Uniwersytet Wrocławski Instytut Genetyki i Mikrobiologii Zakład Genetyki Jacek Skała ĆWICZENIA Z GENETYKI MOLEKULARNEJ Wrocław 2008
Spis treści Spis treści...2 Organizacja ćwiczeń...4 KRYTERIA OCENY...6 LITERATURA POMOCNICZA...6 PODSTAWOWE INFORMACJE O PLAZMIDACH I SZCZEPACH...8 PLAZMIDY...8 SZCZEPY...10 KLASYCZNA METODA IZOLACJI DNA PLAZMIDOWEGO Z ESCHERICHIA COLI...11 SZYBKA METODA IZOLACJA DNA PLAZMIDOWEGO Z ESCHERICHIA COLI...17 ULTRA SZYBKA METODA IZOLACJA DNA PLAZMIDOWEGO Z ESCHERICHIA COLI...19 WYBRANE METODY IZOLACJI, OCZYSZCZANIA I ZAGĘSZCZANIA KWASÓW NUKLEINOWYCH...21 IZOLACJA I OCZYSZCZANIE DNA I RNA NA KOLUMNACH ZE ZŁOśEM KRZEMIONKOWYM...21 OCZYSZCZANIE KWASÓW NUKLEINOWYCH FENOLEM...25 ZAGĘSZCZANIE ROZTWORÓW KWASÓW NUKLEINOWYCH PRZEZ WYTRĄCANIE...28 MIKRODIALIZA...30 SPEKTROFOTOMETRYCZNE OZNACZANIE STĘśENIA I CZYSTOŚCI KWASÓW NUKLEINOWYCH...31 TRAWIENIE DNA ENZYMAMI RESTRYKCYJNYMI...32 KILKA RAD PRAKTYCZNYCH O PRACY Z ENZYMAMI RESTRYKCYJNYMI...33 KIEDY ENZYM RESTRYKCYJNY NIE CHCE CIĄĆ...34 ENZYM RESTRYKCYJNY PRZY PRACY...35 ELEKTROFOREZA DNA W śelach AGAROZOWYCH...38 WPŁYW ILOŚCI DNA I CZASU TRWANIA ELEKTROFOREZY NA ROZDZIAŁ FRAGMENTÓW FAGA λ W śelu AGAROZOWYM...41 ELEKTROFOREZA DNA W AGAROZIE O NISKIM PUNKCIE TOPNIENIA...42 OGÓLNE REGUŁY POSTĘPOWANIA...42 ROZDZIAŁ I ODZYSKANIE DNA Z AGAROZY LMP...43 DEFOSFORYLACJA WEKTORA...46 LIGACJA...49 ELEKTROTRANSFORMACJA...50 PRZYGOTOWANIE DNA DO ELEKTROTRANSFORMACJI...50 PRZYGOTOWANIE ELEKTROKOMPETENTNYCH KOMÓREK ESCHERICHIA COLI...51 Elektrotransformacja Escherichia coli...53 PRZYGOTOWANIE ELEKTROKOMPETENTNYCH KOMÓREK SACCHAROMYCES CEREVISIAE...56 Elektrotransformacja Saccharomyces cerevisiae...58 CHEMICZNA TRANSFORMACJA SACCHAROMYCES CEREVISIAE...60 PRZYGOTOWANIE KOMÓREK DROśDśOWYCH DO TRANSFORMACJI CHEMICZNEJ...60 TRANSFORMACJA SACCHAROMYCES CEREVISIAE...61 PODŁOśE SELEKCYJNE Z X-GAL I IPTG...62 SELEKCJA TRANSFORMANTÓW ESCHERICHIA COLI Z WEKTOREM ZAWIERAJĄCYM DROśDśOWY GEN HIS3...64 2
BEZPOŚREDNIE WYKAZANIE OBECNOŚCI GENU HIS3 W TRANSFORMANTACH DROśDśOWYCH...69 PCR...70 OGÓLNE ZASADY PROJEKTOWANIA STARTERÓW DO PCR...73 Startery do wykrywania droŝdŝowego genu HIS3...74 PREPARACJA DNA GENOMOWEGO Z DROśDśY SACCHAROMYCES CEREVISIAE...76 ZESTAWIENIE REAKCJI PCR Z DNA DROśDśOWYM...78 PROGRAM PCR DO WYKRYWANIA DROśDśOWEGO GENU HIS3 STARTERAMI HIS-P I HIS-K...80 3
Organizacja ćwiczeń Grupa studencka dzieli się na dwuosobowe zespoły. KaŜdy zespół otrzymuje dwa szczepy Escherichia coli JM109. Jeden z nich zawiera pusty wektor wahadłowy pfl44s, natomiast w drugim znajduje się plazmid pd11 złoŝony z części bakteryjnej oraz 1764 bp fragmentu genomowego DNA droŝdŝowego z genem HIS3 (Rys. 1). Zadaniem zespołu jest: a. przeniesienie genu HIS3 do wektora wahadłowego, b. transformacja nowo wytworzonym plazmidem zawierającym gen HIS3 szczepu Saccharomyces cerevisiae FY73, c. wyselekcjonowanie transformantów droŝdŝowych zdolnych do wzrostu na podłoŝu minimalnym bez histydyny oraz określenie wydajności transformacji wytworzonym plazmidem, d. bezpośrednie wykazanie obecności genu HIS3 w transformantach droŝdŝowych metodą PCR, e. opracowanie mapy restrykcyjnej wytworzonego plazmidu Realizacja postawionego zadania zajmuje pięć tygodni i odbywa się według poniŝszego planu: I tydzień Izolacja plazmidów pfl44s i pd11 ze szczepów bakteryjnych. Trawienie plazmidów pfl44s i pd11 enzymem BamHI. Elektroforeza kontrolna w Ŝelu agarozowym. II tydzień Defosforylacja końców rozciętego plazmidu pfl44s. 4
