Krystalizacja (1) Oczyszczanie ciał stałych. Krystalizacja z indywidualnego rozpuszczalnika

Transkrypt

1 Krystalizacja (1) Oczyszczanie ciał stałych Krystalizacja z indywidualnego rozpuszczalnika Wybór rozpuszczalnika: -duża różnica rozpuszczalności oczyszczanego związku na zimno i na gorąco - bardzo dobra (gotowanie z substancją powierzchniowo czynną i przesączenie roztworu), albo bardzo słaba (gorący roztwór należy przesączyć) rozpuszczalność zanieczyszczeń -bierność chemiczna względem oczyszczanego związku - temperatura wrzenia niższa od temperatury topnienia oczyszczanego związku -niepalność, mała toksyczność Należy stosować możliwie małe ilości rozpuszczalnika

2 Krystalizacja (2) Chłodzenie szybkie: małe kryształy, więcej zarodkow krystalizacji, sprzyja tworzeniu oleju; chłodzenie wolne: duże kryształy Inicjacja krystalizacji: - silne początkowe chłodzenie i powolne ogrzanie do temperatury otoczenia - naprzemienne chłodzenie i ogrzewanie - tarcie o ścianki naczynia -mieszanie - zaszczepianie Krystalizacja z mieszaniny rozpuszczalników: rozpuszczanie w gorącym rozpuszczalniku dobrze rozpuszczającym związek, i wytrącanie rozpuszczalnikiem źle rozpuszczającym związek Krystalizacja przez wytrącanie kwasu z roztworu soli, bądź soli amoniowej z roztworu aminy

3 Ekstrakcja (1) Ekstrakcja z materiału stałego (rozdrobnionego): - prosta - ciągła (nie osiąga się stanu równowagi; aparat Soxhleta zatężanie ekstraktu, skroplony rozpuszczalnik rozpuszcza kolejną porcję ciała stałego) Ekstrakcja z cieczy: - nieciągła (prosta K > 5, wielokrotna K ~ 1, frakcjonowanie ekstrakcja porcji roztworu substancji tym samym roztworem rozpuszczalnika K ~ 1) - ciągła (nie osiąga się stanu równowagi; perforacja zatężanie ekstraktu i zawrócenie skroplonego rozpuszczalnika do procesu, K < 1) Prawo podziału Nernsta (dla danej temperatury i dla liniowej izotermy podziału): K = a 1 /a 2 c 1 /c 2 K współczynnik podziału Ekstrakcja wielokrotna: E = 1 n n ( ) v K + 1 v K 1 P = ( ) v K + 1 E ilość substancji w n-tym ekstrakcie P ilość substancji niewyekstrahowanej v stosunek objętości roztworów

4 Ekstrakcja (2) Dobór rozpuszczalników: - minimalna wzajemna rozpuszczalność -bierność chemiczna względem siebie i substancji ekstrahowanych -duża różnica w rozpuszczalności substancji ekstrahowanych, tj. jeden z rozpuszczalników musi rozpuszczać obydwie substancje, a drugi jedną z nich; odpowiednie wartości K -mała lepkość, duże napięcie powierzchniowe (trudniejsze emulgowanie) - łatwość odzyskania związków z rozpuszczalników - niska palność Technika: -wytrząsanie celem zwiększenia powierzchni kontaktu pomiędzy rozpuszczalnikami - lepiej ekstrahować więcej razy mniejszymi porcjami rozpuszczalnika, niż mniej razy większymi porcjami rozpuszczalnika - efekt solny - efekt hydrotropowy - efekt ph Wykorzystanie możliwości tworzenia soli amin, kwasów i fenoli umożliwia łatwe przeprowadzanie ich do warstwy wodnej po zakwaszeniu/alkalizacji, a następnie do warstwy organicznej po alkalizacji/zakwaszeniu

5 Destylacja (1) Rozdział cieczy Prawo Raoulta: ya p A xa = 1 y p 1 x A B A y ułamek molowy w fazie gazowej x ułamek molowy w fazie ciekłej p ciśnienie pary nasyconej Destylacja prosta: - wybór sposobu ogrzewania zależny od temperatury wrzenia łaźnie wodne (do 80 o C), olejowe, płaszcze grzejne - wybór chłodnicy chłodnice Liebiega z płaszczem wodnym (do 140 o C), lub bez płaszcza; chłodnica powinna być tym dłuższa, a wylot par do chłodnicy tym wyżej, im mniejsza jest temperatura wrzenia - stosowanie kamyków wrzennych celem równomierności ogrzewania całego roztworu - odpowiednie zamocowanie termometru - wyrównywanie ciśnienia z otoczenem poprzez otwór za chłodnicą Destylacja przy stałej objętości służy do zatężania bardzo rozcieńczonych roztworów, wyjściowa mieszanina jest wkraplana w miarę postępu destylacji Destylacja w skróconym aparacie dla małych ilości roztworu Destylacja frakcyjna z kolumną destylacyjną (deflegmatorem) i pionową chłodnicą zwrotną do rozdziału rozpuszczalników o niewielkiej różnicy temperatur wrzenia

