Dr hab. Beata Krawczyk Katedra Mikrobiologii, Politechnika Gdańska

Transkrypt

1 Narzędzia diagnostyki molekularnej w typowaniu genetycznym (genotypowaniu) Dr hab. Beata Krawczyk Katedra Mikrobiologii, Politechnika Gdańska Publikacja współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego 1

2 Odkrycia biologii molekularnej, które wpłynęły na rozwój diagnostyki molekularnej Data Odkrycia 1953 poznanie struktury heliakalnej dwuniciowego DNA 1958 izolacja polimerazy DNA I E. coli 1960 pierwsza technika hybrydyzacji 1969 hybrydyzacja in situ 1970 odkrycie enzymów restrykcyjnych yj y i odwrotnej transkryptazy 1975 Southern blotting 1977 sekwencjonowanie DNA 1983 pierwsza synteza oligonukleotydów 1985 analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych 1985 wynalezienie PCR zastosowanie fluorescencji w hybrydyzacji in situ (FISH) odkrycie termostabilnej polimerazy DNA optymalizacja PCR 1992 koncepcja real time PCR 1996 pierwsze aplikacje mikromacierzy DNA 2001 pierwsza wersja sekwencji ludzkiego genomu 2

3 Wybór metody diagnostycznej zależy od poruszanego problemu: wykrywanie identyfikacja typowanie (różnicowanie) badania taksonomiczne; filogeneza 3

4 środowisko Genotyp genom Metody genotypowe Metody wykorzystujące właściwości kwasów nukleinowych np. hybrydyzacja DNA DNA, mikromacierze oligonukleotydowe tzw. chip DNA Metody oparte na analizie kwasów nukleinowych analizie genu analizie fragmentu genu analizie genomu Ekspresja genu Klasyczne Biotypowanie Typowanie bakteriofagowe Typowanie bakteriocynowe Antybiogramy Metody fenotypowe Fenotyp Molekularne Analiza białek PAGE, MLEE Immunodiagnostyka 4

5 Wybór metody badawczej uzależniony jest od celu jaki chcemy osiągnąć Rodzina Rodzaj Gatunek Podgatunek Szczep Sekwencjonowanie DNA Sekwencjonowanie 16S rdna Rybotypowanie w systemie ARDRA Hybrydyzacja DNA DNA ITS PCR RFLP, PFGE Multilocus Enzyme Electrophoresis MLEE Analiza Profili Białkowych z całych komórek AFLP RAPD, AP PCR Rep PCR 5

6 Typowanie mikroorganizmów Typowanie jest to fenotypowa i/lub genotypowa analiza mikroorganizmów, i poniżej poziomugatunku lub podgatunku 6

7 Typowanie jest to fenotypowa i/lub genotypowa analiza izolatów bakteryjnych, poniżej poziomu gatunku lub podgatunku. stwierdzenie czy wśród badanego zbioru izolatów istnieją grupy wykazujące podobieństwo, świadczące o pochodzeniu klonalnym identyfikacja obecności i opisu dynamiki rozprzestrzeniania się poszczególnych szczepów bakteryjnych danego gatunku identyfikacja ogniska epidemicznego i dostarczenia przesłanek, co do sposobu jego wygaszenia Typowanie drobnoustrojów badanie śladów biologicznych biologicznych w kryminalistyce filogeneza (genetyka ewolucji) wykrywanie i charakterystyka elementów genetycznych y odpowiedzialnych za rozprzestrzenianie się, zjadliwość i lekooporność bakterii szukanie związków pomiędzy mechanizmami wirulencji wśród badanych szczepów; Metody typowania najczęściej wykorzystywane są do badań organizmów haploidalnych, jednak coraz częściej znajdują zastosowanie również w badaniach organizmów diploidalnych takich jak: drożdże, grzyby parazyty. 7

8 W trakcie wyboru markera powinniśmy kierować się: Poziomem zmienności organizmu niektóre fragmenty genomu mutują szybciej niż inne, a pożądany stopień polimorfizmu zależy od postawionego pytania Markery molekularne są narzędziami do uzyskiwania danych Organizmy blisko spokrewnione wymagają markerów bardzo zmiennych Do badania odległych genetycznie taksonów wykorzystujemy y ymniej polimorficzne fragmenty Markery kodominujące Identyfikują wszystkie allele w danym locus: RFLP, sekwencje, SNP, mikrosatelity np.str Markery dominujące ujawniają tylko dominującą formę alleliczną: RAPD, AFLP 8

9 Metody genotypowania Metoda genotypowania Udział w typowaniu szczepów Powtarzalność wyników Potencjał różnicujący Typowanie plazmidowe Większość Wystarczająca Wystarczający Hybrydyzacja (rybotypowanie oparte o Southern blot, Wszystkie Bardzo dobra Bardzo dobry mikromacierze) REA PFGE Wszystkie Dobra Bardzo dobry Rybotypowanie oparte o PCR Wszystkie Bardzo dobra Dobry PCR/RFLP Wszystkie Bardzo dobra Dobry PCR fingerprinting np. RAPD Wszystkie Dobra Bardzo dobry AFLP Wszystkie Bardzo dobra Bardzo dobry ADSRRS fingerprinting? Bardzo dobra Bardzo dobry PCR MP? Bardzo dobra Bardzo dobry Real time PCR Wszystkie Bardzo dobra? Sekwencjonowanie (MLST) Wszystkie Bardzo dobra Bardzo dobry 9

