PCR. Markery klasy II -Polimorfizm fragmentów DNA: - RFLP - VNTR - RAPD

Podobne dokumenty
TECHNIKI ANALIZY RNA TECHNIKI ANALIZY RNA TECHNIKI ANALIZY RNA

GRADIENT TEMPERATUR TOUCH DOWN PCR. Standardowy PCR RAPD- PCR. RealTime- PCR. Nested- PCR. Digital- PCR.

PODSTAWY PODSTAWY ZMIENNOŚĆ

Markery klasy II -Polimorfizm fragmentów DNA (na ogół niekodujących): - RFLP - VNTR - RAPD

Metody badania polimorfizmu/mutacji DNA. Aleksandra Sałagacka Pracownia Diagnostyki Molekularnej i Farmakogenomiki Uniwersytet Medyczny w Łodzi

WYBRANE RODZAJE REAKCJI PCR. RAPD PCR Nested PCR Multipleks PCR Allelo-specyficzny PCR Real Time PCR

Analizy wielkoskalowe w badaniach chromatyny

mikrosatelitarne, minisatelitarne i polimorfizm liczby kopii

Substancje stosowane do osadzania enzymu na stałym podłożu Biotyna (witamina H, witamina B 7 ) Tworzenie aktywnej powierzchni biosensorów

GENOMIKA FUNKCJONALNA. Jak działają geny i genomy? Poziom I: Analizy transkryptomu

Metody odczytu kolejności nukleotydów - sekwencjonowania DNA

Metody badania ekspresji genów

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

GENOMIKA FUNKCJONALNA. Jak działają geny i genomy? Poziom I: Analizy transkryptomu

GENOMIKA FUNKCJONALNA. Jak działają geny i genomy? Poziom I: Analizy transkryptomu

Ćwiczenie 3 Oznaczenie polimorfizmu genetycznego cytochromu CYP2D6 metodą PCR w czasie rzeczywistym (rtpcr) przy użyciu sond typu TaqMan

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych

Mikrosatelitarne sekwencje DNA

PCR. Aleksandra Sałagacka

Genetyka, materiały dla studentów Pielęgniarstwa

Ćwiczenie 3. Amplifikacja genu ccr5 Homo sapiens wykrywanie delecji Δ32pz warunkującej oporność na wirusa HIV

Transformacja pośrednia składa się z trzech etapów:

Klonowanie molekularne Kurs doskonalący. Zakład Geriatrii i Gerontologii CMKP

Oznaczenie polimorfizmu genetycznego cytochromu CYP2D6: wykrywanie liczby kopii genu

dr hab. Beata Krawczyk Katedra Mikrobiologii PG Publikacja współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Bioinformatyczna analiza danych. Wykład 1 Dr Wioleta Drobik-Czwarno Katedra Genetyki i Ogólnej Hodowli Zwierząt

Techniki molekularne w mikrobiologii SYLABUS A. Informacje ogólne

Metody: PCR, MLPA, Sekwencjonowanie, PCR-RLFP, PCR-Multiplex, PCR-ASO

TECHNIKI WYKORZYSTYWANE W DIAGNOSTYCE MOLEKULARNEJ CHORÓB JEDNOGENOWYCH TECHNIQUES USED IN MOLECULAR DIAGNOSTICS OF MONOGENIC DISORDERS

POLIMERAZY DNA- PROCARYOTA

GENOMIKA. MAPOWANIE GENOMÓW MAPY GENOMICZNE

Dane mikromacierzowe. Mateusz Markowicz Marta Stańska

Biologia medyczna, materiały dla studentów

Powodzenie reakcji PCR wymaga właściwego doboru szeregu parametrów:

Glimmer umożliwia znalezienie regionów kodujących

Oznaczenie polimorfizmu genetycznego cytochromu CYP2D6: wykrywanie liczby kopii genu

Geny, a funkcjonowanie organizmu

Wprowadzenie do genetyki sądowej. Materiały biologiczne. Materiały biologiczne: prawidłowe zabezpieczanie śladów

Inżynieria Genetyczna ćw. 3

Najważniejsze z nich to: enzymy restrykcyjne wektory DNA inne enzymy np. ligazy, fosfatazy, polimerazy, nukleazy

Dr hab.n.med. Renata Jacewicz

Jaka jest lokalizacja genu na chromosomie? Jakie jest jego sąsiedztwo?