6 Destylacja (2) Opracował: Wojciech Augustyniak Destylacja azeotropowa do usuwania jednego ze składników mieszaniny jako azeotropu, np. wody z benzenem, toluenem, chloroformem (heteroazeotropy rozdzielanie się warstw w temperaturze niższej od temperatury wrzenia) Destylacja z parą wodną (tworzenie azeotropów ujemnych), stosuje się dla związków o masie cząsteczkowej niższej od 150g/mol i prężności par wyższej od 10mmHg w 100 o C; można w ten sposób destylować substancje stałe oraz związki wrażliwe na wysokie temperatury m m A H2O p = p A H2O M M A H2O Destylacja pod zmniejszonym ciśnieniem dla związków o wysokich temperaturach wrzenia (powyżej 250 o C), lub nietrwałych: -używa się nasadki Claisena umożliwiającej wprowadzenie kapilary - stosuje się kuliste odbieralniki - pompki wodne służą do generowania próżni Obliczanie temperatury wrzenia w danym ciśnieniu równianie Clausiusa-Clapeyrona: dlnp dt L V R T = 2 logp const T L v molowe ciepło parowania

7 Chromatografia Chromatografia różnica w rozdziale substancji pomiędzy fazę stacjonarną i fazę ruchomą Techniki chromatograficzne: - kolumnowa (chromatografia adsorpcyjna, podziałowa, jonowymienna, żelowa, powinowactwa) - cienkowarstwowa (TLC; chromatografia adsorpcyjna, podziałowa, powinowactwa, elektroforeza) - bibułowa (chromatografia podziałowa) - wysokociśnieniowa (HPLC; chromatografia adsorpcyjno-podziałowa, jonowymienna, żelowa) - gazowa (GC, chromatografia podziałowa)

8 Rodzaje chromatografii - adsorpcyjna - podziałowa (rozpuszczalność) - jonowymienna: - rozdział ze względu na wymianę jonów ze złożem zawierającym grupy kwaśne (sulfonowe, karboksylowe, fosforanowe) w wymieniaczach kationów (kationity), lub zasadowe (aminowe) w wymieniaczach anionów (anionity) związane ze złożem (np. polistyren, celuloza, Sephadex) -służy do rozdziału związków jonowych, kwasów i zasad (aminy), szczególnie do aminokwasów, peptydów, białek i kwasów nukleinowych - stosuje się techniki kolumnowe - żelowa (sączenie molekularne): - rozdział ze względu na wielkość związku, małe związki silnie penetrują pory złoża (na ogół Sephadex, wielkość jego porów (G) decyduje o możliwości rozdzielenia określonych makromolekuł), dzięki czemu są na nim silniej zatrzymywane -służy do rozdziału związków wielkocząsteczkowych (białka, kwasy nukleinowe), jak i do ich odsalania - stosuje się techniki kolumnowe - powinowactwa (afinitywna): - specyficzne oddziaływania ligand-receptor, przeciwciało-antygen, enzym-substrat -służy głównie do wyodrębniania określonego białka z ekstraktów komórkowych - stosuje się techniki kolumnowe i cienkowarstwowe - elektroforeza (rozdział ze względu szybkość migracji jonów w polu elektrycznym)

9 Chromatografia adsorpcyjna O rozdziale decyduje konkurencja substancji i rozpuszczalnika z fazy ruchomej (ciecz lub rzadko, dla rozdziału substancji lotnych gaz) o wiązanie się do adsorbenta z fazy stacjonarnej (ciało stałe) Techniki: kolumnowa, cienkowarstwowa, HPLC Adsorbent powinien: -miećjak najsilniej rozwiniętą powierzchnię -składać się z odpowiednio wielkich ziaren (im mniejsze, tym szybciej ustala się równowaga, ale tym wolniejszy przepływ rozpuszczalnika) o jednorodnej wielkości -byćbierny chemicznie wobec rozpuszczalnika i substancji rozdzielanych -byćselektywny Rodzaje adsorbentów: - polarne, dobrze wiążące związki polarne, aktywność maleje z zawilgoceniem; głównie tlenki i sole - niepolarne, niezwilżalne, dobrze wiążące związki niepolarne; np. węgiel aktywny Szereg aktywności adsorbentów pod względem wiązania związków organicznych: celuloza < skrobia < sacharoza < CaSO 4 < silikażel < MgO < Al 2 O 3 < węgiel aktywny Szereg eluotropowy rozpuszczalników: heksan < CCl 4 < benzen < CHCl 3 < (C 2 H 5 ) 2 O < CH 3 COOC 2 H 5 < aceton < C 2 H 5 OH < CH 3 OH < H 2 O < CH 3 COOH < pirydyna Na ogół stosuje się mieszaniny rozpuszczalników; większa polarność substancji rozwijanej wymaga większej polarności stosowanego układu na adsorbencie polarnym. Na adsorbencie niepolarnym szereg eluotropowy należy stosować w odwrotnej kolejności, tzn. im silniejsze wiązanie substancji ze złożem, tym mniej polarny układ rozwijający należy stosować

