugorzędowym. Wartości te opierają się głównie na danych eksperymentalnych oraz obliczeniach teoretycznych.
Granice różnych zakresów są często dosyć szerokie, dlatego należy ostrożnie analizować uzyskane wyniki. W strukturze przestrzennej białek można najczęściej wyróżnić wiele różnych struktur drugorzędowych, dlatego też ich widma w podczerwieni mają złożony charakter. Pasma amidowe składają się w wielu różnych, zachodzących na siebie pasm składowych, charakterystycznych dla poszczególnych struktur. Znacząco komplikuje to analizę widm. Jednak stosując techniki zwiększania rozdzielczości widm można jednak uzyskać informacje o ich położeniu i natężeniu, a czasem także o ich procentowym udziale w stosunku do wszystkich struktur drugorzędowych danego białka. 11 10 9 10 α-helisa 8 7 Agr Zakręty i pętle Pętle Agregat 6 5 4 βs β β-kartki βs 3 2 1 Reszty AA Reszty AA 1700 1690 1680 1670 1660 1650 1640 1630 1620 1610 1600 Liczba falowa / cm -1 Rys. 5. Zakresy absorpcji poszczególnych struktur drugorzędowych występujących powszechnie w białkach. Skróty i objaśnienia: β β-kartki, βs β- spinki (β-kartki zbudowane tylko z dwóch łańcuchów), reszty AA grupy boczne reszt aminokwasowych, Agr. agregaty, 3 10 helisa 3 10, Pętle rozumiane jako długie pętle, lub struktura nieuporządkowanego polipeptydu (charakterystyczna dla białek zdenaturowanych); struktury, których pasma absorpcji przesuwają się pod wpływem wymiany protonowej oznaczone zostały strzałką, prostokątami przerywanymi oznaczono zakresy absorpcji tych struktur w wodzie ciężkiej. 5.3.2. Izolacja i analiza widm biocząseczek w roztworach wodnych Widma biocząsteczek najczęściej mierzone są w roztworach wodnych i rzadko możliwa jest bezpośrednia analiza charakterystycznych pasm absorpcji. Ogólny schemat postępowania w takich sytuacjach przedstawia się następująco: a. Usunięcie udziału widmowego pary wodnej Pierwszym problemem we wstępnej obróbce danych widmowych jest usunięcie pasm absorpcji pary wodnej w zakresie pasma amidowego I i II. W dużym stopniu problem ten jest zmniejszany przez intensywne płukanie aparatu suchym azotem lub osuszonym powietrzem. Jednak nie zawsze jest to wystarczające rozwiązanie. Korekcja atmosfery opiera się najczęściej na takim dobraniu współczynnika odejmowania zmierzonego widma pary wodnej, aby uzyskać widmo w najwyższym stopniu pozbawione udziału tej pary. Procedura odbywa się metodą "prób i błędów", a kryterium jest ocena wizualna widma. b. Odejmowanie udziału widmowego wody Największym problemem w przygotowaniu widm do dalszej obróbki jest prawidłowe odjęcie widma wody (lub buforu), ponieważ nawet w bardzo stężonych próbkach natężenie pasma wody w zakresie amidu I jest od 5 do 10 razy większe, niż samego pasma amidowego I. Powszechnie stosowanym sposobem odejmowania widma wody od zmierzonego widma
