Co to jest spektrometria mas? Jest to nowoczesna technika analityczna pozwalająca na dokładne wyznaczenie masy analizowanej substancji Dokładność pomiaru może się wahać od jednego miejsca dziesiętnego m/z (niska rozdzielczość) do 6 miejsc po przecinku (wysoka rozdzielczość) Metodę charakteryzuje wyjątkowo wysoka czułość (piko/femto mole)
Co to jest spektrometria mas? Spektrometr masowy Instrument pozwalający na precyzyjny pomiar stosunku masy do ładunku (m/z) analizowanych substancji
Rozdzielczość Masa średnia Masa monoizotopowa
Zastosowania Biotechnologia: Farmakologia: analiza białek, peptydów, oligonukleotydów, badanie aktywności enzymów monitorowanie przebiegu syntez i metabolizmu leków Badania kliniczne: badania przesiewowe noworodków przeciwko fenyloketonurii i innym chorobom metabolicznym Toksykologia: określanie stężeń substancji toksycznych i ich metabolitów w płynach ustrojowych Ochrona środowiska: określenie czystości wody, powietrza
Zastosowania Inne: Badania antydopingowe: wykrywanie sterydów anabolicznych w moczu zawodników Monitorowanie oddechu pacjenta podczas operacji Wykrywanie obecności w organizmie Helicobacter Pylori (analiza wydychanego powietrza) Badanie autentyczności dzieł sztuki Kontrola procesów chemicznych w przemyśle Diagnostyka chorób Biotechnologia: analiza białek, peptydów (ustalanie sekwencji aminokwasów), badanie aktywności enzymów PROTEOMIKA
Spektrometr masowy Wprowadzenie próbki Spektrometr masowy MH + M + M + M + M + M + Źródło jonów Analizator Detektor M - m/z Widmo masowe Komputer
Wprowadzenie próbki Poszczególne układy różnią się zależnie od stanu skupienia analizowanej próbki jak również metody jonizacji zastosowanej do analizy. 1. Stan stały: sondy z probówką, płytki (jonizacja typu EI, MALDI) 2. Stan ciekły: zawory wstrzykowe, pompy strzykawkowe, systemy HPLC, elektroforeza kapilarna (jonizacja typu ESI) 3. Stan gazowy: układy chromatografii GC, komory próżniowe (jonizacja typu EI, CI, ICP)
Jonizacja jonizacja jony dodatnie [M+nX] n+ : przyłączenie naładowanej cząstki masa większa o masę przyłączonego kationu jony ujemne [M-nH] n- : oderwanie naładowanej cząstki masa mniejsza o masę oderwanego kationu kationorodniki M +. : oddanie elektronu masa praktycznie identyczna z masą wyjściowej cząsteczki
Jonizacja jonizacja jony dodatnie [M+nX] n+ : Białka, peptydy Obecność grup NH 2 jony ujemne [M-nH] n- : Sacharydy, oligosacharydy, nukleotydy Obecność grup COO, SO 3 H, H 2 PO 4 kationorodniki M +. : Związki niepolarne o małej masie
Jonizacja elektronami EI (electron impact) M + e(70ev) -----> M +. + 2e włòkno żarowe pròbka jony do analizatora kolektor optyka jonòw
Jonizacja plazmą wzbudzoną indukcyjnie ICP W źródle jonów znajduje się palnik plazmowy (rura kwarcowa) otoczony cewką przez którą płynie prąd zmienny o wysokiej częstotliwości Do plazmy wprowadza się roztwór próbki w postaci areozolu W wyniku wzbudzenia jonów w plazmie przez pole magnetyczne generowane przez prąd płynący wokół rury z plazmą, plazma rozgrzewa się (nawet 12 000-15 000 K) Cząsteczki metalu wprowadzone do plazmy pod wpływem temperatury ulegają jonizacji z wydajnościa 100% Plazma: gaz pozytywnie i negatywnie naładowanych cząstek o równym stężeniu (wypadkowy ładunek wynosi zero). Właściwości tego gazu są kontrolowane przez siły elektromagnetyczne
Electrospray ESI zasilanie gaz osuszający analizator masowy anoda katoda stożek Taylora rozpad kropli
Electrospray ESI Zastosowanie: Średnio- i wysokocząsteczowe substancje organiczne, peptydy, białka, polimery, kwasy nukleinowe w postaci ciekłej. Zakres 50 80 000 Da Detekcja w chromatografii cieczowej (!!!), biochemia, biotechnologia, farmakologia, kontrola antydopingowa
MALDI Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation
MALDI Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation Laser Źródło jonów V 1 V 2 Analizator Detektor ISD Fragmentacja następuje bezpośrednio w źródle jonów. Nie ma możliwości wyselekcjonowania jonu macierzystego.
