Zastosowanie nowych markerów wydalanych z moczem w diagnostyce wczesnego uszkodzenia nerek

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics 2013 Volume 49 Number 3 239-245 Praca poglądowa Review Article Zastosowanie nowych markerów wydalanych z moczem w diagnostyce wczesnego uszkodzenia nerek The use of novel urine markers in diagnostics of early renal injury Agnieszka Czyżewska-Buczyńska 1, Andrzej Konieczny 2, Monika Ryba 2, Ewa Zduńczyk 1, Zbigniew Hruby 2, Wojciech Witkiewicz 1,3 1 Wojewódzki Szpital Specjalistyczny we Wrocławiu, Ośrodek Badawczo-Rozwojowy, 2 Wojewódzki Szpital Specjalistyczny we Wrocławiu, Oddział Nefrologii z Pododdziałem Diabetologicznym i Transplantacyjnym, 3 Wojewódzki Szpital Specjalistyczny we Wrocławiu, Oddział Chirurgii Ogólnej, Naczyniowej i Onkologicznej Streszczenie Choroby nerek stanowią coraz większy problem kliniczny, ze względu na stale wzrastającą długość życia oraz współwystępowanie chorób przewlekłych. Z tego względu konieczne jest poszukiwanie nowych markerów, które w sposób nieinwazyjny pozwolą na wczesne wykrycie zmian w obrębie tego narządu i wdrożenie skutecznego leczenia, zanim dojdzie do nieodwracalnych zmian strukturalnych w nerce. W poszukiwaniach biomarkerów wczesnego uszkodzenia nerek wykorzystuje się najnowocześniejsze techniki z zakresu biologii molekularnej, genetyki i proteomiki, dzięki którym możliwe jest określenie profilu markerów dla danej jednostki chorobowej. Ideałem byłoby wskazanie takiego markera, który nie tylko zidentyfikowałby zaistniałe uszkodzenie, ale również wskazałby konkretne miejsce i typ uszkodzenia w obrębie nerki. Analiza moczu może dostarczyć szeregu informacji na temat zaistniałego uszkodzenia nerek, ocenianego na podstawie ilości i jakości komórek oraz białek i kwasów nukleinowych uwalnianych do przestrzeni moczowej. Wskaźnikiem uszkodzenia kłębuszków nerkowych może być ocena liczby podocytów izolowanych z osadu moczu. Wykazano, że podocyturia poprzedza pojawienie się białkomoczu, a jej wielkość może być wskaźnikiem aktywności choroby. Prężnie rozwijające się badania nad microrna dają duże nadzieje na opisanie biomarkerów wczesnego uszkodzenia nerek specyficznych dla danego typu choroby nerek, a przy tym także na wyjaśnienie mechanizmów procesów patologicznych i opracowanie nowych terapii. Summary Kidney diseases are a clinical problem of increasing incidence due to increased life expectancy as well as accompanying chronic diseases. It is necessary to discover novel non- invasive markers, enabling to early detection of renal failure and implementation of effective therapy, preventing permanent kidney destruction. In search for novel biomarkers modern molecular biology, genetics and proteomics methods are utilised, enabeling marker profiling for particular kidney disease. Ideally, biomarker should identify existing tissue failure indicating the specific location and type of this failure. Urinalysis provides information about existing renal failure, assessed on the basis of quantity and quality of cells, proteins and nucleic acids released to the urinary space. A marker of renal glomerular injury could be podocyte count in urinary sediment. Podocyturia precedes proteinuria and may indicate activity of disease. Advances in research on microrna will hopefully indicate early renal failure biomarkers, specific for distinct renal disease, contributing to elucidation of pathological mechanisms and development of new therapeutic strategies. Słowa kluczowe: białkomocz, choroby nerek, diagnostyka, markery, microrna, podocyty Key words: diagnostics, markers, microrna, podocytes, proteinuria, renal diseases Wprowadzenie Jedną z najczęstszych przyczyn przewlekłej choroby nerek, mogącej w konsekwencji prowadzić do schyłkowej niewydolności nerek (ESRD End Stage Renal Disease), jest obecnie cukrzyca. Na kolejnych miejscach plasują się: kłębuszkowe zapalenia nerek, nadciśnienie tętnicze oraz zwyrodnienie wielotorbielowate nerek. Z powodu ciągłego wzrostu liczby osób zapadających na choroby nerek, istotne jest jak najszybsze wprowadzenie odpowiedniej diagnostyki, która pozwoli na zastosowanie skutecznego leczenia, w celu zminimalizowania ryzyka rozwoju schyłkowej niewydolności nerek. We wczesnych etapach choroba nerek jest utajona i trudna do stwierdzenia z powodu braku dostatecznie czułych 239