Metody analizy genomu

Nowoczesne systemy ekspresji genów

Konspekt do zajęć z przedmiotu Genetyka dla kierunku Położnictwo dr Anna Skorczyk-Werner Katedra i Zakład Genetyki Medycznej

TaqNovaHS. Polimeraza DNA RP902A, RP905A, RP910A, RP925A RP902, RP905, RP910, RP925

Farmakogenetyka Biotechnologia Medyczna I o

Sekwencje mikrosatelitarne. SNP Single Nucleotide Polymorphism (mutacje punktowe, polimorfizm jednonukleotydowy)

Najważniejsze z nich to: enzymy restrykcyjne wektory DNA inne enzymy np. ligazy, fosfatazy, polimerazy, nukleazy

Proteomika: umożliwia badanie zestawu wszystkich lub prawie wszystkich białek komórkowych

2. Enzymy pozwalające na manipulację DNA a. Polimerazy DNA b. Nukleazy c. Ligazy

Co to jest transkryptom? A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 2

RT31-020, RT , MgCl 2. , random heksamerów X 6

Ćwiczenie 12. Diagnostyka molekularna. Poszukiwanie SNPs Odczytywanie danych z sekwencjonowania. Prof. dr hab. Roman Zieliński

POLIMERAZY DNA- PROCARYOTA

Genetyczne modyfikowanie organizmów Kierunek OCHRONA ŚRODOWISKA, II rok semestr letni 2015/16

Warunki udzielania świadczeń w rodzaju: świadczenia zdrowotne kontraktowane odrębnie 8. BADANIA GENETYCZNE

Dr hab.n.med. Renata Jacewicz

TaqNova-RED. Polimeraza DNA RP20R, RP100R

Sekwencjonowanie Nowej Generacji ang. Next Generation Sequencing. Wykład 6 Część 1 NGS - wstęp Dr Wioleta Drobik-Czwarno

DNA musi współdziałać z białkami!

Ekologia molekularna. wykład 1

Biologia Molekularna Podstawy

Geny i działania na nich

Analizy DNA in silico - czyli czego można szukać i co można znaleźć w sekwencjach nukleotydowych???

BUDOWA I FUNKCJA GENOMU LUDZKIEGO

wykład dla studentów II roku biotechnologii Andrzej Wierzbicki

października 2013: Elementarz biologii molekularnej. Wykład nr 2 BIOINFORMATYKA rok II

Najważniejsze z nich to: enzymy restrykcyjne wektory DNA inne enzymy np. ligazy, fosfatazy, polimerazy, kinazy, nukleazy

MARKERY MIKROSATELITARNE

Zastosowanie metody RAPD do różnicowania szczepów bakteryjnych

Przydatność technologii Sekwencjonowania Nowej Generacji (NGS) w kolekcjach Banków Genów Joanna Noceń Kinga Smolińska Marta Puchta Kierownik tematu:

Inżynieria genetyczna- 6 ECTS. Inżynieria genetyczna. Podstawowe pojęcia Część II Klonowanie ekspresyjne Od genu do białka

PCR - ang. polymerase chain reaction

S YL AB US MODUŁ U ( PRZEDMIOTU) I nforma c j e ogólne. Biologia molekularna

Analiza sekwencji promotorów

dr hab. Beata Krawczyk Katedra Mikrobiologii PG

1. Barwienie przeglądowe ogólna struktura mózgu i płatów wzrokowych Drosophila

Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA

Analiza genetyczna w niepowodzeniach ciąży i badaniach prenatalnych

Elektroforeza kwasów nukleinowych

2. Przedmiot zamówienia: Odczynniki chemiczne do izolacji DNA i reakcji PCR, wymienione w Tabeli 1. Nazwa odczynnika Specyfikacja Ilość*