10 Chromatografia podziałowa O rozdziale decyduje podział substancji pomiędzy dwie niemieszające się ciecze 2 warianty: chrom. cieczowo-gazowa (gazowa, GC), lub cieczowo-cieczowa (np. bibułowa) Techniki: kolumnowa, cienkowarstwowa, GC, HPLC Chromatografia cieczowo-cieczowa: - układ z normalnymi fazami: faza ruchoma ciecz organiczna, faza stacjonarna ciecz osadzona na nośniku stałym (np. woda na celulozie); metoda dobra do rozdziału substancji polarnych, np,. aminokwasy, peptydy, sacharydy, nukleotydy - układ z odwróconymi fazami: faza ruchoma woda, faza stacjonarna rozpuszczalnik organiczny zaadsorbowany na nośniku; metoda stosowana w rozdziale związków niepolarnych (podobnie, jak chromatografia adsorpcyjna) Nośnik powinien: -być obojętny wobec rozpuszczalników i rozdzielanych substancji - nie wykazywać własności adsorpcyjnych i jonowymiennych -być zwilżany fazą ruchomą -składać się z jednorodnych ziaren o odpowiedniej wielkości (im mniejsze, tym lepszy rozdział, ale tym wolniejszy przepływ rozpuszczalnika) Najczęstsze złoża: silikażel, celuloza, skrobia, ziemia okrzemkowa, acetyloceluloza

11 Chromatografia bibułowa Chromatografia cieczowo-cieczowa (cienkowarstwowa technika chromatografii podziałowej stosowana głównie do rozdziału aminokwasów, peptydów, sacharydów, nukleotydów): - faza ruchoma homogenna mieszanina rozpuszczalników zawierająca wodę, stacjonarna woda zaadsorbowana na bibule - wykonanie techniką wstępującą (rozpuszczalnik migruje od dolnego końca bibuły zanurzonego w eluencie) lub zstępujacą (spływową; rozpuszczalnik migruje od górnego końca bibuły zanurzonego w eluencie) - detekcja próba ninhydrynowa na aminokwasy i peptydy, UV na nukleotydy -R f nie są dobrze odtwarzalne

12 Chromatografia gazowa Chromatografia cieczowo-gazowa (kolumnowa technika chromatografii podziałowej stosowana do rozdziału i analizy gazów, niskowrzących cieczy, lub łatwo lotnych substancji stałych): - faza ruchoma gaz, stacjonarna wysokowrząca ciecz (olej, smar, glikol polietylenowy) osadzona na obojętnym nośniku (np. długa kapilara szklana) - GC wykonuje się zwykle w wysokich temperaturach, - detekcja katarometr (zmiana przewodnictwa w obecności związku opuszczającego kolumnę), spektrometr mas (GC MS) -związki opuszczają kolumnę przy określonych, dobrze odtwarzalnych czasach retencji - GC to dobre narzędzie analityczne, można też używać GC do celów preparatywnych - GC pozwala na oznaczanie ilościowe (pomiar powierzchni pod pikiem) - zastosowanie chiralnego złoża umożliwia rozdział enancjomerów - przeprowadzenie w lotne pochodne umożliwia analizę związków nielotnych, np. kwasów karboksylowych jako estrów trimetylosililowych, aminokwasów jako pochodnych dabsylowych (jako amidy kwasu 4-(dimetyloamino)-azobenzeno-4 -sulfonowego)