Zastosowanie nowych markerów wydalanych z moczem w diagnostyce wczesnego uszkodzenia nerek i specyficznych wskaźników obrazujących uszkodzenie tego narządu. Standardowo oznaczany poziom kreatyniny w surowicy krwi (scr) nie stanowi idealnego markera opisującego czynność nerek, z uwagi na to, że z podwyższeniem jej stężenia w surowicy mamy do czynienia dopiero w momencie uszkodzenia około 50% kłębuszków. Czulszym wskaźnikiem oceniającym funkcję nerek jest współczynnik filtracji kłębuszkowej (egfr estimated glomerular filtration rate). Zwiększone wydzielanie kreatyniny przez cewki we wczesnym etapie rozwoju choroby nerek, może doprowadzić do przeszacowania wartości egfr, stąd łatwo o błędną interpretację wyniku. Poziom kreatyniny jest zatem czułym wskaźnikiem zmniejszania egfr jedynie w późnej fazie choroby nerek [1, 2]. Nowa era badań w poszukiwaniu idealnego markera chorób nerek Najnowocześniejsze technologie wykorzystywane przez współczesną naukę pozwalają na poszukiwanie nowych, wczesnych, a przede wszystkim czułych markerów uszkodzenia nerek w moczu. Jest to materiał łatwy do uzyskania i niewymagający stosowania metod inwazyjnych. Ideałem byłoby zidentyfikowanie jednego czułego markera, którego oznaczenie dałoby wyniki łatwe do interpretacji i pozwoliłoby nie tylko na potwierdzenie uszkodzenia nerek, ale także na precyzyjne wskazanie miejsca uszkodzenia narządu w przypadku, kiedy w materiale biopsyjnym nie są jeszcze widoczne zmiany morfologiczne lub są one minimalne. Idealny marker powinien również umożliwić różnicowanie typów chorób nerek, ze wskazaniem na konkretny typ uszkodzenia, biorąc po uwagę dostępne dane kliniczne i ocenę stanu nerek po zastosowaniu konwencjonalnych parametrów klinicznych, z możliwością zastosowania w różnych populacjach, biorąc pod uwagę rasę, wiek i płeć. Prowadzone badania, związane z poszukiwaniem nowych markerów diagnostycznych, ukierunkowane są zarówno na poszukiwanie zmian w ekspresji genów (transkryptomika, genomika funkcjonalna), jak i na poszukiwanie nowych białek lub innych związków organicznych o niewielkiej masie cząsteczkowej (proteomika, metabolomika, metabonomika), pojawiających się w moczu w procesie chorobowym, bądź też w zaprojektowanym laboratoryjnie modelu danej choroby nerek. Problem braku odpowiednio czułego i wczesnego markera uszkodzenia nerek widoczny jest szczególnie w badaniach klinicznych, gdzie konieczna jest ocena efektu nefrotoksycznego badanych preparatów. Nowoczesne technologie, takie jak mikromacierze, pozwalają na analizę zmian w ekspresji wielu genów jednocześnie, co jest pomocne w wyłonieniu potencjalnych biomarkerów. Tym sposobem wytypowano kilka genów, których ekspresja zmienia się w przypadku ostrego uszkodzenia nerek Są to m.in. geny kodujące takie białka jak klusteryna, osteopontyna, S-transferaza glutationu α, lipokalina związana z żelatynazą neutrofilów (NGAL- 1 neutrophil gelatinase-associated lipocalin), inhibitor metaloproteinaz typu 1 (TIMP-1), cząsteczka uszkodzenia nerek typu 1 (KIM-1 - kidney injury molecule), interleukina 18 (Il-18) oraz cystatyna C. Amerykańska Agencja ds. leków i Żywności (FDA) oraz Europejska Agencja ds. Leków (EMA) do oceny wczesnego uszkodzenia nerek przez preparaty testowane w badaniach klinicznych rekomendują stosowanie: KIM-1, klusteryny, cystatyny C, albumin i β2-mikroglobuliny oraz białka TFF3 (trefoil factor 3), a także stężenia białka w moczu [3]. Nowe markery chorób nerek w moczu Badania ostatnich lat skupiają się na poszukiwaniu markerów wczesnej diagnostyki chorób nerek związanych z uszkodzeniem kłębuszków nerkowych. Wcześnie pojawiające się zmiany mogą być związane z uszkodzeniem podocytów lub zmianami w błonie podstawnej. Mogą być one wykrywalne jedynie przy zastosowaniu zaawansowanych technik laboratoryjnych, takich jak mikroskopia fluorescencyjna czy elektronowa, pozwalające na ocenę zmian w tkance na poziomie niedostępnym dla klasycznie stosowanej w ocenie bioptatów nerki mikroskopii świetlnej. 1. Podocyty izolowane z moczu Mianem podocyturii określa się obecność podocytów w moczu. Wskaźnik ten może być markerem uszkodzenia nerek. Wykazano, że podocyty są wydalane z moczem i można je hodować w warunkach in vitro [4, 5]. Badania związane z oceną liczby podocytów w moczu wskazują, że ocena podocyturii może być znacznie czulszym wskaźnikiem, aniżeli powszechnie stosowane oznaczenia stężenia białka w moczu. Co więcej, wykazano, że podocyturia występuje na długo przed pojawieniem się białkomoczu i wzrostem poziomu kreatyniny we krwi oraz innych objawów klinicznych, związanych z uszkodzeniem nerek [6, 7]. Określenie liczby podocytów wydalanych z moczem może być wskaźnikiem aktywności choroby nerek [8, 9]. Do identyfikacji podocytów w moczu stosuje się najczęściej metody mikroskopii fluorescencyjnej wykorzystujące znakowane fluorochromami przeciwciała skierowane przeciwko białkom powierzchniowym charakterystycznym dla tych komórek. Najczęściej znakowane są: podokaliksyna (PDX), która jest zlokalizowana w części apikalnej komórki, nefryna i podocyna - białka błony szczelinowej oraz synaptopodyna, a także białko guza Willmsa 1 (WT1), pełniące funkcje czynnika transkrypcyjnego i ulegające ekspresji w jądrze komórkowym. Podejmuje się również próby analizy fenotypowej i ilościowej komórek kłębuszka nerkowego izolowanych z osadu moczu za pomocą cytometrii przepływowej [10, 11]. Do chwili obecnej nie zidentyfikowano jednak jednego markera charakterystycznego dla tych komórek, pozwalającego w łatwy sposób określić ich liczbę w próbce moczu. [12]. Co więcej, w moczu mogą znajdować się również komórki nabłonka ściennego torebki Bowmana (PEC - parietal epithelial cells), które również mogą wykazywać ekspresję białek charakterystycznych dla podocytów, np. podokaliksyny, dlatego 240