roztworu białka (zarówno uzyskanego metodą transmisyjną jak i ATR) jest wizualne odjęcie wcześniej zmierzonego widma wody aż do uzyskania na widmie wynikowym płaskiej linii w okolicy 2000 1800 cm -1. Alternatywnym rozpuszczalnikiem białek może być woda ciężka, D 2 O. Jej zaletą jest to, iż nie posiada silnych pasm absorpcji w zakresie pasma amidowego I. Zastąpienie atomów wodoru deuterem nie powoduje drastycznych zmian w kształcie pasma amidowego I (znak prim oznacza, że widmo zostało zmierzone w wodzie ciężkiej), zmiany te jednak pozwalają na rozróżnienie pasm absorpcji struktur α od struktur pętlowych, co w wodzie zwykłej (H 2 O) nie byłoby łatwe. Niewielkiemu przesunięciu w stronę niższych liczb falowych ulegają też wartości absorpcji pozostałych struktur drugorzędowych (Rys. 5). Drastycznej zmianie ulega natomiast położenie pasma amidowego II. Wymiana protonowa powoduje przesunięcie maksimum tego pasma od ok. 1550 cm -1 do ok. 1450 cm -1 (to nowe pasmo nazywane jest pasmem amidowym II ). Tak duża zmiana jest podstawą dla eksperymentów mających na celu np. określenie stabilności hydrofobowego rdzenia białek. c. Zwiększanie rozdzielczości widm - uzyskiwanie informacji o pasmach składowych Stosuje się powszechnie kilka technik pozwalających określić liczbę i położenie pasm składowych, które można następnie przypisać konkretnym strukturom drugorzędowym. Wszystkie te techniki mają jednak poważną wadę uzyskane wyniki są w dużym stopniu zależne od subiektywnych decyzji dokonywanych na kolejnych etapach obróbki widm i powinny być stosowane z ostrożnością. i) Druga pochodna widm. Minima na drugiej pochodnej widm biocząsteczek określają w przybliżeniu liczbę i położenie pasm składowych. Kształt drugiej pochodnej, w szczególności informacja o liczbie pasm składowych, zależy od jakości danych pierwotnych. Druga pochodna widm jest bardzo wrażliwa na wszelkie zakłócenia (np. szumy aparaturowe, nieskorygowane pasma absorpcji pary wodnej, itp), dlatego należy ostrożnie analizować jej kształt. Na Rys. 6 przedstawiono serię drugich pochodnych widm lizozymu z białka jaja kurzego zmierzonych w zakresie temperatury 35 o C 56 o C. Minima drugich pochodnych wskazują prawdopodobne położenie pasm składowych, które można przypisać poszczególnym strukturom drugorzędowym. 0.003 Druga pochodna 0.000-0.003 zakręty β -0.006 α+pętle 1700 1680 1660 1640 1620 1600 Liczba falowa (cm -1 ) Rys. 6. Seria drugich pochodnych widm lizozymu z białka jaja kurzego, zmierzonych w zakresie temperatury 35 o C 56 o C. Strzałką oznaczono kierunek zmian towarzyszących wzrostowi temperatury. Oznaczono także najważniejsze struktury drugorzędowe: α α - helisy, β β - kartki.
ii) Rozkład pasma na składowe. Kształt złożonego pasma na widmie w podczerwieni przybliża się sumą sztucznie wygenerowanych pasm składowych, będących najczęściej funkcjami Gaussa i Lorentza, ich sumą lub iloczynem. Absorbancja 0.14 0.12 0.10 0.08 0.06 0.04 1686 3% 1673 11% 1657 25% 1644 13% 1633 46% 1612 2% 0.02 0.00 1700 1680 1660 1640 1620 1600 Liczba falowa (cm -1 ) Rys. 7. Przykład rozkładu pasma amidowego I białka bogatego w β-kartki (świadczy o tym silne pasmo przy 1633 cm -1 ). Każdemu pasmu składowemu przypisano maksimum oraz procentowy udział zajmowanej powierzchni całego pasma. iii) Dekonwolucja z wykorzystaniem odwrotnej transformacji Fourier a. Metoda ta służy przede wszystkim do zwiększenia rozdzielczości widma, a nie do samego określania liczby i położenia składowych, chociaż i w takim celu może być wykorzystana. 