Rozdział fragmentów plazmidu pd11 w agarozowym Ŝelu preparatywnym o niskim punkcie topnienia (LMP). Odzyskanie z agarozy fragmentu plazmidu pd11 zawierającego gen HIS3. Ligacja plazmidu pfl44s (wektora) z wyizolowanym fragmentem DNA droŝdŝowego zawierającym gen HIS3. III tydzień Przygotowanie elektrokompetentnych komórek E. coli JM109. Przygotowanie elektrokompetentnych komórek S. cerevisiae FY73. Przygotowanie podłoŝa selekcyjnego LB z ampicyliną, X-gal i IPTG. Dializa roztworu ligacyjnego Elektrotransformacja E. coli JM109 ligowanym DNA i wysiew na podłoŝe selekcyjne LB z ampicyliną, X-gal i IPTG. IV tydzień Obserwacja wzrostu i róŝnicowania transformantów bakteryjnych na podłoŝu selekcyjnym z X-gal i IPTG. ZałoŜenie hodowli płynnych wybranych białych kolonii transformantów. Preparacja DNA z hodowli wybranych transformantów bakteryjnych. Trawienie restrykcyjne wyizolowanego DNA plazmidowego, elektroforeza kontrolna oraz opracowanie mapy restrykcyjnej. Transformacja komórek droŝdŝowych wytworzonym plazmidem wahadłowym z genem HIS3. V tydzień Obserwacja wzrostu transformantów droŝdŝowych na podłoŝu selekcyjnym bez histydyny. 5
ZałoŜenie hodowli płynnych wybranych transformantów droŝdŝowych. Izolacja DNA genomowego z transformantów droŝdŝowych. Wykazanie obecności genu HIS3 w transformantach droŝdŝowych przy uŝyciu techniki PCR Końcowe omówienie wyników i zaliczenie ćwiczeń. Kryteria oceny Do zaliczenia ćwiczeń wymagane jest uzyskanie pozytywnych ocen za: a) aktywność intelektualną na zajęciach b) działalność praktyczną na zajęciach c) uzyskane wyniki d) kolokwium zaliczeniowe Literatura pomocnicza 1. Birnboim H. C., Doly J. (1979). A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7, 1513-2. Dale J. W., von Schantz M. (2007). From genes to genomes. Concepts and applications of DNA technology. Second edition. John Wiley, England. 3. PCR primer. A laboratory manual. (1995). Dieffenbach C.W., Dveksler G. S. [ed.], Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. 4. Sambrook J., Russell D. (2001). Molecular cloning. A laboratory manual. Third edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. 6
Tabela 1. Ogólny plan przebiegu ćwiczeń z genetyki molekularnej Tydzień Dzień I 1 II 2 III 3 Zadanie do wykonania - izolacja plazmidu pfl44s - izolacja plazmidu pd11 - trawienie enzymem BamHI - trawienie enzymem BamHI - elektroforeza kontrolna w Ŝelu agarozowym - przeniesienie pfl44s z buforu dla -rozdział fragmentów plazmidu pd11 BamHI do buforu do defosforylacji w Ŝelu agarozowym (LMP) - defosforylacja końców -odzyskanie z agarozy fragmentu plazmidu zawierającego gen HIS3 - oczyszczenie DNA fenolem -ligacja wektora z fragmentem zawierającym gen HIS3 -przygotowanie elektrokompetentnych komórek E. coli JM109 -przygotowanie elektrokompetentnych komórek S. cerevisiae FY73 -przygotowanie podłoŝa selekcyjnych LB z ampicyliną, X-gal i IPTG -dializa roztworu ligacyjnego -elektrotransformacja komórek E. coli JM109 ligowanym DNA IV V 4 5 6 7 -obserwacja wzrostu transformantów bakteryjnych E. coli JM109 na stałym podłoŝu selekcyjnym LB z ampicyliną, X-gal i IPTG -załoŝenie hodowli wybranych transformantów w płynnej poŝywce LB z ampicyliną -izolacja DNA plazmidowego z transformantów bakteryjnych -trawienie DNA plazmidowego enzymami restrykcyjnymi -elektroforeza kontrolna i opracowanie mapy restrykcyjnej -transformacja S. cerevisiae FY73 wybranymi preparatami nowo wytworzonych plazmidów -obserwacja wzrostu transformantów S. cerevisiae FY73 na podłoŝu selekcyjnym bez histydyny -załoŝenie hodowli płynnych wybranych transformantów droŝdŝowych -izolacja DNA genomowego z transformantów droŝdŝowych -wykazanie obecności genu HIS3 w transformantach droŝdŝowych techniką PCR -końcowa analiza wyników i zaliczenie ćwiczeń 7