też właściwa ocena uzyskanych preparatów komórkowych wymaga zastosowania określonego panelu przeciwciał, z jednej strony, oraz współpracy doświadczonego cytologa, z drugiej. Ponadto, metody oceny komórek w osadzie moczu są czasochłonne i niosą ze sobą ryzyko przeszacowania, ze względu na to, że poza podocytami, w osadzie moczu mogą znajdować się również fragmenty komórek, które uległy zniszczeniu w procesie patologicznego odklejania się od błony podstawnej, bądź też w trakcie przechodzenia przez drogi moczowe. Z tego też powodu należałoby udoskonalić metodykę pozyskiwania komórek z osadu moczu tak, aby była to metoda łatwa w wykonaniu oraz opracować metodykę identyfikacji izolowanych podocytów, charakteryzującą się dużą czułością i swoistością oraz wystandaryzować opracowane techniki tak, aby wyniki uzyskiwane przez poszczególne jednostki mogły być ze sobą porównywalne. Dotychczas brak jest również norm dotyczących liczby podocytów w moczu, zarówno wśród osób zdrowych, jak i w poszczególnych jednostkach chorobowych, do których można byłoby odnieść wyniki własnych oznaczeń. 2. Białka podocytów wykrywane w moczu Wykazano, że podczas uszkodzenia nerek podocyty uwalniają do przestrzeni moczowej białka powierzchniowe [13]. Za pomocą metod immunoenzymatycznych oraz techniką Western blot w moczu wykrywane są białka charakterystyczne dla podocytów, np. podokaliksyna, nefryna i podocyna (supernatant i osad moczu). Na podstawie tych obserwacji powstał termin nefrynurii, na określenie dużej zawartości nefryny w próbkach moczu. Nefrynurię opisano w wielu modelach eksperymentalnych oraz w chorobach przebiegających z białkomoczem. Co ciekawe, badania osób z cukrzycą typu 1 wskazują na znaczny poziom nefrynurii, nie związanej z mikroalbuminurią, który może sugerować wartość diagnostyczną tego wskaźnika w ocenie wczesnego uszkodzenia podocytów kłębuszka nerkowego, jeszcze przed wystąpieniem mikroalbuminurii [14]. Podobnie, jak w przypadku nefryny, wykazano związek pomiędzy poziomem podokaliksyny w moczu (wyrażonym w stosunku do poziomu kreatyniny) a stopniem uszkodzenia nerek i nasileniem choroby w przypadku nefropatii IgA, toczniowego zapalenia nerek oraz popaciorkowcowego kłębuszkowego zapalenia nerek [15, 16]. 3. mrna w osadzie moczu Alternatywą dla wykrywania komórek nabłonka trzewnego kanalików nerkowych, czy też ich białek w osadzie moczu, jest ocena poziomu mrna dla tych białek, z wykorzystaniem ilościowej metody łańcuchowej reakcji polimerazy z odwrotną transkryptazą (qrt-pcr quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction). Wykazano, że poziom mrna dla nefryny i podocyny, w osadzie moczu, koreluje ze stopniem uszkodzenia nerek [17]. Wielkość współczynnika opisującego stosunek ilości mrna podocyny do mrna nefryny (PNR) może stanowić użyteczny wskaźnik progresji choroby nerek [18]. Co więcej, jak pokazały badania, poziom mrna dla tych białek lepiej odzwierciedla stopień aktywności glomerulopatii aniżeli białkomocz. Ponadto, na podstawie tych parametrów można wykazać różnicę pomiędzy świeżo zaistniałym uszkodzeniem nerek a zmianami już istniejącymi [19]. Podwyższony wskaźnik, opisujący stosunek pomiędzy ilością mrna glikoproteiny B7.1 a mrna nefryny w osadzie moczu, może być z kolei markerem różnicującym nefropatię zmian minimalnych (MCD - minimal-change disease) od ogniskowego segmentalnego stwardnienia kłębuszków nerkowych (FSGS, - focal segmental glomerulosclerosis) [20]. Użyteczność oznaczania profilu mrna w moczu w różnicowaniu stopnia uszkodzenia nerek w nefropatii cukrzycowej wykazał zespół Zhenga [21,22]. Na podstawie reakcji q-rt- PCR wykazali oni związek pomiędzy poziomem mrna dla białek podocytów tj. synaptopodyna, podocyna, podokaliksyna, białko CD2-AP i α-aktynina 4, a stężeniem kreatyniny w surowicy krwi, stężeniem białka w moczu oraz wielkością egfr. Cytowani badacze wykazali również użyteczność metody wykorzystującej całe panele genów (mikromacierze mrna) jako narzędzia charakteryzującego się wysoką wydajnością i czułością do oceny zmian w poziomie ekspresji mrna w osadzie moczu, ze wskazaniem przyszłych kierunków poszukiwania nowych biomarkerów uszkodzenia nerek. 