5.3.3. Technika tłumionego całkowitego odbicia Technika tłumionego całkowitego odbicia (ang. Attenuated Total Reflectance ATR) jest obecnie coraz szerzej stosowaną odmianą spektroskopii odbiciowej, posiadającą wiele wspomnianych wcześniej zalet w stosunku do tradycyjnej techniki transmisyjnej pomiaru widm. fala zanikająca promień padający θ próbka kryształ ATR promień odbity Rys. 8. Przebieg promieni w krysztale ATR. Promień padający pod kątem θ, większym od kąta granicznego, na powierzchnię kryształu ATR ulega całkowitemu odbiciu (Rys. 8). Materiały z którego wykonane są kryształy ATR charakteryzują się wysokim współczynnikiem załamania światła i są wykonane najczęściej z germanu, selnku cynku lub diamentu. Jeśli do powierzchni kryształu
zostanie przyłożona próbka materiału absorbującego promieniowanie, to wiązka promieniowania wnika w głąb próbki (fala zanikająca) na bardzo małą głębokość, zależną od kąta padania wiązki i współczynników załamania światła kryształu ATR i samej próbki. Część promieniowania może zostać zaabsorbowana przez próbkę, a mierząc intensywność promieniowania wiązki odbitej od powierzchni kryształu można uzyskać widmo charakterystyczne dla materiału próbki, tzw. widmo ATR. Widma ATR są złożeniem widma refleksyjnego (odbiciowego) oraz absorpcyjnego. Korekcja ATR umożliwia wyodrębnienie części absorpcyjnej widma ATR. Korygowane są także efekty widmowe związane z niektórymi zjawiskami optycznymi, jak normalna lub anomalna dyspersja optyczna. W ich wyniku fale o różnych częstotliwościach penetrują warstwy próbki o różnej grubości, a co za tym idzie, są różnie przez nią absorbowane. Zjawisko to jest silnie zależne od współczynnika załamania światła próbki, dlatego też nie można dokonywać operacji odejmowania lub dodawania widm ATR próbek o różnych współczynnikach załamania światła. W spektroskopii biocząsteczek najważniejszą zaletą techniki tłumionego wewnętrznego odbicia jest możliwość uzyskania widm roztworów, których składniki (przede wszystkim woda) posiadają bardzo silne pasma własne, uniemożliwiające uzyskanie widma samego białka metodą transmisyjną. Wadą tej techniki jest jednak konieczność stosowania dość wysokich stężeń biocząsteczek oraz konieczność korekcji tych widm, jeżeli mają one zostać poddane dalszej analizie. 5.4. Eksperymenty Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest obserwacja zmian zachodzących w strukturze drugorzędowej lizozymu z białka jaja kurzego, spowodowanych obecnością w roztworze substancji denaturującej: soli metalu ciężkiego lub kwasu nieorganicznego. Przebieg ćwiczenia Przygotowanie roztworów Roztwory substancji denaturującej 1. Za pomocą biurety przygotować 12 roztworów substancji denaturującej o wzrastającym stężeniu. Rodzaj substancji oraz jej stężenia wskazuje osoba prowadząca zajęcia. Wszystkie rzeczywiste objętości roztworów wyjściowych oraz końcowych zapisać w tabeli wyników. Roztwory lizozymu 1. Do ponumerowanych probówek 1,5 ml odważyć na wadze analitycznej po ok. 50 mg wcześniej oczyszczonego i liofilizowanego białka. Masę białka w każdej z probówek zapisać w tabeli. 2. Do kolejnych probówek dodać odpowiedni roztwór denaturanta tak, aby końcowe stężenie białka wynosiło 100 150 mg/ml roztworu denaturanta (dokładne stężenie końcowe białka podaje osoba prowadząca). Wszystkie objętości zapisać w tabeli wyników. 3. Każdą próbkę zworteksować i odwirować przez ok. 30 sekund przy 6 tys. obrotów/min. 4. Próbki pozostawić na 30 minut w temperaturze pokojowej.