Podstawowe informacje o plazmidach i szczepach Plazmidy pfl44s - wielkość 4319 bp, składa się następujących elementów (Rys. 1): bakteryjny gen Amp kodujący β laktamazę warunkującą oporność na ampicylinę droŝdŝowy gen URA3 bakteryjny region startu replikacji orib pochodzący z plazmidu ColE1 promotor operonu lac wraz z częścią genu lacz kodującą N-końcową część β galaktozydazy (α-peptyd) o długości 145 aminokwasów polilinker wbudowany do fragmentem genu lacz kodującego α-peptyd pd11 - wielkość 4591 bp, składa się z następujących elementów (Rys. 1): gen Amp kodujący β laktamazę warunkującą oporność na ampicylinę Fragment BamHI (1764 bp) z XV chromosomu Saccharomyces cerevisiae zawierający gen HIS3. Gen ten koduje enzym ze szlaku biosyntezy histydyny - IGP dehydratazę. Uszkodzenie geneu HIS3 objawia się u droŝdŝy brakiem wzrostu na poŝywce minimalnej bez histydyny bakteryjny region startu replikacji orib pochodzący z plazmidu ColE1 8
AatII 4522 PvuII 306 EcoRI 396 SacI 402 KpnI 408 SmaI 412 BamHI 417 lacz Amp pd11 PstI 3399 orib 4591 bps His3 HindIII 1191 BglII 1282 BglII 1342 HindIII 1378 KpnI 1505 PstI 1566 Enzym PstI BamHI Miejsce cięcia 1566 2199 3399 417 2181 lacz BglII 2396 BglII 2083 ClaI 2113 2181 BamHI XbaI SalI PstI SphI HindIII 2211 Amp AatII 4250 lacz PvuII 306 BglII 632 396 EcoRI SacI KpnI SmaI BamHI XbaI SalI PstI SphI HindIII 447 pfl44s 4319 bps URA3 EcoRV 1319 Enzym Miejsce cięcia BamHI 417 KpnI 408 PstI 435 orib ClaI 2374 2 um ClaI 1854 BglII 1728 Rysunek 1. Budowa plazmidów pd11 i pfl44s. 9
Szczepy Saccharomyces cerevisiae FY73 (MATα, ura3-52, his3-200, GAL2) MATα - droŝdŝowy typ płciowy α ; ura3-52 - mutacja w genie metabolizmu uracylu, uniemoŝliwia wzrost na podłoŝu minimalnym bez tego związku; his3-200 - delecja o długości 1036 bp, obejmująca całą sekwencję kodującą genu HIS3 wraz z regionem promotorowym (Rysunek 4), fenotypowo objawia się brakiem wzrostu na podłoŝu minimalnym bez histydyny; GAL2 - zdolność do wykorzystywania galaktozy jako jedynego źródła węgla Escherichia coli JM109 [F, trad36, proa + B +, laci q, lacz Μ15] reca, r K-, enda1, gyra96, thi1, supe44, (lac-proab) F obecność plazmidu F warunkującego wytwarzanie pili płciowych; trad36 - mutacja blokująca przekazywanie plazmidu F podczas koniugacji; proab - mutacje w genach metabolizmu proliny powodujące brak wzrostu na podłoŝu minimalnym bez tego aminokwasu; laci q - mutacja powodująca nadprodukcję represora operonu lac; lacz M15 - delecja fragmentu genu lacz kodującego N-końcową część β-galaktozydazy (α-peptyd), pozostawiona jest natomiast część kodująca C-koniec (ω-peptyd); reca - mutacja w genie warunkującym rekombinację i naprawę DNA, uniemoŝliwia rekombinację obcego DNA z genomem gospodarza; r K- - brak systemu restrykcji; enda1 - mutacja w genie endonukleazy I, zwiększa wydajność i poprawia jakość izolowanego DNA plazmidowego; gyra96 - mutacja w podjednostce A gyrazy, wywołuje oporność na kwas nalidiksowy; thi1 - mutacja powodująca brak wzrostu na podłoŝu minimalnym bez tiaminy; supe44 - supresor mutacji amber (UAG); (lac-proab) - delecja operonu laktozowego i genów proab 10
Klasyczna metoda izolacja DNA plazmidowego z Escherichia coli Obecnie do izolacji DNA plazmidowego z komórek bakteryjnych stosowane są metody róŝniące się niekiedy dość znacznie w poszczególnych etapach preparacji. Wszystkie je jednak cechuje zastosowanie lizy komórek SDS-em w warunkach alkalicznych. Podstawy tej metody opracowali Birnboim i Doly w roku 1979. Podany wówczas sposób postępowania doczekał się licznych, zazwyczaj drobnych modyfikacji skracających czas preparacji, a czasem równieŝ poprawiających czystość uzyskiwanych plazmidów. Najbardziej znacząca modyfikacja polegała na zastosowaniu gotowych kolumn ze złoŝem krzemionkowym co zostało opisane w rozdziale Izolacja i oczyszczanie kwasów nukleinowych na kolumnach. PoniŜej podano opis klasycznej metody izolacji DNA plazmidowego z bakterii z uŝyciem lizy alkalicznej i oczyszczania fenolem jak podali Birnboim i Doly (1979). Do protokołu postępowania wprowadzono jedynie modyfikacje