Markery klasy II -Polimorfizm fragmentów DNA (na ogół niekodujących): - RFLP - VNTR - RAPD

Transkrypt

1 Marker genetyczny- polimorficzna cecha jakościowa organizmu, którą charakteryzuje proste dziedziczenie (mendlowskie) oraz którą można dokładnie identyfikować metodami analitycznymi. Markery klasy I - Antygeny erytrocytarne - Allotypy - Białka polimorficzne - Antygeny głównego układu zgodności tkankowej- MHC Markery klasy II -Polimorfizm fragmentów DNA (na ogół niekodujących): - RFLP - VNTR - RAPD Markery klasy I -Są identyfikowane badaniami serologicznym. Badania serologiczne wykrywają obecność reakcji odpornościowej organizmu (przeciwciał) we krwi, w surowicy lub na powierzchni tkanek. Badanie polega na pobraniu tkanki, w której oznacza się obecność przeciwciał. Markery klasy II -Są identyfikowane metodą elektroforetyczną. Elektroforeza to proces wykorzystujący polarność cząsteczek. Cząsteczki DNA (lub białka) umieszczone w nośniku, w polu elektrycznym migrują dokatodowo (od ładunku (-) do (+)) Białka polimorficzne albuminy α- i β- globuliny pełnią szereg funkcji związanych z podtrzymaniem i regulacją procesów życiowych; Z tych białek są zbudowane: wszystkie enzymy i hormony (insulina, tereoglobulina, przeciwciała, hemoglobina, fibrynogen). γglobulina β α2 α1 1

2 Antygeny głównego układu zgodności tkankowej- MHC zespół białek, odpowiedzialnych za prezentację antygenów limfocytom T w zależności od funkcji wyróżnia się trzy klasy MHC: - MHC klasy I znajdują się na wszystkich jądrzastych komórkach organizmu i uczestniczą w obronie przed patogenami wewnątrzkomórkowymi - MHC klasy II występują na specjalnej komórkach prezentujących antygen - MHC klasy III stanowią różne cząsteczki, związane z procesem prezentacji antygenu - BG 2 KO x Y 2 A O - zwiększone przyrosty masy ciała Białka polimorficzne κ kazeina- bydło Antygeny erytrocytarne- grupy krwi układ grupowy H i A- świnie -S s S s wrażliwość świń na stres i jakość mięsa układ grupowy B- bydło - AB lub BB- mleko przydatne do produkcji serów (krótszy czas koagulacji = szybsze tworzenie się skrzepu) - AA- większa wydajność mleczna, mniej białka w mleku Antygeny głównego układu zgodności tkankowej- MHC MHC- owce, bydło - OLA-A4- odporność na scrapie - BOLA-W16, W6, A6, A11- podatność na mastitis Diagnostyka genetyczna Monitoring populacji Dobieranie leków Jaki zasięg ma choroba w populacji? Testy prenatalne Czy nasze dziecko jest zdrowe? Nosicielstwo chorób Na jakie choroby narażony jest pacjent? Wykrywanie chorób Czy pacjent jest chory? Jakiego typu leki będą najlepsze? 6 2

3 Diagnostyka Genetyczna - Diagnostyka chorób zakaźnych - Diagnostyka chorób dziedzicznych - Genetyczne określanie osobników DOBRY TEST GENETYCZNY: - Powtarzalny - Specyficzny - Łatwy Geny regulatorowe Środowisko Zmiany epigenetyczne Produkcja enzymów Geny strukturalne Enzymy Reakcje biochemiczne Brak lub obecność substratów Czynniki fizyczne Metabolizm komórkowy Rozwój nerwów, szkieletu i systemu wydzielniczego Rozwój zmysłów Mechanizmy fizjologiczne Choroba Brak lub obecność substratów Czynniki środowiskowe Czynniki środowiskowe (socjalne) Co badamy? Odcisk palca składa się z kombinacji kilku elementów, nie ma dwóch identycznych odcisków palca! Profil genetyczny składa się z kombinacji kilkunastu fragmentów DNA, W przypadku niektórych zwierząt nie zawsze tak kombinacja jest niepowtarzalna! DLACZEGO??? 3

4 Co badamy? Na podstawie odcisków palca nie można określić pokrewieństwa. Na podstawie profilu genetycznego można! DLACZEGO??? startery matryca DNA MgCl 2 Taq polimeraza DNA bufor dttp datp dgtp dctp 5 -trifosforany deoksyrybonukleozydów Helikaza rozplata podwójną strukturę DNA 4

5 Widełki replikacyjne CYKL 1 denaturacja 94 C jednoniciowa matryca DNA Replikacja na nici wiodącej Polimerazy DNA przyłączają deoksynukleozydotrójfosforany zawsze od końca 5 do 3 Uwalnia się energia 5

6 CYKL 1 przyłączenie startera do matrycy C starter F starter R CYKL 1 wydłużanie startera 72 C starter 1 starter 2 powstają cząsteczki dłuższe od sekwencji docelowej 6

7 CYKL 2 denaturacja matrycy 94 C matryca DNA, który powstał w cyklu 1 Replikacja na nici opóźnionej 5 3 Poszczególne fragmenty łączone są ze sobą przy pomocy ligazy Fragmenty Okazaki CYKL 2 przyłączenie startera do matrycy C 7

