Chromatografia Chromatografia cienkowarstwowa - TLC Chromatografia po co? Zastosowanie: oczyszczanie wydzielanie analiza jakościowa analiza ilościowa Chromatogram czarnego atramentu Podstawowe rodzaje chromatografii planarna bibułowa (TLC) kolumnowa kolumnowa wysokosprawna (HPLC) gazowa (GC) 1
Opis układu chromatograficznego Parametry fizyczne Długość, średnica kolumny, prędkość przepływu, wielkość ziaren, objętość martwa, czas martwy Selektywność odległość pomiędzy maksimami kolejnych pików Sprawność liczba półek teoretycznych Wymagania wobec fazy stacjonarnej właściwości powierzchni sorpcyjnej wielkość powierzchni właściwej sorbentu stopień obsadzenia powierzchni sorpcyjnej grupami aktywnymi wielkość porów (średnia wielkość i zakres wielkości porów) średnia wielkość i rozkład wielkości ziaren wypełnienia inne: gęstość materiału, podatność na elektryzowanie się itp. Wymagania wobec eluentu zapewnia wystarczającą selektywność układu chromatograficznego nie moŝe reagować ani z fazą stacjonarną, ani z rozdzielanymi substancjami moŝliwie niska lepkość niskie ciepło parowania eluentu, nieobecność substancji nielotnych nie powinien posiadać cech utrudniających detekcję (zaleŝne od rodzaju detekcji np. absorpcja światła w określonej długości fali, przewodnictwa i in.) 2
Inne waŝne zasady nie powinno się dopuszczać do wyschnięcia kolumny, kolumny nie naleŝy poddawać udarom mechanicznym, nie powinno się w sposób gwałtowny obniŝać ciśnienia eluentu, próbka zawierająca zanieczyszczenia mechaniczne powinna zostać przefiltrowana, próbka nie powinna zawierać substancji ulegających trwałej sorpcji, naleŝy przestrzegać zaleceń producenta co do warunków pracy kolumny, Istota zjawiska rozdzielania suchą płytkę chromatograficzną umieszcza się w komorze chromatograficznej, w której znajduje się rozpuszczalnik i jego pary (przykrywa się) Istota zjawiska rozdzielania, c.d. Faza ruchoma dzięki siłom kapilarnym migruje wzdłuŝ warstwy sorbentu (fazy stacjonarnej) i w zaleŝności od energii oddziaływań substancji z fazą ruchomą i nieruchomą, wykazują one róŝny stopień retencji, tzn. mają róŝną drogę migracji. 3
Zastosowanie CC i TLC TLC jest bardzo waŝną techniką identyfikacji i rozdziału związków, stosuje się ją m. in. do: rozdzielanie składników mieszanin określanie czystości uzyskanego preparatu identyfikacja związków poprzez porównanie ich z wzorcami monitorowanie przebiegu reakcji wstępny dobór eluentu do chromatografii kolumnowej analiza frakcji zebranych z kolumny chromatograficznej W TLC poszczególne składniki są rozdzielane pomiędzy adsorbentem (faza nieruchoma zwykle silikaŝel lub SiO 2 ) a rozpuszczalnikiem (faza ruchoma), który porusza się dzięki siłom kapilarnym przez warstwę adsorbentu. TLC - rozwój 1938 r. początki w oznaczaniu zanieczyszczeń leków 1956 r. wzrost popularności dzięki wynalezieniu urządzenia do nakładania adsorbentu ok. 1970 spadek zainteresowania brak moŝliwości rejestracji i archiwizowania wyników (rozwój innych metod) ok. 1990 wprowadzenie wysokosprawnej chromatografii cienkowarstwowej HPTLC wprowadzenie detektorów (densytometry), automatyczne dozymetry, komputerowe opracowanie wyników Porównanie TLC i HPTLC Parametr Wielkość płytki [cm] Grubość warstwy [µm] Przeciętna wielkość ziaren [µm] Rozkład średnicy ziaren Objętość próbki [µl] Średnica plamki [mm] w chwili startu po rozwinięciu Czas rozwijania [min] Granice wykrywalności absorpcja światła [ng] fluorescencja [pg] TLC 20 20 100-250 20 10-60 1-5 3-6 8-15 30-200 1-5 50-100 HPTLC 10 10 200 5-15 wąski 0,1-0,5 1,0-1,5 2-6 3-6 0,1-0,5 5-10 4