dostosowujące go do potrzeb zająć ćwiczeniowych i posiadanego wyposaŝenia laboratoryjnego. Metoda ta daje dobre wyniki nawet w rękach osób początkujących. Przy jej uŝyciu moŝna izolować plazmidy o wielkości do 15 kbp, a po nabyciu wprawy nawet do około 30 kbp. Wyizolowane plazmidy nie są całkowicie wolne od zanieczyszczeń, ale stopień ich czystości jest wystarczający do analizy restrykcyjnej, reakcji PCR i ligacji, a po nabraniu wprawy równieŝ i do sekwencjonownia. Metoda ta działa bardzo dobrze równieŝ po zmianie skali preparacji. MoŜna więc izolować DNA plazmidowe z hodowli bakteryjnych o innej objętości niŝ podane 3 ml. W tym celu objętości poszczególnych roztworów roboczych naleŝy zmienić proporcjonalnie do zmiany objętości hodowli. 1. 3,5 ml poŝywki LB (wyciąg droŝdŝowy 1 %, trypton 1 %, NaCl 0,5 %) z ampicyliną (100 µg/ml) zaszczepić szczepem E. coli zawierającym odpowiedni plazmid. 2. Hodowlę inkubować przez 18 od 20 godzin w temp. 37 o C z wytrząsaniem (150-160 cykli na minutę). 3. Do probówki Eppendorfa przenieść 1,5 ml hodowli bakteryjnej po czym wirować przez 3 min. JeŜeli podano jedynie czas to znaczy, Ŝe wirowanie naleŝy wykonać w wirówce typu Eppendorf, w temperaturze pokojowej. Wirówki tej klasy najczęściej nie mają chłodzenia oraz moŝliwości regulacji obrotów i pracują ze stałą prędkością około 14000 obr/min. 11
W przypadkach gdy obok czasu podano równieŝ temperaturę i prędkość obrotową naleŝy uŝyć wirówki z moŝliwością regulowania tych parametrów. 4. Usunąć supernatant przy pomocy pompki próŝniowej zachowując osad bakteryjny. Do probówki przenieść kolejne 1,5 ml hodowli i ponownie wirować przez 3 min. 5. Supernatant usunąć przy pomocy pompki próŝniowej zbierając równieŝ kropelki pozostające na ściance probówki. 6. Osad bakteryjny zawiesić przy pomocy pipety w 200 µl buforu TGE (50 mm Tris-HCl, 50 mm glukoza, 10 mm EDTA, ph 8,0) tak, aby powstała jednolita, pozbawiona grudek zawiesina, co jest warunkiem prawidłowego przebiegu lizy. 7. Do zawiesiny bakterii dodać 300 µl świeŝo przygotowanego roztworu do lizy (1% SDS, 0,2 N NaOH), po czym całość dokładnie wymieszać przez kilkukrotne odwrócenie probówki do góry dnem. NaleŜy unikać gwałtownego potrząsania probówką. Liza komórek następuje natychmiast po dodaniu roztworu SDS z NaOH i objawia się wzrostem lepkości oraz przejrzystości zawiesiny przy równoczesnym zaniku barwy beŝowej. 8. Probówkę z lizatem umieścić na 3 min. w lodzie. 9. Do lizatu dodać 240 µl 3M octanu sodu (ph 5,2) i wymieszać przez kilkukrotne odwracanie probówki do góry dnem. W lizacie powinny pojawić się białawe "serowate" kłaczki wytrąconych białek. 10. Lizat z wytrąconymi białkami inkubować przez 10 min. w temp. -20 o C. 11. Probówkę z lizatem wirować przez 15 min. (14 000 obr/min., 4 o C). W wyniku wirowania lizat powinien się rozdzielić na jasno beŝowy osad i lekko śluzowaty, przejrzysty supernatant. jeŝeli rozdział nie jest dobry to wirowanie (15 min, 14 000 obr/min., 4 o C) naleŝy powtórzyć po ewentualnym rozcieńczeniu lizatu buforem TGE w przypadku dobrego rozdziału supernatant naleŝy ostroŝnie zebrać pipetą znad osadu i przenieść do czystej probówki Eppendorfa 12
12. Do supernatantu zebranego znad osadu dodać jedną objętość fenolu i całość energicznie wytrząsać do wytworzenia jednorodnej emulsji. Patrz równieŝ rozdział Oczyszczanie kwasów nukleinowych fenolem. 13. Probówkę z emulsją wodno-fenolową wirować przez 5 min. Zawartość probówki powinna rozdzielić się na dwie wyraźne odgraniczone fazy: fenolową (dolna) i wodną (górna). Zanieczyszczenia białkowe gromadzą się w fazie fenolowej i na granicy faz. 14. Pipetą zebrać fazę wodną i przenieść do czystej probówki. Przy zbieraniu szczególną uwagę naleŝy zwrócić na to, by nie pobrać zanieczyszczeń znajdujących się na granicy faz. 15. Do fazy wodnej dodać około dwie objętości eteru. Probówkę dokładnie zamknąć i energicznie wytrząsać do wytworzenia jednorodnej emulsji. 