Podstawowe strategie i techniki genetyki molekularnej

Ćwiczenia 1 Wirtualne Klonowanie Prowadzący: mgr inż. Joanna Tymeck-Mulik i mgr Lidia Gaffke. Część teoretyczna:

Wykład 14 Biosynteza białek

Dr hab. Beata Krawczyk Katedra Mikrobiologii, Politechnika Gdańska

Przetarg nieograniczony na zakup specjalistycznej aparatury laboratoryjnej Znak sprawy: DZ-2501/6/17

PCR PCR. Model replikacji semikonserwatywnej

DNA i RNA ENZYMY MODYFIKUJĄCE KOŃCE CZĄSTECZEK. DNA i RNA. DNA i RNA

7. Metody molekularne jako źródło informacji botanicznej i lichenologicznej

Zmienność genomu. Przyczyny, skutki i sposoby kontroli

Ligazy. Zastosowanie ligazy w inżynierii genetycznej:

Wybrane techniki badania białek -proteomika funkcjonalna

wykład dla studentów II roku biotechnologii Andrzej Wierzbicki

PCR łańcuchowa reakcja polimerazy

Dr. habil. Anna Salek International Bio-Consulting 1 Germany

Tematyka zajęć z biologii

DHPLC. Denaturing high performance liquid chromatography. Wiktoria Stańczyk Zofia Kołeczko

PODSTAWY BIOINFORMATYKI 12 MIKROMACIERZE

Mapowanie i markery molekularne

Transkrypt:

Marker genetyczny- polimorficzna cecha jakościowa organizmu, którą charakteryzuje proste dziedziczenie (mendlowskie) oraz którą można dokładnie identyfikować metodami analitycznymi. Markery klasy I - Antygeny erytrocytarne - Allotypy - Białka polimorficzne - Antygeny głównego układu zgodności tkankowej- MHC Markery klasy II -Polimorfizm fragmentów DNA: - RFLP - VNTR - RAPD Markery klasy I -Są identyfikowane badaniami serologicznym. Badania serologiczne wykrywają obecność reakcji odpornościowej organizmu (przeciwciał) we krwi, w surowicy lub na powierzchni tkanek. Badanie polega na pobraniu tkanki, w której oznacza się obecność przeciwciał. Markery klasy II -Są identyfikowane metodą elektroforetyczną. Elektroforeza to proces wykorzystujący polarność cząsteczek. Cząsteczki DNA (lub białka) umieszczone w nośniku, w polu elektrycznym migrują dokatodowo (od ładunku (-) do (+)) PCR 1950 opisanie pierwszej polimerazy (Kornberg) 1960 synteza pierwszych oligonukleotydów (Khorana) 1970 odkrycie termostabilnej polimerazy Taq otrzymanie pierwszej polimerazy, która nie ma właściwości nukleazy (buduje lecz nie niszczy)- (Klenow) 1980 opracowanie reakcji PCR (1984) i rozpowszechnienie jej przydatności 1993 Nagroda Nobla Brock & Freeze, 1969 1

MARKERY RAPD RAPD PCR (Random Amplification of Polymorphic DNA) wykorzystywany gdy nie znamy sekwencji starterów; pozwala namnożyć losowe fragmenty o różnej długości; w reakcji stosuje się tylko jeden (losowy) starter. długość około 10 nukleotydów, zawartość par G/C musi być w granicach 50-80% nie może zawierać sekwencji palindromowych* 5 CAATCGCCGT 3 RAPD PCR http://www2.uni-jena.de/biologie/mikrobio/tipps/rapd.html Tube A-08 5'-GTGACGTAGG-3' Tube A-09 5'-GGGTAACGCC-3' Tube A-10 5'-GTGATCGCAG-3' Tube A-11 5'-CAATCGCCGT-3' Tube A-12 5'-TCGGCGATAG-3' Tube A-13 5'-CAGCACCCAC-3' Tube A-14 5'-TCTGTGCTGG-3' Tube A-15 5'-TTCCGAACCC-3' Tube A-16 5'-AGCCAGCGAA-3' Tube A-17 5'-GACCGCTTGT-3' Tube A-18 5'-AGGTGACCGT-3' RAPD PCR starter A-11 DNA starter A-11 2