Schemat procesu TLC Zjawisko demiksji Związane jest z gradientem fazy ruchomej w czasie jej migracji (szczególnie widoczne w przypadku rozpuszczalników znacznie róŝniących się właściwościami). W kaŝdym miejscu warstwy chromatograficznej są inne warunki rozdzielania. Współczynnik R F R F określa stosunek drogi przebytej przez środek plamy substancji a do drogi czoła fazy ruchomej b R F a R F = b tm 1 = = t + t 1+ k m s t s, t m czas przebywania plamki substancji w w fazie stacjonarnej i w fazie ruchomej k współczynnik retencji 5
Współczynnik R F a rozdzielczość R s Optymalna wartość współczynnika R F wynosi 0,2-0,8 Technika pracy Najczęściej stosowane fazy stacjonarne: Ŝel krzemionkowy (Silica gel) tlenek glinu (Alumina) ziemia okrzemkowa krzemian magnezu (Florisil) celuloza (biopolimery i subst. hydrofilowe) skrobia, cukier, mannitol, Ŝele dekstranowe (Sephadex) do rozdzielania związków róŝniących się masą molową Technika pracy, c.d. Bardzo często w wypełnieniach znajduje się dodatek czynnika fluoryzującego w świetle UV. W opisie podawana jest teŝ długość fali światła umoŝliwiająca detekcję: najczęściej 254 i 360 nm 6
Przebieg procesu chromatograficznego 1. Przygotowanie próbki, nanoszenie mieszaniny na warstwę chromatograficzną 2. Dobór faz (układu chromatograficznego) 3. Rozwijanie chromatogramu 4. Detekcja substancji na warstwie 5. Ilościowa i jakościowa interpretacja chromatogramu Przygotowanie próbki próbka powinna być rozpuszczona w niskowrzącym rozpuszczalniku, naleŝy zwracać uwagę, aby nie uszkodzić struktury sorbentu na płytce, próbkę nanosi się w postaci plamki lub pasemka minimalna średnica plamki (optymalna wielkość 1 mm), do nanoszenia uŝywa się kapilar, mikropipet lub dozowników Przygotowanie płytki noŝyczki pod kątem 30 7
Wpływ rozpuszczalnika na wielkość plamki Sposób aplikacji pasmo czy plamka? StęŜenie próbki a rozdzielczość 8
Efekt przeładowania i uszkodzenia płytki OK za duŝe stęŝenie uszkodzenie płytki Dobór faz potrzebna znajomość procesu chromatograficznego, doświadczenie dane literaturowe znajomość szeregu eluotropowego trudności w standaryzacji wyników, ze względu na mnogość parametrów decydujących o kształcie procesu Rozwijanie chromatogramu WaŜne: płytkę umieszczać po nasyceniu się komory parami (jednakowy czas nasycania 10-15 min.), naleŝy stosować zawsze tę samą ilość rozpuszczalnika, jednakowy czas dodatkowej adsorpcji par na powierzchni warstwy, ta sama droga rozwijania chromatogramu (np. 7 cm) 9
Sposoby rozwijania - liniowe Sposoby rozwijania liniowe wielokrotne Rozdział antyoksydantów metylo-, etylo- i propyloparabenu Płytka: Merck Silica 60 CN F254s UV 254nm I rozwijanie II rozwijanie III rozwijanie Sposoby rozwijania 2D 10
Detekcja Metody fizyczne obserwacja w świetle widzialnym, fotometria absorpcyjna, fluorescencja, fosforescencja Dla płytek z dodatkiem wskaźnika fluorescencyjnego - w miejscy analitu obserwuje się ciemną plamę Detekcja, c. d. Detekcja chemiczna (przeprowadzenie substancji w związki barwne) literatura podaje ok. 250 wywoływaczy (np. jod, H 2 SO 4, inne tworzące kompleksy barwne) Detekcja biologiczno-fizjologiczna wykorzystuje aktywność biologiczną rozdzielanych substancji. Interpretacja jakościowa i ilościowa Interpretacja jakościowa polega na wizualnej ocenie chromatogramu: skuteczność rozdziału wielkość i kształt plamek Interpretacja ilościowa ekstrakcja i analiza substancji w plamkach densytometry 11
Zalety chromatografii cienkowarstwowej metoda komplementarna w stosunku do wysokosprawnej chromatografii kolumnowej stosowanie do wstępnego doboru faz dla układów kolumnowych (minimalne zuŝycie rozpuszczalników) moŝliwość równoczesnego rozdziału kilku próbek moŝliwość stosowania elucji stopniowej lub dwukierunkowej rozdzielane próbki nie muszą być wstępnie oczyszczane Zalety chromatografii cienkowarstwowej moŝliwość rozdzielania skomplikowanych układów za pomocą prostych środków moŝliwość wykorzystywania selektywnych sposobów wizualizacji plamek metoda jest mało pracochłonna w porównaniu z innymi metodami analitycznymi Przykłady 12
Przykłady 13