16. Probówkę z emulsją wodno-eterową wirować przez 5 min. RównieŜ i tym razem zawartość probówki powinna rozdzielić się na dwie fazy: wodną (dolna) i eterową (górna). Zanieczyszczenia gromadzą się w fazie eterowej i na granicy faz. 17. Posługując się pompką wodną odessać fazę eterową wraz z interfazą. Dla zminimalizowania strat naleŝy unikać zasysania fazy wodnej. 18. Powtórzyć postępowanie opisane w punktach od 15 do 17 po czym przejść do punktu 19. 19. Do fazy wodnej pozostałej po dwukrotnej ekstrakcji eterem dodać jedną objętość zimnego (-20 o C) izopropanolu i całość wymieszać przez kilkukrotne odwracanie probówki do góry dnem. JeŜeli stęŝenie DNA w roztworze jest wysokie to po dodaniu izopropanolu pojawi się strąt w postaci pływającego kłaczka. Przy małym stęŝeniu DNA strąt moŝe być niewidoczny. 20. Probówkę z zawartością inkubować w temp. -20 o C przez 10 do 15 min. Inkubacja w niskiej temperaturze przyspiesza wytrącanie kwasów nukleinowych i poprawia wydajność. 13
21. Po zakończeniu inkubacji probówkę z zawartością wirować przez 10 min (14 000 obr/min, 4 o C). Osad kwasów nukleinowych (DNA i RNA) zbiera się na ściance bocznej i dnie probówki i najczęściej jest słabo widoczny. 22. OstroŜnie, tak aby nie naruszyć osadu kwasów nukleinowych, usunąć supernatant. Następnie do probówki dodać 1 ml 70 % etanolu. 23. Wirować przez 1 min. 24. Supernatant usunąć znad osadu przy pomocy pompki próŝniowej. Zebrać moŝliwie wszystkie kropelki osadzone na ściance probówki. 25. Osad wysuszyć w suszarce próŝniowej z wirującym rotorem (speedvac). 26. Wysuszony osad kwasów nukleinowych rozpuścić w 31 µl wody miliq. 27. Po rozpuszczeniu osadu pobrać 1 µl roztworu do nowej probówki Eppendorfa i zachować do kontroli. 28. Do pozostałych 30 µl roztworu kwasów nukleinowych dodać 1 µl roztworu RNazy o stęŝeniu 10 mg/ml. 29. Część preparatu plazmidowego pociąć enzymem restrykcyjnym BamHI. W tym celu zestawić roztwory reakcyjne przenosząc poszczególne składniki do probówek Eppendorfa jak podano w Tabeli 2. Następnie krótko zwirować (10 do 15 sekund) co zapewnia zebranie wszystkich składników reakcyjnych na dnie probówki i ułatwia ich wymieszanie. Po wymieszaniu zawartość probówki naleŝy ponownie krótko zwirować. Tabela 2. Trawienie plazmidów pfl44s i pd11 enzymem BamHI Numer probówki 1 2 DNA 10,0 µl pfl44s 10,0 µl pd11 Bufor Bam 2,0 µl 2,0 µl Woda 6,0 µl 6,0 µl Enzym BamHI (10 U/µl) 2,0 µl 2,0 µl 30. Roztwory reakcyjne inkubować przez 2 godz. w cieplarce w temp. 37 o C. 31. Po zakończeniu inkubacji przygotować próbki do elektroforezy kontrolnej. W tym celu wskazane w Tabeli 3 objętości poszczególnych roztwo- 14
rów przenieść do probówek Eppendorfa, krótko zwirować, wymieszać i ponownie zwirować. Pozostałą część roztworów restrykcyjnych oraz preparaty plazmidów zamrozić w temp. -20 o C. Tabela 3. Przygotowanie próbek do elektroforezy kontrolnej. Probówka A B C D E F DNA 1 µl pfl44s bez RNazy 1 µl pfl44s 2 µl pfl44s/ BamHI 1 µl pd11 bez RNazy 1 µl pd11 2 µl pd11/ BamHI Woda 7 µl 7 µl 6 µl 7 µl 7 µl 6 µl Barwnik do nanoszenia 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 33. Przygotowane próbki nanieść na 0,9 % Ŝel agarozowy w buforze TBE z bromkiem etydyny (0,25 µg/ml). Na Ŝel nanieść równieŝ marker masy o znanym stęŝeniu i przeprowadzić elektroforezę pod napięciem od 150 V do 190 V w zaleŝności od wielkości Ŝelu. Patrz równieŝ rozdział Elektroforeza DNA w Ŝelach agarozowych 34. Wykonać zdjęcie Ŝelu w przechodzącym świetle ultrafioletowym (maksimum emisji lampy przy 312 nm). 35. Na podstawie zdjęcia ocenić jakość wyizolowanych plazmidów pd11 i pfl44s, sporządzić krzywą kalibracyjną i wyznaczyć wielkość fragmentów liniowych obu plazmidów oraz oszacować błąd metody. 