4. Egzosomy i mikrocząstki w moczu Egzosomy to cząsteczki o średnicy 30 100nm, zbudowane z podwójnej błony białkowo lipidowej, białek przezbłonowych oraz rdzenia hydrofilowego zawierającego białka, mrna i microrna. Różnią się one od innych tego typu cząstek wielkością oraz tym, że powstają w obrębie endosomów i uwalniane są na zewnątrz drogą egzocytozy [23]. Egzosomy uważane są za nośniki horyzontalnego transferu informacji pomiędzy różnymi komórkami. W ten sposób mogą uczestniczyć w indukcji zmian epigenetycznych. Uwolnione z danego typu komórki, za pośrednictwem specyficznych ligandów, mogą wchodzić w interakcje z innymi komórkami, z biologicznie aktywnymi lipidami oraz specyficznymi białkami receptorowymi. Egzosomy obecne są we wszystkich płynach ustrojowych, w tym również w moczu. Jak wykazano, uwalniają je niemal wszystkie komórki nabłonkowe pozostające w kontakcie z przestrzenią moczową. Co więcej, wskazuje się na nie, jako na potencjalne markery diagnostyczne we wczesnym uszkodzeniu nerek [24]. Egzosomy można w prosty sposób wyizolować z osadu moczu. W tym celu wykorzystuje się metody separacji z zastosowaniem kulek magnetycznych, sprzężonych ze specyficznymi przeciwciałami. Szeroko stosowane są również metody tj. ultrafiltracja moczu z zastosowaniem nanomembran, ultrawirowanie oraz ultrawirowanie w gradiencie gęstości, często połączone z chromatografią wykluczenia (SEC size exclusion chromatography), rozdzielającą cząsteczki w zależności od wielkości, a w niektórych przypadkach również masy. W dalszym etapie prowadzi się identyfikację wyizolo- 241

Zastosowanie nowych markerów wydalanych z moczem w diagnostyce wczesnego uszkodzenia nerek wanych mikrocząstek za pomocą specyficznych przeciwciał znakujących białka powierzchniowe z zastosowaniem cytometrii przepływowej. W analizie morfologicznej i biochemicznej tych struktur wykorzystuje się mikroskopię elektronową i mikroskopie sił atomowych, immunoblotting, spektrometrię mas lub immunofluorescencję [23, 25]. Badania z zastosowaniem immunoblottingu mogą dostarczyć informacji na temat zawartości egzosomów i zmian tej zawartości, jakie zachodzą w różnych procesach patologicznych. Wykazano, że egzosomy mogą koncentrować czynniki transkrypcyjne. Z wykorzystaniem modelu ostrego uszkodzenia nerek (AKI) oraz modelu uszkodzenia podocytów kłębuszka nerkowego, wykazano podwyższony poziom aktywowanego czynnika transkrypcyjnego typu 3 (ATF3) w AKI oraz czynnika transkrypcyjnego guza Wilms`a (WT1) we wczesnym uszkodzeniu podocytów [26]. Markerem wskazującym na wystąpienie AKI może być również obecność fetuiny-a w egzosomach izolowanych z moczu [27]. Różnice w zawartości białek w egzosomach izolowanych z moczu, wykazano również u pacjentów z nefropatią IgA i nefropatią cienkich błon podstawnych [28]. Wszystkie te obserwacje wskazują na potencjalną możliwość wykorzystania egzosomów w poszukiwaniu nowych biomarkerów. Ponadto egzosomy, będące nośnikami mrna i microrna, stanowią dodatkową pulę materiału genetycznego możliwego do oznaczenia. Jak wykazano, przeprowadzenie wydajnej izolacji egzosomów może w znacznym stopniu zwiększyć czułość i swoistość analiz mrna z moczu [29]. Jakkolwiek dotychczas brak jednoznacznych informacji na temat tego czy i w jakim stopniu uszkodzenie nerek, białkomocz czy też wystąpienie niedokrwienia wpływa na zmianę ilości egzosomów uwalnianych do przestrzeni moczowej. Mikrocząstki to struktury błonowe o średnicy 100 1000 nm, uwalniane z powierzchni komórek, złożone z fragmentu błony komórkowej zawierającej często białka powierzchniowe charakterystyczne dla tych komórek. Podobnie jak egzosomy, mikrocząstki stanowią integralny składnik mikrośrodowiska międzykomórkowego i można je odnaleźć we wszystkich płynach ustrojowych, w tym również w moczu [30]. Ich ilość oraz skład może być wskaźnikiem zmian zachodzących w organizmie, dlatego też wiele badań koncentruje się na poszukiwaniu wśród nich potencjalnych biomarkerów. W badaniach podocytów i ich uszkodzenia w przebiegu kłębuszkowych zapaleń nerek wykazano, że poza komórkami nabłonkowymi i białkami powierzchniowymi, do przestrzeni moczowej uwalniane są także fragmenty błon podocytów, zawierające na swej powierzchni białka charakterystyczne dla tych komórek. Obecność struktur błonowych wykazujących ekspresje podokaliksyny wykazał zespół Hary [31]. Cytowani autorzy analizowali osady moczu, pochodzące od dzieci z zespołem nerczycowym, metodą immunofluorescencji pośredniej. Wykazali oni obecność struktur niekomórkowych, wykazujących reakcję pozytywną z podokaliksyną. Szczegółowa analiza z zastosowaniem mikroskopii elektronowej pozwoliła na zidentyfikowanie tych struktur, nazwanych PPGS (podocyte positive granular structures), jako ziarnistości zbudowanych z błony komórkowej, niezawierających