RAPD PCR 1 2 3 SM Po amplifikacji z wybranym starterem otrzymujemy od kilku do kilkunastu fragmentów różnej długości dla danego osobnika (charakterystyczny wzór prążkowy) zastosowanie: diagnostyka PCR-RFLP wykrywanie: mutacje punktowe, insercje i delecje powodujące zmiany struktury drugorzędowej wymagania: sekwencja musi być znana* odpowiednie dobranie enzymu restrykcyjnego, rozpoznającego miejsce mutacji dowolna długość produktu PCR czułość metody: wykrywanie mutacji 100% PCR-RFLP genotyp -/- +/+ -/+ A T A T G C G C A T G C -/- +/+ -/+ Produkty PCR Trawienie specyficzną endonukleazą 3

SSCP polimorfizm konformacji jednoniciowych fragmentów DNA- Single Strand Conformation Polymorphism wykorzystuje zmienną ruchliwość elktroforetyczną drugorzędowej struktury DNA konformery: niestabilne fragmenty jednoniciowego DNA, szybko ulegające renaturacji aby zachować różnice w migracji konformerów elektroforeza powinna być prowadzona w warunkach natywnych PCR-SSCP genotyp -/- +/+ -/+ A T A T G C G C A T G C -/- +/+ -/+ Produkty PCR Denaturacja 90 o C; 5min SSCP zastosowanie: wstępna analiza polimorfizmu badania przesiewowe wykrywanie: mutacje punktowe, insercje i delecje powodujące zmiany struktury drugorzędowej wymagania: sekwencja nie musi być znana długość produktu PCR nie dłuższa niż 300pz temperatura rozdziału elektroforetycznego10-20 o C dobranie odpowiednich parametrów żelu czułość metody: wykrywanie mutacji 80% 4

różne układy konformerów A B C D różne układy konformerów AB A B DNA MIKROSATELITARNY VNTR (ang. Variable Number of Tandem Repeats) sekwencje o zmiennej liczbie tandemowych powtórzeń. STR (ang. Short Tandem Repeats) - krótkie tandemowe powtórzenia SSR (ang. Simple Sequence Repeats) - proste sekwencje powtarzalne znajdują się w części niekodującej (w intronach) sekwencje mikrosatelitarne charakteryzują się krótkimi (1-6pz) powtarzanymi motywami motyw powtarzany jest do 30 razy Cała sekwencja tworzy kompleks kilkuset par zasad JAK WYGLĄDA MIKROSATELITA? długość powtarzanego motywu sekwencje jednonukleotydowe 5 AAAAAAAAAAAAAAAA 3 (A)n sekwencje dwunukleotydowe 5 ACACACACACACACAC 3 (AC)n struktura powtarzanego motywu sekwencje proste/zupełne 5 ACACACACACACACAC 3 (AC)n sekwencje proste przerwane 5 ACACACCTTACACAC 3 (AC)nCTT(AC)n sekwencje złożone 5 ACACACACGTGTGTGT 3 (AC)n(GT)n sekwencje złożone przerywane 5 ACACACCTTGTGTGT 3 (AC)nCTT(GT)n 5

allel zerowy (ang. null allele) jest zmutowaną kopią genu, która całkowicie utraciła swoje funkcje. Rezultatem utraty funkcji jest całkowity brak białka (RNA), albo wytworzenie produktu niefunkcjonalnego. Efekt fenotypowy jest identyczny z wystąpieniem delecji. W przypadku neutralnych markerów molekularnych, allele zerowe stanowią niewykrywalne diagnostycznie formy. Wystąpienie mutacji w rejonie wiązania starterów uniemożliwia ich amplifikację W analizie zmienności genetycznej, istnienie alleli zerowych objawia się nieproporcjonalnym stosunkiem homo- do heterozygot MARKERY SNP Allelo-specyficzny PCR (Allele Specific PCR) wykorzystywany do wykrywania mutacji punktowych SNP; pozwala na selektywne przyłączanie się starterów w zależności od sekwencji matrycy w reakcji stosuje się trzy startery, w tym dwa znakowane fluorescencyjnie Taqman Genotyping 6