36. Na podstawie porównania intensywności świecenia prąŝków plazmidowych z intensywnością świecenia markera masy oszacować ilość uzyskanego plazmidowego DNA. 37. Posługując się spektrofotometrem do pomiarów kwasów nukleinowych w małych objętościach zmierzyć absorbancję uzyskanych preparatów plazmidowych przy długości fali 230 nm, 260 nm i 280 nm. Na tej podstawie określić ich stęŝenie i czystość. Patrz równieŝ rozdział Spektrofotometryczne oznaczanie stęŝenia i czystości kwasów nukleinowych. 15
Materiały poŝywka LB (wyciąg droŝdŝowy 1 %, trypton 1 %, NaCl 0,5 %) ampicylina (10 mg/ml) bufor TGE (50 mm Tris-HCl, 50 mm glukoza, 10 mm EDTA, ph 8,0) roztwór do lizy (SDS 1%, NaOH 0,2 M) Roztwór do lizy przygotowuje się bezpośrednio przed uŝyciem mieszając ze sobą równe objętości 2 % SDS i 0,4 M NaOH. octan sodu (3 M, ph 5,2) fenol (nasycony roztwór fenolu w 0,1 M Tris-HCl (ph 8,0) z 0,1 % dodatkiem hydroksychinoliny) eter izopropanol 70 % etanol woda destylowana jałowa (miliq) RNaza (10 mg/ml) enzym restrykcyjny BamHI (Fermentas, nr kat. ER0051) bufor Bam zalecany przez producenta do trawienia enzymem BamHI (10 mm Tris-HCl (ph 8,0), 5 mm MgCl 2, 100 mm KCl, 0,02 % merkaptoetanol, 0,1 mg/ml BSA) agaroza LE (Prona) marker masy - DNA faga λ trawiony enzymami EcoRI i HindIII barwnik do nanoszenia na Ŝel 5 x stęŝony (Ficoll 400 15 %, błękit bromofenolowy 0,15 %) bufor TBE 10 x stęŝony (Tris 100,89 g, kwas borny 59 g, EDTA 9,35 g, woda do 1000 ml, ph 8,0) bromek etydyny (10 mg/ml) Literatura 1. Birnboim H. C. i Doly J. (1979). A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7:1513 2. Sambrook J., Fritsch E.F. i Maniatis T. (1989). Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. 16
Szybka metoda izolacja DNA plazmidowego z Escherichia coli Klasyczną metodę izolacji DNA plazmidowego z Escherichia coli moŝna znacznie uprościć usuwając z niej etapy związane z oczyszczaniem fenolem. Skrócona wersja doskonale sprawdza się w sytuacjach gdy wyselekcjonowanie poŝądanej konstrukcji plazmidowej wymaga przeszukania duŝej liczby transformantów. Ponadto, podobnie jak jej rozszerzona wersja, daje dobre wyniki równieŝ w rękach osób o małym doświadczeniu. Uzyskane tą drogą plazmidy nadają się do analizy restrykcyjnej i jako matryca do reakcji PCR, ale zazwyczaj nie są wystarczająco czyste do innych zastosowań. 1. W probówce Eppendorfa odwirować (3 min) 1,5 ml całonocnej hodowli (poŝywka LB z odpowiednim antybiotykiem) szczepu E.coli zawierającego badany plazmid. Supernatant usunąć przy pomocy pompki próŝniowej zachowując osad bakteryjny. 2. Osad bakteryjny dokładnie zawiesić w 200 µl buforu TGE (50 mm Tris-HCl, 50 mm glukoza, 10 mm EDTA, ph 8,0). 3. Do zawiesiny bakterii dodać 300 µl świeŝo przygotowanego roztworu do lizy (1% SDS, 0,2 N NaOH), po czym całość dokładnie wymieszać przez kilkukrotne odwrócenie probówki do góry dnem. 4. Do lizatu dodać 240 µl 3M octanu sodu (ph 5,2) i wymieszać przez kilkukrotne odwracanie probówki do góry dnem. 5. Lizat z wytrąconymi białkami inkubować przez 10 min. w temp. -20 o C. 6. Probówkę z lizatem wirować przez 15 min. (14 000 obr/min., 4 o C). 7. Supernatant przenieść do nowej probówki i dodać jedną objętość zimnego (-20 o C) izopropanolu. Całość wymieszać przez kilkukrotne odwracanie probówki. 8. Probówkę inkubować w temp. -20 o C przez 10 min. 9. Po inkubacji probówkę z zawartością wirować przez 10 minut (14 000 obr/min, 4 o C). 17