8 CYKL 2 wydłużanie starterów 72 C powstają cząsteczki dłuższe od sekwencji docelowej powstają cząsteczki o długości sekwencji docelowej 94 C 94 C 94 C 94 C 72 C 72 C 72 C TEMPERATURA 55 C 55 C 55 C JEDEN CYKL CZAS Diagnostyka genetyczna- Identyfikacja osobnicza 8

9 POLIMORFIZM - Przeciętnie geny posiadają 2 allele, co pozwala na utworzenie 3 możliwych kombinacji w populacji -8 alleli (form genetycznych) odpowiedzialnych za powstanie antygenów pozwala na utworzenie 36 różnych kombinacji w populacji - 10 różnych form powstałych w miejscu niekodującym pozwala utworzyć 55 różnych kombinacji w populacji - połączenie jednoczesnej analizy dwunastu takich miejsc pozwala uzyskać 7260 kombinacji LICZBA PSÓW O IDENTYCZNYM GENOTYPIE 1000 niespokrewnionych psów: 333 spokrewnionych* DNA MIKROSATELITARNY VNTR (ang. Variable Number of Tandem Repeats) sekwencje o zmiennej liczbie tandemowych powtórzeń. STR (ang. Short Tandem Repeats) - krótkie tandemowe powtórzenia SSR (ang. Simple Sequence Repeats) - proste sekwencje powtarzalne znajdują się w części niekodującej (w intronach) sekwencje mikrosatelitarne charakteryzują się krótkimi (1-6pz) powtarzanymi motywami motyw powtarzany jest do 30 razy Cała sekwencja tworzy kompleks kilkuset par zasad Polimorfizm fragmentów tandemowo powtarzających się DNA satelitarny Składa się z motywów do 200pz (par zasad). Całkowita długość sekwencji wynosi nawet kilka milionów pz. Motyw powtarzany 5...ATAAACTATAAACTATAAACT...3 Fragment DNA satelitarnego Drosophili X 1,000,000 9

10 (AC) 3 (AC) 5 Mutacja wytworzona na skutek poślizgu polimerazy (AC) 20 (AC) 20 (AC) 23 (AC) 23 (AC) 18 (AC) 25 (AC) 20 (AC) 20 (AC) 24 (AC) 24 (AC) 20 (AC) 24 (AC) 20 (AC) 24 (AC) 20 (AC) 20 (AC) 20 (AC) 24 (AC) 20 (AC) 24 (AC) 24 (AC) 24 10

11 PANEL SEKWENCJI MIKROSATELITARNYCH PEZ1; PEZ3; PEZ5; PEZ6; PEZ8; PEZ12; PEZ20; FHC2010; FHC2054; FHC2079-ISAG (International Society of Animal Genetics, 2001) 31 ANALIZA 1 OJCIEC SYN MATKA 32 ANALIZA 2 Rubeus syn C E 35 Gloria matka B E 36 Rusałka córka B C Bases 33 11

12 34 Diagnostyka genetyczna- Identyfikacja mutacji punktowych ENZYMY RESTRYKCYJNE- nukleazy - Egzonukleazy (usuwają nukleotydy z końca cząsteczki DNA) - Endonukleazy (przecinają wiązania fosfodiestrowe wewnątrz cząsteczki) - Na szybkość przebiegu reakcji enzymatycznej wpływają: Temperatura; ph; siła jonowa; stężenie substratu; stężenie enzymu; obecność aktywatorów lub inhibitorów 12

13 restryktazy (enzymy restrykcyjne, endonukleazy restrykcyjne) - to enzymy izolowane z bakterii, zdolne do rozpoznawania specyficznych sekwencji w DNA (z reguły są to sekwencje palindromowe- kajak) i do przecinania dwuniciowej cząsteczki DNA w ściśle określonym miejscu, w obrębie lub okolicy sekwencji rozpoznawanej* - jednostka aktywności enzymu restrykcyjnego (U) to taka jego ilość, która trawi kompletnie 1mg DNA faga λ (około 50 kb) w czasie 1 godz. w temperaturze 37 C. nazewnictwo: EcoRV pierwsza litera- rodzaj bakterii, druga i trzecia- gatunek; następna litera oznacza szczep lub typ; kolejne enzymy z danego szczepu lub typu otrzymują litery rzymskie Enzymy restrykcyjne szukają w obrębie sekwencji DNA konkretnego fragmentu Po znalezieniu, tworzą kompleks z helisą Hydrolizują wiązania 5 Sekwencje palindromowe w DNA 3 Większość enzymów rozpoznaje sekwencje palindromowe: KAJAK

14 Hae III- endonukleaza klasy II 5 TGACGGGTTCGAGGCCAG 3 3 ACTGCCCAAGGTCCGGTC 5 5 TGACGGGTTCGAGGCCAG 3 3 ACTGCCCAAGGTCCGGTC 5 5 TGACGGGTTCGAGG CCAG 3 3 ACTGCCCAAGGTCC GGTC 5 PCR-RFLP genotyp -/- +/+ -/+ A T A T G C G C A T G C -/- +/+ -/+ Produkty PCR Trawienie specyficzną endonukleazą 14