SKUTECZNOŚĆ IZOLACJI Wydajność izolacji- ilość otrzymanego kwasu nukleinowego Efektywność izolacji- jakość otrzymanego kwasu nukleinowego w stosunku do ilości Powtarzalność izolacji- zoptymalizowanie procedury pozwalające na otrzymywanie zbliżonej wydajności i tej samej efektywności 2 Podstawowe miary masy i objętości stosowane przy oznaczaniu ilości kwasów nukleinowych : 1g (1) 1l (1) 1mg (1g x 10-3 ) 1ml (1l x 10-3 ) 1μg (1g x 10-6 ) 1μl (1l x 10-6 ) 1ng (1g x 10-9 ) 1pg (1g x 10-12 ) 3 NUKLEINOWYCH PO IZOLACJI? Przybliżone szacowanie izolowanego DNA: 1 komórka ludzka zawiera ok. 6pg DNA; jeśli próbka zawiera przeciętnie 10 7 komórek, a wydajność izolacji szacujemy na poziomie 80%, to powinniśmy otrzymać ok 48mg DNA Metoda nieskuteczna! - różne rodzaje tkanek będą zawierały różną liczbę komórek; - stopień degradacji DNA w komórkach może być różny; - trudno jest określić faktyczną wydajność stosowanej metody bez odniesienia do kalibratora- żywej komórki 4 1
NUKLEINOWYCH PO IZOLACJI? Przybliżone szacowanie izolowanego DNA: krew obwodowa (20-60μg/ml) surowica (100-250μg/ml) tkanka kostna (2-25μg/mg) nabłonek jamy ustnej w ślinie (5-15μg/ml) W przypadku RNA, metoda ta jest w ogóle niemożliwa, ponieważ nie znamy ilości RNA (niskocząsteczkowego) w komórce oraz nie jesteśmy w stanie określić stopnia degradacji RNA od momentu pobrania tkanki do zakończenia izolacji. 5 Spektrofotometryczny pomiar stężenia DNA lub RNA: Spektrofotometria absorpcyjna w ultrafiolecie to selektywna absorpcja/absorbancja promieniowania elektromagnetycznego przez substancjęw tym przypadku cząsteczki kwasu nukleinowego Cząsteczki DNA i RNA absorbują światło ultrafioletowe o długości 260nm Miernikiem absorpcji jest gęstość optyczna (OD)- optical density mierzona na fotodetektorze OD= log Intensywność światła emitowanego (padającego na detektor) Intensywność światła przechodzącego przez detektor 6 7 NanoDropspektrofotometr wykorzystujący napięcie powierzchniowe do rozciągnięcia kropli roztworu i utworzenia kolumny między dwoma włóknami światłowodów, przepuszczających światło UV (w skali widzialnej). Zakres spektralny urządzenia wynosi od 220 do 750 nm. 2
1 OD/A 260 = 50µg/ml dwuniciowej cząsteczki DNA 1 OD/A 260 = 40µg/ml jednoniciowej cząsteczki RNA 1 OD/A 260 = 37µg/ml jednoniciowej cząsteczki DNA W pomiarze spektrofotometrycznym cząsteczki DNA oraz RNA są nierozróżnialne!!! 8 Dodatkowy pomiar absorpcji fali daje możliwość wykrycia zanieczyszczeń w próbce: 230nm (absorbowana przez związki organiczne: fenole; alkohole; izocyjanki) 280nm (absorbowana przez białka) 340nm (zanieczyszczenie próbki substancjami inne niż wymienione) 9 Prawidłowy wykres absorpcji uzyskany w spektrofotometrycznym pomiarze próbki zawierającej kwas nukleinowy 10 3
11 Iloraz OD/A 260 i OD/A 280 lub OD/A 260 i OD/A 230 (ratio) pozwala oszacować czystość kwasów nukleinowych Prawidłowa wartość Ratio A 260 /A 280 oraz A 260 /A 230 dla DNA zawiera się między 1.8-2.0 Ratio A 260 /A 280 = 2.0 informuje, że maksymalna absorpcja fali przez kwasy nukleinowe (A 260 ) jest 2x większa niż absorpcja fali przez zanieczyszczenia w próbce (czyli, kwasu nukleinowego jest w próbce 200% więcej niż zanieczyszczeń) Prawidłowa wartość Ratio A 260 /A 280 oraz A 260 /A 230 dla RNA zawiera się między 1.9-2.2 12 Poszczególne oligonukleotydy (w czystej postaci) będą wykazywały różne wartości Ratio A 260 /A 280 : GTP- 1.15 TTP- 1.47 CTP- 1.50 UTP- 4.00 ATP- 4.50 13 4
Ratio: A 260 /A 280 =1.8 A 260 /A 230 =2.0 Ratio: A 260 /A 280 =2.0 A 260 /A 230 =0.5 etanol Ratio A 260 /A 280 =1.5 A 260 /A 230 =1.0 fenol/trizol Ratio A 260 /A 280 =0.5 A 260 /A 230 =3.5 EDTA 14 Fluorymetryczny pomiar stężenia DNA lub RNA (spektroskopia fluorescencyjna): oddziaływane fotonów z molekułami powoduje wzbudzenie elektronów walencyjnych. Wzbudzone elektrony spontanicznie powracają do stanu podstawowego, emitując nadmiar energii w postaci światła Związki fluorescencyjne (znaczniki fluorescencyjne) wiążą się specyficznie z DNA i/lub RNA emitując światło o określonej długości Miernikiem emisji jest wydajność kwantowa (Q)- mierzona na fotodiodzie Q= Liczba wyemitowanych fotonów Liczba zabsorbowanych fotonów 15 Bromek etydyny (pochodna akrydyny); DNA (RNA) λabs=493nm; λem=620nm λ- widmo= długość fali, dla której fluorescencja jest największa Hoechst 33258 (pochodna bisimidazolu); DNA mniejszy rowek helisy λabs=350nm; λem=461nm 16 5
Reaktywna pochodna cząsteczki fluorescencyjnejfluorofor selektywnie wiąże się ze specyficznym regionem lub grupą funkcyjną w cząsteczce docelowej, może być przyłączony chemicznie lub biologicznie - W pomiarze fluorymetrycznym cząsteczki DNA oraz RNA są rozróżnialne!!! - Pomiar jest ponad 1000 x czulszy niż spektroskopia - Pomiar nie pozwala wykryć zanieczyszczeń 17 CO ZROBIĆ, GDY STĘŻENIE KWASÓW NUKLEINOWYCH JEST ZBYT MAŁE? Wytrącić etanolem i zawiesić w mniejszej objętości (DNA) Zagęścić 18 6