10. OstroŜnie, nie naruszając osadu, usunąć supernatant. Następnie do probówki dodać 1 ml 70 % etanolu. 11. Wirować przez 1 min. 12. Supernatant usunąć znad osadu przy pomocy pompki próŝniowej. Zebrać moŝliwie wszystkie kropelki osadzone na ściance probówki. 13. Osad wysuszyć w suszarce typu speedvac. 14. Wysuszony osad rozpuścić w 29 µl wody miliq po czym dodać 1 µl roztworu RNazy o stęŝeniu 10 mg/ml. 15. Uzyskany preparat wykorzystać w dalszych etapach prowadzonego eksperymentu lub zamrozić w temp. 20 o C. Materiały poŝywka LB (wyciąg droŝdŝowy 1 %, trypton 1 %, NaCl 0,5 %) bufor TGE (50 mm Tris-HCl, 50 mm glukoza, 10 mm EDTA, ph 8,0) roztwór do lizy (SDS 1%, NaOH 0,2 M) Roztwór do lizy przygotowuje się bezpośrednio przed uŝyciem mieszając ze sobą równe objętości 2 % SDS i 0,4 M NaOH. octan sodu (3 M, ph 5,2) izopropanol 70 % etanol woda destylowana jałowa (miliq) RNaza (10 mg/ml) 18
Ultra szybka metoda izolacja DNA plazmidowego z Escherichia coli PoniŜej przedstawiono kolejną metodę izolacji DNA plazmidowego w warunkach lizy alkalicznej. Tym razem jako główny cel postawiono sobie maksymalne skrócenie czasu trwania preparacji, nawet kosztem znacznego zmniejszenia wydajności i pogorszenia jakości izolowanego DNA. Metoda ta nadaje się wyłącznie do selekcji transformantów i, co najbardziej chyba zaskakujące, bardzo często zawodzi w rękach osób z małym doświadczeniem laboratoryjnym. Podany poniŝej protokół opracowali Cormack i Somssich (1997). 1. Do probówki zawierającej 1 ml poŝywki SB (wyciąg droŝdŝowy 2 %, pepton 3,2 %, NaCl 0,5 %) z ampicyliną (100 µg/ml) przenieść jedną, dobrze wyrośniętą kolonię bakteryjną. 2. Hodowlę inkubować przez 18 godzin w temp. 37 o C z energicznym wytrząsaniem (150-160 cykli na minutę). 3. Do probówki Eppendorfa przenieść 250 µl hodowli i dodać do niej 250 µl świeŝo przygotowanego roztworu do lizy (1% SDS, 0,2 N NaOH), po czym całość dokładnie wymieszać przez kilkakrotne odwrócenie probówki do góry dnem. 4. Do lizatu dodać 250 µl 3M octanu sodu (ph 5,2) i wymieszać przez odwracanie probówki do góry dnem. 5. Probówkę z lizatem wirować przez 6 min. 6. Pipetą ostroŝnie zebrać supernatant i przenieść do czystej probówki Eppendorfa. 7. Do zebranego supernatantu dodać 750 µl zimnego (-20 o C) izopropanolu i wymieszać przez odwracanie probówki. 8. Wytrącone DNA odwirować (4 min.) 9. Przy pomocy pompki próŝniowej usunąć supernatant nie naruszając osadu. 19
10. Probówkę krótko wirować i dokładnie usunąć pozostałe resztki supernatantu. 11. Osad rozpuścić w 20 µl jałowej wody destylowanej i dodać 1 µl roztworu RNazy o stęŝeniu 10 mg/ml. 16. Uzyskany preparat wykorzystać bezpośrednio w dalszych etapach prowadzonego eksperymentu lub zamrozić w temp. 20 o C. Materiały poŝywka SB (wyciąg droŝdŝowy 2 %, pepton 3,2 %, NaCl 0,5 %) ampicylina (10 mg/ml) roztwór do lizy (SDS 1%, NaOH 0,2 M) Roztwór do lizy przygotowuje się bezpośrednio przed uŝyciem mieszając ze sobą równe objętości 2 % SDS i 0,4 M NaOH. 3 M octan sodu, ph 5,2 izopropanol jałowa woda miliq RNaza (10 mg/ml) Literatura Cormack R. S., Somssich I. E. (1997). Ultra-fast alkaline lysis plasmid extraction (UFX). Technical Tips Online, 1, 25:T01210. 20
Wybrane metody izolacji, oczyszczania i zagęszczania kwasów nukleinowych Izolacja i oczyszczanie DNA i RNA na kolumnach ze złoŝem krzemionkowym W roku 1979 Vogelstein i Gillespie zaobserwowali, Ŝe w obecności jodku sodu liniowe, krótkie fragmenty dwuniciowego DNA adsorbują się na powierzchni sproszkowanego szkła typu flint. W kolejnych latach wykazano, Ŝe zjawisko to obejmuje równieŝ i pozostałe rodzaje kwasów nukleinowych, to jest dsdna, ssdna i RNA. Flint to szkło krzemowo-ołowiowe o wysokim współczynniku załamania światła zawierające od 4 do 60 % tlenku ołowiu. Obecnie, ze względu na toksyczne właściwości ołowiu, do produkcji flintu uŝywany jest dwutlenek tytanu lub cyrkonu. Sole chaotropowe (jodek sodu, chlorowodorek guanidyny, izotiocyjanian guanidyny) są to związki, które w roztworach wodnych wprowadzają zaburzenia w sieci wiązań wodorowych w cząsteczkach wody. Powodują