białek cytoszkieletu. Obecność na powierzchni podokaliksyny, może sugerować pochodzenie tych cząsteczek z części apikalnej komórki podocytów i odzwierciedlać dynamikę zmian w błonie komórkowej komórek kłębuszka nerkowego w odpowiedzi na uszkodzenie [31]. Dalsza analiza wykazała brak markerów egzosomalnych na powierzchni tych struktur (CD24 i CD63), co sugeruje, że nie pochodzą one z egzosomów podocytów, a raczej z pęcherzyków mikrokosmków zlokalizowanych w części szczytowej podocytów kłębuszka nerkowego [32]. Zmiany w ilości mikrocząstek wykazujących ekspresję podokaliksyny mogą świadczyć o zaistniałym uszkodzeniu w obrębie kłębuszka nerkowego. Jednakże, podobnie jak w przypadku oceny całkowitej liczby podocytów w osadzie moczu, brakuje jednego markera charakteryzującego mikrocząstki pochodzenia podocytarnego. 5. microrna jako nowy marker uszkodzenia nerek MicroRNA (mirna) to krótkie, niekodujące cząsteczki kwasu rybonukleotydowego, długości 20 22 nukleotydów, które uczestniczą w regulacji wielu procesów fizjologicznych. Te endogennie produkowane transkrypty stanowią element horyzontalnego transferu informacji. Wpływają na procesy ekspresji genów, poprzez blokowanie procesu translacji białek lub przez indukowanie degradacji powstałego RNA. Odkrycie tych cząsteczek na początku lat dziewięćdziesiątych ubiegłego stulecia, zrewolucjonizowało dotychczasową wiedzę na temat mechanizmów regulacji ekspresji genów, mających wpływ na przebieg wielu procesów biologicznych, tj. proliferacja i różnicowanie komórek, apoptoza czy metabolizm, a także powstawania i rozwoju procesów patologicznych w komórkach i tkankach organizmu. Dzięki porównaniu profilu ekspresji mirna w różnych narządach, wykazano istnienie grupy mirna specyficznych dla nerki, składającej się z mir-192, mir-194, mir-204, mir-215 i mir-216 [33,34]. Dalsze badania wykazały zróżnicowanie ekspresji mirna w obrębie kory i rdzenia nerki, co może wskazywać na istnienie różnic funkcjonalnych w obrębie tych cząstek [35]. Specyficzność narządowa czyni mirna doskonałymi kandydatami na nowe biomarkery powstawania i rozwoju zmian patologicznych w nerce. Dotychczas do oznaczania mirna w materiale biologicznym wykorzystywano metody sekwencjonowania z puli całkowitego RNA. Dostępne dziś techniki typu blot RNA, pozwalają na jakościową i ilościową analizę wielu cząsteczek mirna w próbkach całkowitego RNA. Rozwój technik z zastosowaniem mikromacierzy umożliwił oznaczenie jednorazowo do kilku tysięcy cząsteczek mirna w jednej próbce. Do oznaczeń ilościowych i jakościowych mirna w próbkach biologicznych zaadaptowano również technikę PCR w czasie rzeczywistym z zastosowaniem odwrotnej transkryptazy (real time reverse-transcription PCR) [36]. Związek pomiędzy regulacyjną funkcją mirna a rozwojem zmian patologicznych w obrębie kłębuszków i kanalików 242

nerkowych, wykazano po raz pierwszy u myszy z delecją genu kodującego Dicer w komórkach podocytów. Jest to enzym niezbędny do produkcji funkcjonalnych cząsteczek microrna [37, 38]. U zmutowanych myszy zaobserwowano białkomocz, zmiany w błonie filtracyjnej kłębuszka, zmiany w morfologii podocytów (wakuolizacja i przerost komórek, odróżnicowanie, związane z zaburzoną strukturą białek cytoszkieletu oraz utratę ekspresji synaptopodyny), odklejanie się wyrostków stopowatych podocytów od błony podstawnej, zaburzenia w procesach apoptozy i proliferacji oraz wypadanie podocytów do przestrzeni moczowej i rozrost komórek mezangium. Obserwowano szybki postęp zmian prowadzących do albuminurii, szkliwienia kłębuszków oraz włóknienia cewkowo śródmiąższowego, co prowadziło do schyłkowej niewydolności nerek i śmierci [36]. Dzięki badaniom z zastosowaniem mutantów Dicer zidentyfikowano trio mirna, charakterystyczne dla danego typu komórek w prawidłowym kłębuszku nerkowym: komórek endotelialnych (mir-126), komórek mezangialnych (mir-145) oraz podocytów (mir- 30a). Okazało się, że delecja Dicer wiązała się z całkowitą utratą zdolności do syntezy cząsteczek mirna przez podocyty, co potwierdzał całkowity brak mir-30a, bez zmian w ekspresji mir-126 i mir-145 [39]. Badania wykazały istotną rolę mirna w fizjologii i patologii nerki, w tym kłębuszków nerkowych i podocytów (szczególnie mir-30) i zapoczątkowały serię prac związanych z poszukiwaniem potencjalnych markerów uszkodzenia nerek. Zmiany w profilu mirna wykazano m.in. w biopsjach nerki pacjentów z nefropatią cukrzycową, wielotorbielowatością nerek, nefropatią toczniową, nefropatią IgA, w guzach nerek, w procesie włóknienia oraz w odrzucaniu nerki przeszczepionej [39, 40]. Duże nadzieje na opisanie potencjalnych biomarkerów wczesnego uszkodzenia nerek, wiąże się z wykryciem mir- NA we wszystkich płynach ustrojowych. Dotychczas opisano 22 różnych cząsteczek mirna