Odczyt kolejności nukleotydów na nici DNA/RNA Metody klasyczne: - chemicznej degradacji łańcucha (1977r, met. Maxama i Gilberta) - terminacji łańcucha/met. Enzymatyczna (1977r; met. Sangera) Metody nowoczesne: - Pirosekwencjonowanie - NGS SEKWENCJONOWANIE Sekwencjonowanie Sangera 1994: H. Influenzae 1.8 Mbp (Fleischmann et al.) 2007: Global Ocean Sampling Expedition ~3,000 organisms, 7Gbp (Venter et al.) 1980 1990 2000 1982: lambda virus DNA stretches up to 30-40Kbp (Sanger et al.) 2001: H. Sapiens, D. Melanogaster 3 Gbp (Venter et al.) 20 7

SEKWENCJONOWANIE NASTĘPNEJ GENERACJI- NGS Losowa fragmentacja nici DNA Dołączanie odpowiednich linkerów (konstrukcja biblioteki) Amplifikacja biblioteki na podłożu szklanym lub plastikowym biosensory Wielokrotnie przeprowadzone reakcje równocześnie odczytywane przez instrument parallel processing Odczyty ilościowe Nie wymagają elektroforezy Mikromacierze Zminiaturyzowane systemy hybrydyzacyjne służące do badania ekspresji genów lub wykrywania mutacji punktowych lub miejsc metylacji Główne różnice to: 1. Sposób wykonania mikromacierzy (rodzaj podłoża) 2. Rodzaj sond (DNA; RNA; oligonukleotydy) 3. Sposób uzyskiwania impulsu świetlnego (rodzaj, liczba i znaczników fluorescencyjnych oraz miejsce ich przyłączenia) Mikromacierze- rodzaj podłoża 1. Podłoże szklane najwcześniej opracowany rodzaj podłoża powierzchnia szkiełka ok 3,6cm 2 na szkiełku może się zmieścić od 10 do 20tys punktów. 1 punkt to sekwencja jednoniciowego kwasu nukleinowego odpowiadająca np. 1 genowi 1 punkt ma średnicę od 50 do 150μm i jest tworzony z produktu PCR (charakterystycznego dla danego genu) o stężeniu 100-500μg (objętość to kilka nano litrów) poszczególne punkty oddalone są od siebie o 200-250μm długość sondy może osiągać 2tys par zasad sonda przyłącza się do podłoża kowalencyjnie tanie w produkcji kwas nukleinowy musi być doskonałej jakości, co wiąże się z dużym nakładem pracy Affymetri x 8

Mikromacierze- rodzaj podłoża 1. Podłoże kwarcowe rodzaj podłoża opracowany w 1991r powierzchnia wafla kwarcowego ok 12,7cm 2 (chip) sondy umieszczane są techniką fotolitografii lub iniekcyjnie Agilent; Affymetrrix sekwencje sond są bezpośrednio syntetyzowane (de novo) na powierzchni chipa sonda przyłącza się do podłoża kowalencyjnie długość sondy to ok. 25 nukleotydów szybkie (zautomatyzowane przygotowywanie sond) wysoka komplementarność sond wysoki koszt mała specyficzność (bo krótkie sondy) Mikromacierze- rodzaj podłoża 1. Podłoże kwarcowe perełki krzemionkowe o średnicy 3μm (beadchip) sondy przytwierdzają się do perełek przez adresówki o długości 23nt Illumina każda perełka jest pokryta setkami tysięcy kopii określonego oligonukleotydu sondy mają długość 50nt (po zakotwiczeniu- 73-80) perełki trafiają losowo do dołka każda perełka z konkretną sondą na jednej macierzy jest kopiowana 15-30 razy. Perełki oddalone są od pozostałych na odległość 5,7μm gęstość upakowania perełek: 40tys na 1mm 2 są bardzo drogie Mikromacierze- rodzaj sond 1. Sondy DNA Fragmenty genów (PCR) Próby- cdna od 2 porównywanych osobników (np. zdrowy/chory) znakowany różnymi fluorochromami Kolor zielony charakterystyczny dla jednej próby, czerwony dla drugiej, żółty oznacza hybrydyzację obu prób w tej samej plamce Metoda przestarzała! 9

