Walidacja metod analitycznych Raport z walidacji

Walidacja metod analitycznych Raport z walidacji Małgorzata Jakubowska Katedra Chemii Analitycznej WIMiC AGH

Walidacja metod analitycznych (według ISO) to proces ustalania parametrów charakteryzujących sprawność działania i ograniczeń metody oraz sprawdzenie jej przydatności do określonych celów. Podczas wykonywania walidacji należy: określić, które parametry charakteryzujące metodę powinny być wyznaczone wyznaczyć wartości tych parametrów na tej podstawie określić czy metoda spełnia stawiane jej wymagania związane z zamierzonym zastosowaniem wyników analitycznych. W efekcie wykonania walidacji można uzyskać pewność, że proces analizy przebiega w sposób rzetelny i precyzyjnie oraz daje wiarygodne wyniki.

Proces walidacji składa się zazwyczaj z następujących etapów: określenie przeznaczenia metody analitycznej i jej zakresu, definicja testowanych parametrów analitycznych oraz kryteria akceptacji, opracowanie planu eksperymentów walidacyjnych, sprecyzowanie charakterystyki sprzętu, przygotowanie wzorców oraz odczynników, eksperymenty walidacyjne z ewentualną korektą parametrów metody, obliczenia, interpretacja wyników, sprawdzenie kryteriów akceptacji, opracowanie standardowej procedury operacyjnej dla badanej metodyki, określenie kryteriów rewalidacji, sporządzenie raportu.

Parametry brane pod uwagę podczas walidacji: specyficzność precyzja (powtarzalność i odtwarzalność) dokładność zakres metody liniowość granica wykrywalności granica oznaczalności elastyczność.

Specyficzność: jedynie analit jest źródłem niezakłóconego sygnału analitycznego, zaś interferencje nie występują zdolność jednoznacznego określenia substancji analizowanej w obecności składników, które mogą być zawarte w próbce, np. substancji pomocniczych, zanieczyszczeń, itd. zdolność rozróżniania związków o podobnej strukturze.

Precyzja: stopień zgodności między pojedynczymi wynikami analizy (rozrzut wyników), gdy dana procedura jest stosowana dla wielokrotnie powtarzanych, niezależnych oznaczeń jednorodnej próbki najczęściej miarą precyzji jest odchylenie standardowe S, względne odchylenie standardowe RSD lub współczynnik zmienności CV obejmuje dwa pojęcia: powtarzalność i odtwarzalność. Kryteria akceptacji: CV wyników zawartości składnika głównego nie powinno być większe niż 3% CV wyników oznaczania zawartości składników na poziomie śladowym nie powinno być większe niż 15%.

Powtarzalność : wyraża precyzję oznaczeń wykonanych w krótkim odstępie czasu, przez tego samego analityka i w tych samych warunkach (te same odczynniki, ten sam sprzęt) należy wykonać minimum 6 powtórzeń dla poziomu stężenia 100% lub po trzy powtórzenia dla każdego z minimum trzech poziomów stężeń w zakresie metody (zalecane 50 150% nominalnego stężenia) wyznacza się wartość średnią, przedział ufności, odchylenie standardowe, względne odchylenie standardowe oraz współczynnik zmienności uzyskanych wyników.

Odtwarzalność: pozwala ocenić, czy metoda prowadzi do tych samych rezultatów w różnych laboratoriach z różnymi analitykami, na innym sprzęcie i w innych warunkach, z zachowaniem parametrów wymaganych w opisie metody badania są prowadzone analogicznie jak w przypadku powtarzalności wyznacza się wartość średnią, przedział ufności, odchylenie standardowe, względne odchylenie standardowe oraz współczynnik zmienności uzyskanych wyników.

Dokładność: zgodność między wartością rzeczywistą (zawartością, stężeniem) a wartością będącą wynikiem analizy miarą dokładności metody analitycznej jest wielkość jej błędu systematycznego metoda niedokładna może być obarczona błędem systematycznym stałym (niezależnym od poziomu zawartości oznaczanego składnika) i zmiennym (zależnym od stężenia oznaczanego składnika) powinna być oszacowana na podstawie minimum 9 wyników oznaczeń dla minimum trzech różnych poziomów stężeń z badanego zakresu (np. trzykrotne oznaczenie dla trzech poziomów) najczęściej wynik przedstawia się jako błąd bezwzględny lub względny.