w moczu. Mimo że żadna z tych cząsteczek nie jest specyficzna dla nerki [41], badania wskazują na zmiany w profilu tych cząsteczek w moczu w różnych stanach chorobowych. Hanke i wsp. wykazali zmiany w ekspresji mirna izolowanych z osadu moczu w raku pęcherza moczowego [42] oraz w toczniu układowym [43]. Na podstawie różnic w ekspresji mir-27b i mir-192, pochodzących z egzosomów izolowanych z moczu, dokonano różnicowania pacjentów z toczniem, któremu towarzyszy zapalenie nerek od tych, którzy takich komplikacji nie wykazują, oraz pomiędzy nefropatią kłębuszkową a cewkową, jak wykazano w modelu uszkodzenia nerek u szczura [44]. Wśród pacjentów z nefropatią IgA wykazano obniżoną ekspresję mir-200a, mir-200b i mir-429, która korelowała z nasileniem choroby, ocenianym na podstawie standardowo oznaczanych parametrów funkcji nerek, w tym wielkości białkomoczu [45]. Z kolei analiza poziomu mirna, należących do grupy regulatorów odpowiedzi immunologicznej, w tej grupie pacjentów wskazała znacząco wyższy poziom ekspresji mir-146a i mir-155 zarówno w moczu, jak i w tkance, związany istotnie ze stopniem zaawansowania zarówno klinicznego, jak i histopatologicznego choroby [46]. W badaniach mirna izolowanych z moczu u dzieci z idiopatycznym zespołem nerczycowym wykazano znacząco wyższy poziom ekspresji mir-30a-5p, którego spadek korelował z poprawą kliniczną pacjentów uzyskiwaną w trakcie leczenia [47]. Ponadto Wang i wsp. wykazali [48] znacząco wyższy poziom mir-10a i mir-30d w moczu pacjentów z FSGS, w porównaniu z osobami zdrowymi, wskazując jednocześnie na potencjalną możliwość wykorzystania tych cząsteczek we wczesnej diagnostyce uszkodzenia nerek. Według autorów, ocena poziomu mir-10a i mir-30d charakteryzuje się wyższą czułością w porównaniu z klasycznie oznaczanym poziomem mocznika we krwi, w korelacji uzyskanych wyników z obrazem histopatologicznym. Za pomocą metody profilowania cząsteczek mirna wykazano również 1,2-krotnie wyższy poziom mir-21 oraz 1,5-krotnie niższy poziom mir- 155 w moczu pacjentów z ostrą niewydolnością nerek, w porównaniu z grupą kontrolną [49]. Badania z wykorzystaniem mrna wykazały, że badane mirna uczestniczą w regulacji ekspresji genów zaangażowanych w procesy apoptozy i proliferacji komórek. Autorzy wskazują na znaczenie tych dwóch typów mirna w patogenezie ostrego uszkodzenia nerek oraz na możliwości diagnostyczne zarówno mir-21, jak i mir-155 we wczesnej diagnostyce tego typu uszkodzenia. Z kolei, Neil i wsp. [50] porównywali poziom wybranych mirna (mir-16, mir21, mir-155, mir-210 i mir-638) w moczu pacjentów w różnych stadiach przewlekłej choroby nerek (CKD chronic kidney disease) oraz u pacjentów leczonych nerkozastępczo. Cytowani badacze nie wykazali istotnych różnic w poziomie ekspresji tych mirna w różnych stadiach zaawansowania choroby nerek oraz w porównaniu z grupą osób zdrowych, za wyjątkiem mir-638, który wykazywał znaczący wzrost w moczu pacjentów znajdujących się w stadium 4 CKD, w porównaniu z grupą kontrolną i grupą w stadium 3 CKD. Uzyskane wyniki mogą sugerować, niewielki udział nerek w fizjologicznym usuwaniu krążących mirna, a także na inny profil zmian w ekspresji tych cząsteczek w zależności od stopnia zaawansowania uszkodzenia nerek. Istnieje również możliwość, że mirna w moczu ulegają degradacji w stopniu większym, aniżeli w osoczu krwi, ze względu na zwiększoną akumulację białek niskocząsteczkowych w moczu, tj. RNazy, które mogą mieć wpływ na poziom mirna [50]. Badania mirna we krwi wskazują, że tylko niewielka część tych cząsteczek krąży swobodnie. Znaczna większość jest związana z nośnikiem, chroniącym je przed degradacja, którym mogą być mikrocząstki, kompleksy białkowe zawierające białka Argo-1 lub 2 lub też lipidy o wysokiej gęstości [23, 51]. Mimo wielu niewiadomych, badania nad mirna trwają nadal, a wyniki wydają się być obiecujące zarówno w obszarze wczesnej diagnostyki chorób nerek, badań nad patogenezą, jak i w kontekście poszukiwania potencjalnych celów terapeutycznych. 243

Zastosowanie nowych markerów wydalanych z moczem w diagnostyce wczesnego uszkodzenia nerek Podsumowanie Dotychczas nie istnieje jeden czuły i swoisty marker diagnostyczny chorób nerek. Nadal istnieje konieczność wykonywania oznaczeń kilku parametrów oceniających funkcje nerek, zarówno w moczu, jaki i we krwi obwodowej. Ideałem byłoby skonstruowanie jednego konkretnego panelu markerów, którego oznaczenie w jednoznaczny sposób wskazałoby, nie tylko na zaistnienie uszkodzenia, ale również pozwoliłoby na sprecyzowanie miejsca w nefronie, gdzie takie uszkodzenie nastąpiło. Póki co, wykorzystując zdobycze współczesnej nauki w diagnostyce medycznej, poszukiwania takich markerów wciąż trwają. Biorąc pod uwagę coraz więcej doniesień na temat zaburzeń w ekspresji