Mikromacierze- rodzaj sond 1. Sondy DNA Oligonukleotydy DNA- Synteza na podłożu Próba- od pojedynczego osobnika RNA- cdnaarna znakowany biotyną. Intensywność świecenia w zależności od ilości hybrydyzujących kopii. TECHNIKI ANALIZY RNA Ilościowa analiza mrna aktywność genów w zależności od wybranych czynników: o rodzaju tkanki o rodzaju czynnika zewnętrznego o rodzaju upośledzenia szlaku metabolicznego Jakościowa analiza RNA (wirusów i bakterii) TECHNIKI ANALIZY RNA Ilościowe oznaczanie RNA Northern Blot Geny reporterowe Mała- średnia informatywność PCR z odwrotną transkryptazą i badanie ekspresji metodą RealTime Mikromacierze RNA Sekwencjonowanie RNA Duża informatywność 10

TECHNIKI ANALIZY RNA- GENY REPORTEROWE Geny reporterowe służą badaniu aktywności innych genów złączone z badanym genem (najczęściej promotorem) produkują mrna (i białko), którego ilość jest mierzona (fluorymetrycznie) ilość wyprodukowanego białka będzie miernikiem aktywności badanego promotora o Produkt genów reporterowych powinien być łatwo wykrywalny o Ilość produkowanego białka powinna być mierzalna (odpowiedni dobór metody) o Produkt genów reporterowych nie może być toksyczny ani inwazyjny dla żywych komórek o Powinien dać się oznaczyć in situ TECHNIKI ANALIZY RNA- GENY REPORTEROWE Gen białka zielonej florescencji GFP (Green Fluorescent Protein) naturalnie występuje w genomie Aequorea victoria wprowadzenie i utrwalenie mutacji w tym genie pozwoliło na zmianę fluoroforu (pierwotnie kodowanego przez trzy aminokwasy: serynę, tyrozynę i glicynę) nowe mutanty genu pozwalają na produkcję białka emitującego niebieską (B), żółtą (Y), czerwoną (R) lub cyjanową (C) barwę światła TECHNIKI ANALIZY RNA- GENY REPORTEROWE Gen lucyferazy naturalnie występuje w genomie Photinus pyralis świecenie jest następstwem utleniania lucyferyny w obecności ATP Gen acetylotransferazy chloramfenikolu (CAT) naturalnie występuje w genomie Escherichia coli Acetylacja chloramfenikolu w środowisku komórki powoduje świecenie 11

TECHNIKI ANALIZY RNA- GENY REPORTEROWE Tygodni e Badanie aktywności promotorów nowotworowych raka mózgu http://www.metamouse.com/gfp%20models.html TECHNIKI ANALIZY RNA- NORTHERN BLOT Elektroforetyczny rozdział fragmentów DNA (agaroza) Przeniesienie rozdzielonych fragmentów na membranę (nitrocelulozową) Hybrydyzacja z sondami ssdna - znana sekwencja - znakowanie: radioaktywne- aktywny węgiel, siarka Fluorescencyjne- biotyna Enzymatyczne- alkaliczna fosfataza Oznaczenie ilości konkretnej frakcji TECHNIKI ANALIZY RNA- NORTHERN BLOT Poly(A)+ RNA: from rat tissues Probe: G3PDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) From Dr. Yu 12