5. Po tym czasie rozpocząć pomiary spektroskopowe oraz równolegle zmierzyć współczynnik załamania światła wszystkich próbek i roztworów substancji denaturującej, n D 25. Wszelkie zmiany w wyglądzie próbek zanotować w tabeli wyników. Wykonanie pomiarów 1. Na godzinę przed planowanym rozpoczęciem pomiarów spektroskopowych rozpocząć płukanie aparatu suchym azotem. 2. Uruchomić program OMNIC i w zakładce Parametry pomiaru ustalić następujące parametry: liczba skanów 128, rozdzielczość widm 4 cm -1, zakres liczb falowych 4500 500 cm -1. 3. Rozpocząć pomiary od pomiaru widma tła klikając przycisk Pomiar tła. Widmo tła należy mierzyć przed każdą próbką, chyba że prowadzący wskaże inaczej. 4. Pomiary próbek rozpocząć od próbki o najniższym stężeniu substancji denaturującej. Próbki nanosić na kryształ przystawki ATR i rozpocząć pomiar poprzez kliknięcie przycisku Pomiar próbki. Zacząć od serii roztworów substancji denaturującej, a następnie zmierzyć serię roztworów lizozymu. 5. Po każdym pomiarze próbki kryształ przetrzeć 10% roztworem SDS i wodą. 6. Po zakończeniu wszystkich pomiarów zmierzyć widmo atmosfery i zapisać wszystkie widma w formacie *.SPA. Opracowanie wyników 1. Skorygować wszystkie widma próbek ze względu na obecność atmosfery. 2. Na każdym widmie dokonać korekcji ATR, uwzględniając zmierzony współczynnik załamania światła, n D 25. 3. Odjąć od każdego widma widmo czystego rozpuszczalnika. 4. Uzyskane wyizolowane widma białka sprowadzić do wspólnej linii bazowej oraz wyznaczyć ich drugie pochodne w zakresie pasma amidowego I. Wszystkie widma i ich drugie pochodne zapisać w postaci plików *.CSV. 5. Uzupełnić wszystkie dane w tabeli wyników. 6. Wszystkie widma (w zakresie 1800 1500 cm -1 ) przedstawić na zbiorczym wykresie oraz omówić zmiany w kształcie widm lizozymu, towarzyszące zwiększającemu się stężeniu substancji denaturującej. 7. Na podstawie drugich pochodnych widm dla roztworów o skrajnych stężeniach substancji denaturującej określić precyzyjnie które struktury drugorzędowe są najbardziej wrażliwe na obecność substancji denaturującej. 8. Dla wskazanej przez osobę prowadzącą liczby falowej wykonać wykres natężenia pasma od stężenia substancji denaturującej oraz omówić uzyskaną zależność. Wielkości niezbędne do wyznaczenia danych w tabeli wyników Stężenie roztworu wyjściowego denaturanta, C r.wyj. mol dm -3 Objętość końcowa przygotowywanych roztworów denaturanta, V k.r.den. ml Cząstkowa objętość właściwa lizozymu, υ 0,703-1 cm 3 g Masa molowa lizozymu z białka jaja kurzego g mol -1 Końcowe stężenie białka w roztworze denaturanta mg (ml roztw. denaturanta) -1 Końcowe stężenie białka w roztworze denaturanta mol dm -3
Tabela wyników Roztwory substancji denaturującej Roztwory lizozymu Nr V r.wyj V wody C den. 25 n D r. den. m białka V r.den. C k.den. 25 n D r. białka Uwagi [ml] [ml] [mol dm -3 ] [mg] [µl] [mol dm -3 ] 0 1 2 12 V r.wyj V wody C den. 25 n D r. den. m białka V r.den. C k.den. 25 n D r. białka objętość roztworu wyjściowego substancji denaturującej objętość wody stężenie substancji denaturującej w przygotowanych roztworach współczynnik załamania światła roztworów substancji denaturującej masa białka odważona do probówki 1,5 ml objętość roztworu substancji denaturującej konieczna do uzyskania założonego stężenia końcowego białka stężenie końcowe substancji denaturującej w roztworze białka współczynnik załamania światła roztworów białka