Szacowanie dokładności metody : przez analizę próbki o znanym stężeniu (np. certyfikowany materiał odniesienia) i porównanie wyników uzyskanych walidowaną metodą z wartością prawdziwą przez porównanie wyników uzyskanych walidowaną metodą z wynikami otrzymanymi metodą odniesienia, której dokładność jest znana przez dodanie znanej ilości analitu do badanego produktu, a następnie jego oznaczenie sprawdzaną metodą.

Dokładność może być przedstawiona jako procent odzysku, który oblicza się wg wzoru: x i *100%, µ gdzie x i oznaczona ilość analitu w badanej próbce, µ- znana ilość analitu w badanej próbce Kryteria akceptacji Odzysk powinien wynosić 95 105% w przypadku składnika głównego i 80 120% dla składników na poziomie śladowym (wartości te zależą między innymi od stężenia analitu w badanej próbie i metody badania).

Zakres: przedział między minimalną i maksymalną zawartością (stężeniem) substancji aktywnej w badanej próbie, w którym metoda analityczna ma odpowiednią liniowość, dokładność i precyzję. Minimalny zakres stosowania metody analitycznej powinien wynosić (kryteria akceptacji): dla zawartości substancji głównej od 80% do 120% deklarowanej ilości analitu w badanej próbie w przypadku oznaczania substancji na poziomie śladowym zakres powinien wynosić od 10% do 120% maksymalnej dopuszczalnej zawartości tej substancji określonej w specyfikacji.

Granica wykrywalności (DL) jest to najmniejsza ilość (stężenie) badanej substancji w próbce, które może być wykryta, lecz niekoniecznie oznaczona z odpowiednią dokładnością. Granica oznaczalności (QL) jest to najmniejsza ilość (stężenie) badanej substancji w próbce, jaka może być ilościowo oznaczona z odpowiednią precyzją i dokładnością. 3.3* S 10* S DL = QL = b b S odchylenie standardowe ślepej próby b nachylenie prostej kalibracji

Liniowość: zdolność do uzyskiwania wyników pomiaru analitycznego wprost proporcjonalnych do stężenia (zawartości) substancji oznaczanej w próbce, w określonym zakresie zgodnie z wyznaczonym równaniem matematycznym y = ax+b zależność między obu zmiennymi charakteryzuje współczynnik korelacji r liniowość wykazuje się przez analizę próbek o stężeniach analitu, obejmujących deklarowany zakres stężeń metody należy wykonać badanie minimum 5-ciu serii wzorców (3-6 powtórzeń), których stężenia obejmują 80-120% stężenia spodziewanego w próbce. Kryterium akceptacji: w przypadku oznaczania substancji głównej współczynnik r powinien być większy od 0,995, w przypadku oznaczania śladów powinien być większy od 0,98.

Liniowość: 0,30 0,25 y = 0,0085x + 0,00235 r = 0,99662 y,zmierzony sygnał 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 0 20 40 60 80 100 120 x,odważka badanej próbki [mg]

Elastyczność (stabilność metody): badanie elastyczności metody powinno udowodnić niezawodność analizy po wprowadzeniu niewielkich celowych zmian parametrów metody jeśli pomiar jest wrażliwy na zmianę warunków analitycznych, warunki te powinny być odpowiednio kontrolowane lub dokładnie opisane w procedurze.

Raport walidacyjny

Raport z walidacji metod analitycznych (wykonany po zakończeniu prac laboratoryjnych) powinien zawierać: przedmiot i zakres walidacji rodzaj oznaczanych związków i matrycy opis metody kryteria akceptacji stosowane odczynniki, substancje porównawcze i wzorce opis aparatury (producent, typ) względy bezpieczeństwa parametry pomiaru opis przeprowadzonego eksperymentu postępowanie statystyczne i obliczenia reprezentatywne wykresy kryteria rewalidacji podsumowanie i wnioski.

Raport walidacyjny 1. Oznaczana metoda analityczna - ogólne informacje o metodzie i zastosowanej aparaturze z podaniem jej typu - roztwory wzorcowe - rozwory badane - wykonanie pomiaru.

Raport walidacyjny 2. Wybór optymalnych warunków pomiaru - badania jakie wykonano w celu okreslenia optymalnych warunków pomiaru - parametry podlegające modyfikacji - wyniki osobno dla każdego zmienianego parametru (w tabeli wartość parametru, wyniki np. 7 powtórzeń, średnia, odchylenie standardowe) -wnioski.