równieŝ rozpad błon komórkowych i denaturację białek, co sprzyja izolacji kwasów nukleinowych. W obecności wysokich stęŝeń soli chaotropowych tylko kwasy nukleinowe wiąŝą się ze złoŝem krzemionkowym podczas gdy wszystkie inne związki pozostają w roztworze. Wiązanie jest odwracalne i po zmianie ph oraz obniŝeniu siły jonowej kwasy nukleinowe odłączają się od złoŝa krzemionkowego. Wiele firm biotechnologicznych, wykorzystując to zjawisko, opracowało zestawy zawierające kolumny z uformowanymi złoŝami krzemionkowymi oraz odpowiednie bufory przeznaczone do izolacji DNA plazmidowego i genomowego oraz RNA z takich źródeł jak bakterie, droŝdŝe, tkanki roślinne i zwierzęce, a takŝe wydzieliny i płyny ustrojowe. Opracowano równieŝ zestawy do odzyskiwania kwasów nukleinowych z Ŝeli agarozowych oraz do oczyszczania po reakcjach enzymatycznych takich jak znakowanie, cięcie restrykcyjne czy PCR. Aktualnie najbardziej rozpowszechnione są złoŝa wykonane w postaci membran z niemodyfikownej chemicznie krzemionki. Kolumny z tego typu złoŝami są względnie tanie i pozwalają na uzyskanie kwasów nukleinowych o czystości wystarczającej do analizy restrykcyjnej, ligacji, znakowania, amplifikcji (PCR i RTPCR) oraz sekwencjonownia. ZłoŜa najnowszej generacji wykonywane są z mikrokuleczek krzemionkowych do których na trwale przyłączono na przykład dietyloaminoetanol (DEAE). Działanie tego typu złoŝa opiera się na interakcji między ujemnie naładowanymi grupami fosforanowymi kwasu nukleinowego, a dodatnio 21
naładowanymi grupami DEAE. Dzięki przyłączeniu cząsteczek DEAE do kulek krzemionkowych uzyskuje się duŝe zwiększenie gęstości dodatniego ładunku powierzchniowego, co powoduje mocniejsze wiązanie oczyszczanego kwasu nukleinowego ze złoŝem. Dzięki temu moŝna zastosować bardziej energiczne odpłukiwanie zanieczyszczeń, przekładające się w konsekwencji na lepsze oczyszczenie izolowanego materiału. Stopień czystości uzyskanych tą drogą kwasów nukleinowych odpowiada czystości uzyskiwanej w wyniku dwukrotnego wirowania w gradiencie chlorku cezu. Jest to czystość wymagana w tak krytycznych zastosowaniach jak transfekcja, mikroinjekcja i terapie genowe. Wszystkie firmy dostarczają produkowane przez siebie zestawy wraz ze szczegółowymi instrukcjami dotyczącymi ich przeznaczenia i sposobu uŝycia. Zazwyczaj instrukcje te nie podają składu oferowanych buforów oraz zawierają jedynie podstawową informację o rodzaju uŝytego złoŝa. Mimo dość duŝej róŝnorodności wszystkie oferowane zestawy wiąŝe kilka cech wspólnych: 1. Przygotowanie materiału do naniesienia na kolumnę lizat komórek bakteryjnych poddaje się wirowaniu w celu odrzucenia kompleksów białko-sds oraz DNA chromosomalnego tkanki zwierzęce trawi się proteinazą K i następnie dodaje bufor o wysokim stęŝeniu soli chaotropowych tkanki roślinne rozbija się mechaniczne (młynek Retcha lub rozcieranie ręczne w moździerzu w obecności płynnego azotu) i przenosi do bufor o wysokim stęŝeniu soli chaotropowych agarozę z której ma być odzyskany DNA roztapia się w buforze o wysokim stęŝeniu soli chaotropowych w temp. 50 do 60 o C do roztworów po reakcjach enzymatycznych dodaje się bufor z solami chaotropowymi w przypadku stosowania kolumn NUCLEOBOND (produkowanych przez firmę Macherey i Nagel) wstępnie przygotowany materiał, przed naniesieniem na kolumnę, oczyszcza się na dodatkowym sączku 2. Przepuszczenie wstępnie przygotowanego materiału przez kolumnę W zaleŝności od skali preparacji stosowane są kolumny o przepływie grawitacyjnym (np. NUCLEOBOND ) lub o przepływie wymuszonym przez wirowanie (np. QIAGEN oraz A&A Biotechnology). Kwasy nukleinowe zawarte w przepływającym przez kolumnę materiale zostają selektywnie związane ze złoŝem silikonowym. Wszystkie inne składniki przechodzą do odbieralnika kolumny. 22