13 Chromatografia kolumnowa Faza ruchoma ciecz, faza stacjonarna złoże stałe lub ciecz zaadsorbowana na złożu wypełniającym kolumnę Kolumnę wypełnia się zawiesiną złoża (wysokość złoża powinna być co najmniej 10 razy większa od średnicy kolumny; minimum 25 razy więcej złoża od próbki w chromatografii adsorpcyjnej, 100 razy w chromatografii podziałowej), nanosi próbkę od góry i eluuje układem rozwijającym zbierając frakcje; związki we frakcjach wykrywa się za pomocą chromatografii cienkowarstwowej Dobieranie eluentu dla chromatografii adsorpcyjnej: próby za pomocą chromatografii cienkowarstwowej różnica R f rozdzielanych związków powinna być większa niż 0.3, a jedna z substancji nie powinna mieć R f wyższego od 0.2 Typowe błędy podczas rozdziału: - zbyt szeroka kolumna zbyt duża dyfuzja, nierówny przepływ -zbyt wąska kolumna lub za małe ziarna lub zbyt mało polarny eluent za wolny przepływ, dyfuzja -za mało nośnika lub za grube ziarna zły rozdział - mokry eluent, kolumna, nośnik utrata aktywności nośnika, zły rozdział -zbyt mało aktywny nośnik zły rozdział -złe upakowanie kolumny lub nierówne nałożenie próbki nierówny rozdział - zbyt polarny eluent brak rozdziału - zbyt szybki przepływ brak rozdziału, nie ustalają się równowagi międzyfazowe - zbieranie zbyt dużych frakcji złe rozdzielenie substancji

14 Chromatografia cienkowarstwowa (1) Faza ruchoma ciecz, faza stacjonarna - stałe złoże lub ciecz zaadsorbowana na złożu nałożonym na płytkę - technika analityczna, niekiedy preparatywna - stosowana głównie do sprawdzania czystości związków, kontroli reakcji, analizy wycieków z kolumny chromatograficznej - zalety: krótki czas rozwijania, proste metody kontroli, zużycie małych ilości związki (ng) R f = (odległość od startu do centrum plamki)/(odległość od startu do czoła rozpuszczalnika) R f nie jest dobrze odtwarzalnym parametrem Dobór układu rozwijającego: tak, aby była wyraźna różnica pomiędzy R f analizowanych związków, i aby związki nie zostawały na miejscu nałożenia plamki, oraz aby nie migrowały z czołem rozpuszczalnika

15 Chromatografia cienkowarstwowa (2) 1. Przygotowanie płytki: warstwa sorbentu 0.2mm grubości, nanoszenie na odtłuszczoną płytkę, suszenie 2. Nanoszenie próbki: odparowanie rozpuszczalnika, możliwie mała plamka 3. Rozwijanie płytki w szczelnej kamerze chromatograficznej, stosuje się paski bibuły celem szybszego nasycenia komory parami rozpuszczalnika 4. Wywołanie chromatogramu: UV, pary jodu (układy nienasycone), ogrzewanie po zwilżeniu stężonym H 2 SO 4 lub 2% KMnO 4, ninhydryna (aminy i aminokwasy) Techniki: - kilkukrotne rozwijanie w przypadku niskich R f - chromatografia dwukierunkowa (rozwijanie chromatogramu w drugim kierunku w innym układzie rozpuszczalników) w przypadku podobnych R f - klinowa (początkowa część chromatogramu zawęża się ku dołowi) celem zwężenia plamki - krążkowa (nakraplanie eluentu na środek plamki) celem określenia przydatności układu do rozdziału)

16 Wysokosprawna chromatografia cieczowa HPLC high pressure/performance liquid chromatography Chromatografia adsorpcyjno-podziałowa Faza ruchoma ciecz wtłaczana pod wysokim ciśnieniem; faza stacjonarna gęsto i jednorodnie upakowana złożem kolumna z metalu, dobrze odpowietrzona Detekcja: lampa UV, katarometr, spektrometr mas Wariant analityczny (węższe kolumny) i preparatywny (szersze kolumny) Zalety: szybki, zautomatyzowany i precyzyjny rozdział związków; łatwe stosowanie gradientów; powtarzalność czasów retencji; ilościowe oznaczanie związków (pole powierzchni pod pikiem); zastosowanie chiralnego złoża umożliwia rozdział enancjomerów Wada: rozdział małych ilości związków 2 warianty: - kolumna z normalnymi fazami: polarne złoże (np. krzemionka) i niepolarny rozpuszczalnik do rozdziału związków niepolarnych - kolumna z odwróconymi fazami: niepolarne złoże (np. krzemionka związana z długołańcuchowymi alkoholami na powierzchni), polarny rozpuszczalnik do rozdziału związków polarnych, w tym aminokwasów, peptydów, białek, sacharydów FPLC fast protein liquid chromatography: metoda podobna do HPLC, stosuje się niższe ciśnienia, oraz kolumny typowe dla chromatografii jonowymiennej i sączenia żelowego