mirna w chorobach nerek, jest nadzieja na zastosowanie tych cząsteczek nie tylko w badaniach nad patogenezą chorób nerek, w przewidywaniu wczesnych zmian i w diagnostyce klinicznej, a także jako cel terapeutyczny w przewlekłych chorobach nerek, osiągnięty dzięki możliwości takiego manipulowania poziomem mirna, aby doprowadzić do przywrócenia właściwej ekspresji genów i usprawnienia funkcji nerek. Podziękowania Publikacja jest częścią projektu Wrovasc Zintegrowane Centrum Medycyny Sercowo Naczyniowej, współfinansowanego przez Europejski Fundusz Rozwoju Regionalnego, w ramach Programu Operacyjnego Innowacyjna Gospodarka na lata 2007-2013 realizowanego w Wojewódzkim Szpitalu Specjalistycznym we Wrocławiu, Ośrodku Badawczo-Rozwojowym. Fundusze Europejskie dla rozwoju innowacyjnej gospodarki. Piśmiennictwo 1. Agarwal R. Estimating GFR from serum creatinine concentrations: pitfalls of GFR-estimating equations. Am J Kidney Dis 2005; 45: 610-613. 2. Satirapoj B, Nast CC, Adler SG. Novel insight into relationship between glomerular pathology and progressive kidney disease. Adv Chronic Kidney Dis 2012; 19: 93-100. 3. Lock E. Sensitive and early markers of renal injury: where are we and what is the way forward? Toxicological Science 2010; 116:1-4. 4. Petermann A, Krofft R, Blonsky M, et al. Podocytes that detach in experimental membranous nephropathy are viable. Kidney Int 2003; 64: 1222-1231. 5. Vogelmann S, Nelso WJ, Myers BD, et al. Urinary excretion of viable podocytes in health and renal disease. Am J Physiol Renal Physiol 2003; 285: 40-48. 6. Yu D, Petermann A, Kunter U, et al. Urinary podocyte loss is a more specific marker of ongoing glomerular damage than proteinuria. J Am Soc Nephrol 2005; 16: 1733-1741. 7. Petermann A, Floege J. Podocyte damage resulting on podocyturia: a potential diagnostic marker to asses glomerular disease activity. Nephron Clin Pract 2007; 106: 61-66. 8. Hara M, Yanagihara T, Takada T, et al. Urinary excretion of podocytes reflects disease activity in children with glomerulonephritis. Am J Nephrol 1998; 18: 35-41. 9. Nakamura T, Ushiyama C, Suzuki S, et al. Urinary podocytes for the assessment of disease activity in lupus nephritis. Am J Med Sci 2000; 320: 112-116. 10. Habara P, Marečkowá H, Sopková Z, et al. A novel method for the estimation of podocyte injury: podocalyxin-positive elements in urine. Folia Biologica (Praha) 2008; 54: 162-167. 11. Habara P, Marečkowá H, Malicková K, et al. Novel flow cytometric method for the detection of podocalyxin-positive elements in urine of patients with glomerulonephritides first promising results. Folia Biologica (Praha) 2012; 58: 57-63. 12. Skoberne A, Konieczny A, Schiffer M. Glomerular epithelial cells in the urine: what has to be done to make them worthwhile? Am J Physiol Renal Physiol 2009; 296: 230-241 13. Hara M, Yamagata K, Tomino Y, et al. Urinary podocalyxin is an early marker for podocyte injury in patients with diabetes: establishment of a high sensitive ELISA to detect urinary podocalyxin. Diabetologia 2012; 55: 2913-2919. 14. Camici M. Urinary detection of podocyte injury. Biomed Pharmacother 2007; 61: 245-249. 15. Tesch GH. Review: Serum and urine biomarkers of kidney disease: a pathophysiological perspective. Nephrol 2010; 15: 609-616. 16. Asao R, Asanuma K, Kodama F, et al. Relationship between levels of urinary podocalyxin, number of urinary podocytes and histologic injury in adults patients with IgA nephropathy. Clin J Am Nephrol 2012; 7: 1385-1393. 17. Sato Y, Wharram BL, Lee SK, et al. Urine podocyte mrna mark progression of renal disease. J Am Soc Nephrol 2009; 20: 1041-1052. 18. Fukuda A, Wickman LT, Venkatareddy MP, et al. Urine podocin:nephrin mrna ratio (PNR) as a podocyte stress biomarker. Nephrol Dial Transplant 2012; 27: 4079-4087. 19. Szeto CC, Lai KB, Chow KM. i wsp. Messenger RNA expression of glomerular podocyte markers in the urinary sediment of acquired proteinuric diseases. Clin Chim Acta 2005; 361: 182-190. 20. Navarro-Munoz M, Ibernon M. Perez V, et al. Messenger RNA expression of B7.1 and NEPHS1 in urinary sediment could be useful to differentiate between minimal-change disease and focal segmental glomerulosclerosis in adult patients. Nephrol Dial Transplant 2011; 26: 3914-3923. 21. Zheng M, Lv L-L, Ni J, et al. Urinary podocyte-associated mrna profile in various stages of diabetic nephropathy. Plos ONE 2011; 6: 1-7. 22. Zheng M, Lv L-L. Cao Y-H. i wsp. A pilot trial assessing urinary gene expression profiling with an mrna array for diabetic nephropathy. Plos ONE 2012; 7: 1-5. 23. Fang D, King H, Li J, et al. Exosomes and the kidney: blaming the Messenger. Nephrology 2013; 18: 1-10. 24. Pisitkun T, Shen RF, Knepper MA. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine. Proc Natl Acad Sci USA 2004; 101: 13368-13373. 