Raport walidacyjny Przykład: Dobór optymalnego przepływu acetylenu (fragment tabeli wyników) Numer poziomu Absorbancja Średnia absorbancja Odchylenie standardowe 0.051 2 0.052 0.050 0.047 0.049 0.076 4 0.077 0.080 0.077 0.078

Raport walidacyjny 3. Założenia walidacyjne 3.1. Specyficzność/selektywność - opis pomiarów jakie należy wykonać - wymagane wzorce wraz z okeśleniem stężeń - sposób obliczenia wyniku - kryterium akceptacji. 3.2. Powtarzalność 3.3. Precyzja pośrednia 3.4. Dokładność 3.5. Liniowość 3.6. Zakres metody 3.7. Granica oznaczalności.

Raport walidacyjny 4. Wyniki testów walidacyjnych 4.1. Specyficzność/selektywność - opis pomiarów jakie wykonano - lista wzorców jakie wykorzystano wraz z podaniem stężeń - wyniki pomiarów - wyniki obliczeń - informacja czy spełnione kryterium akceptacji.

Raport walidacyjny Przykład. Badanie wpływu Na na wynik oznaczenia Ca metodą ASA. Stosunek stężeń Na:Ca Średnia absorbancja Różnica średnich absorbancji wzorca bez dodatku Na i wzorca z dodatkiem Na Kryterium akceptacji 0:1 0.163 0.000 1:10 0.159 0.004 1:5 0.165 0.002 1:2 0.168 0.005 0.006 1:1 0.169 0.006 10:1 0.186 0.023

Raport walidacyjny 4. Wyniki testów walidacyjnych 4.2. Powtarzalność - opis pomiarów jakie wykonano - lista wzorców jakie wykorzystano wraz z podaniem stężeń - wyniki pomiarów - wyniki obliczeń - informacja czy spełnione kryterium akceptacji.

Raport walidacyjny Przykład. Badanie powtarzalności oznaczania Ca metodą ASA. Stęże nie [mg/l] A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A S CV [%] 1 0.067 0.068 0.071 0.070 0.069 0.071 0.070 2 0.110 0.107 0.110 0.107 0.109 0.110 0.109 3 4 5 7.5

Raport walidacyjny 4. Wyniki testów walidacyjnych 4.2. Precyzja pośrednia - tak jak powtarzalność ale dwóch różnych dniach

Raport walidacyjny 4. Wyniki testów walidacyjnych 4.4. Dokładność - opis pomiarów jakie wykonano - lista wzorców jakie wykorzystano wraz z podaniem stężeń - wyniki pomiarów - obliczony wynik wraz z podaniem poziomu niepewności - pozostałe wyniki obliczeń - informacja czy spełnione kryterium akceptacji.

Raport walidacyjny Przykład. Badanie dokładności oznaczeania Ca metoda ASA. Stężenie [mg/l] Absorbancja Średnia absorbancja Średnie stężenie Stopień odzysku [%] 0.134 2.5 0.132 0.133 0.132 0.133 0.226 4.5 0.228 0.224 0.225 0.228 Prosta kalibracji: y=0.0485x+0.0075

Raport walidacyjny 4. Wyniki testów walidacyjnych 4.5. Liniowość - opis pomiarów jakie wykonano - lista wzorców jakie wykorzystano wraz z podaniem stężeń - wyniki pomiarów - wyniki obliczeń (współczynniki prostej kalibracji, współczynnik korelacji) - wykres prostej kalibracji - informacja czy spełnione kryterium akceptacji.

Raport walidacyjny Przykład. Badanie liniowości oznaczania Ca metodą ASA. Stężenie [mg/l] Średnia absorbancja 0 0.000 1 0.059 2 0.109 3 0.154 4 0.203 5 0.250 7.5 0.368

Raport walidacyjny 4. Wyniki testów walidacyjnych 4.6. Zakres metody - informacja jak obliczono zakres metody - uzyskany wynik (tj. zakres) - informacja czy spełnione kryterium akceptacji.

Raport walidacyjny 4. Wyniki testów walidacyjnych 4.7. Granica oznaczalności - informacja jak obliczono granicę oznaczalności - uzyskany wynik (tj. DL) - informacja czy spełnione kryterium akceptacji.

Raport walidacyjny 5. Wnioski końcowe - informacja czy walidacja została zakończona wynikiem pozytywnym i metoda może być stosowana. Wykonał: xxx KONIEC RAPORTU

Dziękuję za uwagę!