Anchor Chip Zwiększanie zatężenia próbki Wyższa czułość
Desorpcja/jonizacja na porowatym krzemie DIOS Stosowanie specjalnie spreparowanych płytek z porowatego krzemu (DIOS) lub porowatego ditlenku krzemu (DIOSD) pozwala na bezpośrednią jonizację próbki, bez używania matrycy Funkcje matrycy pełni porowaty krzem
Płytka krzemowa używana w eksperymentach DIOS (Desorption/Ionization on Porous Silicon) - desorpcja/jonizacja na porowatym krzemie. Zdjęcie wykonano w Laboratorium Mikroskopii Skaningowej z Emisją Polową i Mikroanalizy w ING UJ
Ostrza krzemowe (ang. nano towers, NT) Dzięki uprzejmości dr A. Góreckiej- Drzazgi
Analizatory Analizator kwadrupolowy (Q) Pułapka jonów (IT) Analizator czasu przelotu (TOF) Analizatory magneto-elektrostatyczne (B/E) Spektrometria cyklotronowego rezonansu jonowego (ICR) Orbitrap
Analizator kwadrupolowy (Q)
Analizator kwadrupolowy (Q)
Pułapka jonów (IT)
Pułapka jonów (IT)
Analizator czasu przelotu TOF Analizator Reflektor J3 J2 J1 F1 F2 F3 J1 Źródło jonów Detektor
Analizator czasu przelotu TOF TRYB Z ODBICIEM TRYB LINIOWY
Spektrometria cyklotronowego rezonansu jonowego (ICR)
Orbitrap
Analizatory - podsumowanie Q IT TOF TOF reflectron FTICR Orbitra p Limit m/z 4 000 6 000 1 000 000 10 000 30 000 50 000 Rozdzielczość FWHM (1 000 m/z) 3 000 10 000 5 000 60 000 1 000 000 250 000 Dokładność 100 ppm 100 ppm 200 ppm 10 ppm < 5 ppm < 5 ppm Praca Ciągła Impulsowa Impulsowa Impulsowa Impulsowa Impulsowa Ciśnienie 10-5 Torr 10-3 Torr 10-6 Torr 10-6 Torr 10-10 Torr 10-10 Torr
Widmo masowe polimeru
Widmo masowe Hemoglobiny
Widmo masowe Hemoglobiny
Oznaczanie ładunku jonu 1295.72 Da 1758.96 Da 1618.86 Da
Związki zawierające brom Br x 78.9 80.9 Br xy (Br 2 ) 159.8 157.8 161.8 78.9 80.9 Br y 79 Br x + 79 Br y = 158 Br xy 81 Br x + 81 Br y = 162 Br xy 79 Br x + 81 Br y = 160 Br xy 81 Br x + 79 Br y = 160 Br xy
Związki zawierające brom
Fragmentacja (QqQ) Soczewki Żródło jonów Analizator 1 Komora kolizyjna Analizator 2 Detektor 1 Detektor 2
MALDI-PSD (TOF/TOF) TOF 1 TOF 2 Analizator Reflektor Źródło jonów LIFT Detektor
Widma fragmentacyjne
Proces fragmentacji x 1 y 1 z 1 x 2 y 2 z 2 x 3 y 3 z 3 H 2 N R 1 O N H R 2 O H N R 3 O N H R 4 O OH a 1 b 1 c 1 a 2 b 2 c 2 a 3 b 3 c 3
424.147 424.147 152.133 314.174 442.222 513.261 600.321 657.408 1858.116 152.133 314.174 442.222 513.261 600.321 657.408 1858.116 1168.622 1168.622 1305.671 1305.671 1539.846 1539.846 1840.155 1840.155 215.146 841.430 940.543 1055.514 1392.698 1703.014 1939.995 215.146 841.430 940.543 1055.514 1392.698 1703.014 1939.995 Intens. [a.u.] Intens. [a.u.] 754.390 754.390 1804.108 1804.108 175.159 175.159 225.132 225.132 265.132 265.132 313.166 313.166 366.187 366.187 499.240 499.240 441.223 540.283 582.378 441.223 540.283 582.378 1147.380 1147.380 1204.620 1204.620 110.093 636.293 749.356 1100.593 1237.711 1291.422 1324.747 1362.643 1490.776 1537.596 1589.902 1647.863 1692.079 1735.924 110.093 600.330 636.293 749.356 1100.593 1237.711 1291.422 1324.747 1362.643 1490.776 1537.596 1589.902 1647.863 1692.079 1735.924 600.330 987.507 987.507 1050.498 1050.498 864.401 864.401 773.412 773.412 Intens. [a.u.] Intens. [a.u.] 686.367 686.367 Wyniki MALDI-PSD x10 4 4 R K * 090306_probki_krakow_CCA_pm16_digested_1735.924\0_D19\1\1735.9240.LIFT\1SRef 18.09 A V Q A S G P S V D I/L H S F Y T T Y F S H I/L D V S P G S A Q V K 3 A R 2 1 0 x10 4 1.0 090316_probki_krakow_CCA_pm16_digested_K-TAG+CAF_Lift_1939.994\0_I19\1\1939.9940.LIFT\1SRef K-TAG V Q A S G P S V D I/L H S F Y T Sulf 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 m/z
Literatura J. Silberring, R. Ekman, Mass spectrometry and hyphenated techniques in neuropeptide research, Willey-Interscience, NY 2002 P.Suder, J. Silberring, Spektrometria mas, Wyd. UJ, Kraków 2006 E. de Hoffman, V. Stroobant, Mass spectrometry, Principles and Applications, Willey, England 2007