25. Rood IM, Deegens JK, Merchant ML, et al. Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome. Kidney Int 2010; 78: 810-816. 26. Zhou H, Cheruvanky A, Hu X, et al. Urinary exosomal transcription factors, a new class of biomarkers for renal disease. Kidney Int 2008; 74: 613-621. 27. Zhou H, Pisitkun T, Aponte A, et al. Exosomal fetuin-a identified by proteomics: a novel urinary biomarker for detecting acute kidney injury. Kidney Int 2006; 70: 1847-1857. 28. Moon PG, Lee JE, You S, et al. Proteomics analysis of urinary exosomes from patients of early IgA nephropathy and thin basement membrane nephropathy. Proteomics 2011; 11:2459-2475. 29. Miranda KC, Bond DT, McKee M, et al. Nuclei acids within urinary exosomes / microvesicles are potential biomarkers for renal disease. Kidney Int 2010; 78: 191-199. 30. Budaj M, Poljak Z, Ďuriš I, et al. Microparticles: a component of various diseases. Pol Arch Med. Wewn 2012; 122: 24-29. 31. Hara M, Yanagihara T, Kihara I, et al. Apical cell membranes are shed into urine from injured podocytes: a novel phenomenon of podocyte injury. J Am Soc Nephrol 2004; 16: 408-416. 32. Hara M, Yanagihara T, Hirayama Y, et al. Podocyte membrane vesicles in urine originate from tip vesiculation of podocyte mi- 244

crovilli. Human Pathology 2010; 41: 1265-1275. 33. Liu CG, Calin GA, Meloon B, et al. An oligonucleotyde microchip for genome-wide microrna profiling in human and mouse tissues. Proc Natl Acad Sci USA 2004; 101: 9740-9744. 34. Sun Y, Koos S, White N, et al. Development of a micro-array to detect human and mouse micrornas and characterization of expression in human organs. Nucleic Acid Res 2004; 32: e188. 35. Tian Z, Greene AS, Pietrusz JL, et al. Micro-RNA target pairs in the rat kidney identified by microrna microarray, proteomics and bioinformatics analysis. Genome Res 2008; 18: 404-411. 36. Li JY, Yong TY, Michael MZ, et al. Review: the role of micrornas in kidney disease. Nephrol 2010; 15: 599-608. 37. Harvey SJ, Jarad G, Cunningham J, et al. Podocyte-specific deletion of dicer alters cytoskeletal dynamics and causes glomerular disease. J Am Soc Nephrol 2008; 19: 2150-2158. 38. Ho J, Ng KH, Rosen S, et al. Podocyte-specific loss of functional micrornas leads to rapid glomerular and tubular injury. J Am Soc Nephrol 2008; 19: 2069-2075. 39. Saal S, Harvey SJ. MicroRNAs and the kidney: coming of age. Curr Op Nephrol Hypert 2009; 18: 317-323. 40. Kaucsár T, Rácz Z, Hamar P. Post-transcriptional gene-expression regulation by micro RNA (mirna) network in renal disease. Adv Drug Delivery Rev 2010; 62: 1390-1401. 41. Melkonyan HS, Feaver WJ, Meyer E, et al. Transrenal nucleic acids: from proof of principle to clinical tests. Ann N Y Acad Sci 2008; 1137: 73-81. 42. Hanke M, Hoefig K, Merz H, et al. A robust methodology to study urine microrna as tumor marker: MicroRNA-126 and micror- NA-182 are related to urinary bladder cancer. Urol Oncol 2010; 28: 655-661. 43. Wang G, Tam LS, Kwan BC, et al. Expression of mir-146a and mir-155 in the urinary sediment of systemic lupus erythematosus. Clin Rheumatol 2012; 31: 435-440. 44. Zhou H, Cleary RC, Bogaert YE, et al. Combination of micror- NA192 and microrna27b from urinary exosomes differentiate between renal tubular damage and glomerular injury. J Am Soc Nephrol 2008; 19: 672A. 45. Wang G, Kwan BC, Lai F, et al. Expression of micorna in the urinary sediment of patients with IgA nephropathy. Disease Markers 2010; 28: 79-86. 46. Wang G, Kwan BC, Lai FM, et al. Elevated levels of mir-146a and mir-155 in kidney biopsy and urine from patients with IgA nephropathy. Dis Markers 2011; 30: 171-179. 47. Lou Y, Wang C, Chen X, et al. Increased serum and urinary micrornas in children with idiopathic nephrotic syndrome. Clin Chem 2013; 59: 658-666. 48. Wang N, Zhou Y, Jiang L, et al. Urinary microrna-10a and microrna-30d serve as novel, sensitive and specific biomarkers for kidney injury. PLOS One 2012; 7: e51140. 49. Saikumar J, Hoffman D, Kim TM, et al. Expression, circulation and excretion profile of microrna-21, -155 and -18a following acute kidney injury. Toxicol Sci 2012; 129: 256-267. 50. Neal CS, Michael MZ, Pimlott LK, et al. Circulating microrna expression is reduced in chronic kidney disease. Nephrol Dial Transplant 2011; 26: 3794-3802. 51. Rayner KJ, Hennesy EJ. Extracellular communication via microrna: lipid particles have a new message. J Lipid Res 2013; 54: 1174-1181. Adres do korespondencji: dr n. med. Agnieszka Czyżewska-Buczyńska Wojewódzki Szpital Specjalistyczny we Wrocławiu Ośrodek Badawczo-Rozwojowy 51-124 Wrocław, ul. H. Kamieńskiego 73A Tel. 0048 71 3270516; faks 0048 71 3270554 e-mail: buczynska@wssk.wroc.pl Zaakceptowano do publikacji: 21.08.2013 245