10 Identyfikacja szczepów bakteryjnych Antybiogramy, klasyczne serotypowanie fagotypowanie Pierwsze próby wprowadzania molekularnych testów do typowania 1970 PPA RFLP Hbrd Hybrydyzacja Southern 1985 PFGE Druga seria testów molekularnych do typowania Metody PCR: RAPD, AFLP, itp. Rozwój baz danych Powszechne stosowanie testów molekularnych MLVA MLST dlst Rep PCR Między narodowa wymiana danych??? Innowacyjne technologie sekwencjonowanie genomów, technologie oparte na genomice, spektroskopia 10

11 Analiza profili plazmidowych (ang.. PPA - Plasmid Profile Analysis) Po raz pierwszy została zastosowana w badaniach epidemiologicznych w roku 1988 Uważa się, że szczepy izogeniczne (należące do tej samej grupy) mają identyczny zestaw plazmidów Technika prosta, ale ograniczona do szczepów posiadających plazmidy, szczepy bezplazmidowe są nietypowalne Komórki niektórych gatunków bakterii, nawet szczepów, nabywają i tracą plazmidy spontanicznie Profile plazmidowe dla E.coli 11

12 ang.. REAP Restriction Enzyme Analysis of Plazmid Liczba i wielkość uzyskanych fragmentów DNA determinowana jest przez długość sekwencji rozpoznania dla określonego enzymu restrykcyjnego oraz charakter trawionego DNA (% składu par zasad GC). Statystycznie, w przypadku DNA z zawartością par GC około 50%, 4 nukleotydowa sekwencja rozpoznania powinna występować co 256 pz, 6 nukleotydowa co 4 kpz,a sekwencja 8 nukleotydowa co 65 kpz. 12

13 Rybotypowanie Wybrane fragmenty operonu rrn stanowią cel molekularny nowoczesnych technik rybotypowania: polimorficznego regionu pomiędzy genami rrs i rrl (ang. ITS PCR Internal Transcribed Spacer PCR) zmiennego regionu wewnątrz genu rrs regionu zawierającego geny rrs i rrl oraz rozdzielający je fragment polimorficzny regionu kodującego trna Promotory Polimorficzny region DNA Terminatory 5 rrs rrl rrf 3 Produkty genowe 16S RNA trna 23S RNA 5S RNA trna 13

14 Schemat eukariotycznego operonu rrn IGS 18S rdna ITS 1 5,8S rdna ITS 2 25S 28S rdna IGS IGS Intergenic Spacer, nietranskrybowany region oddzielający powtarzające się sekwencje ITS Internal Transcribed Spacer 14

15 Komórka bakterii Izolacja genomowego DNA METODY HYBRYDYZACYJNE METODY OPARTE NA TECHNICE PCR Trawienie DNA enzymami restrykcyjnymi. Elektroforeza i transfer rozdzielonych fragmentów DNA na filtr. Hybrydyzacja z sondą komplementarną ą do rdna. RFLP zhybrydyzowanego y y z sondą rdna (rrn loci) rrn RFLP PCR regionu zmiennego między rrs rrl rdna. Polimorfizm długości produktów PCR ITS PCR RFLP produktów amplifikacji regionów operonu rrn ARDRA PCR regionu zawierającego gen kodujący 16S rrna Sekwencjonowanie otrzymanych produktów PCR. 15

16 Sekwencje repetytywne y w genotypowaniu 16

17 Wykorzystanie sekwencji repetytywnych w genotypowaniu bakterii Różnice w wielkości oraz liczbie kopii repetytywnych fragmentów DNA są podstawą różnicowania metodą rep PCR. Regiony takie najwcześniej zostały odkryte i opisane u Enterobacteriacae Rep PCR SSR ang. Short Sequence Repeat DR ang. Direct Repeat VNTR ang. Variable Number Tandem Repeat 17

18 Rep PCR Przykładem tego typu sekwencji są REP (ang. Repetitive Chromosomal Elements) o długości 38 pz i ERIC (ang. Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus) o długości pz, obecne u bakterii Gram ujemnych. VNTR (ang ang. Variable Number Tandem Repeat epeat) Krótkie sekwencje nukleotydowe, powtarzające się wiele il razy w danym locus, o różnej liczbie kopii w zależności od szczepu, tworząc tym samym polimorfizm długości. 18

19 MLVA (ang ang. Multiple Locus Variable Number Tandem Repeats Analysis) Jd Jednoczesna amplifikacja wielu il loci o zróżnicowanej jliczbie tandemowych powtórzeń MLVA (ang. Multiple Locus Variable Number Tandem Repeats Analysis) odpowiada złożonej ł ż reakcji kjipcr (ang. multipleks l PCR). Powstały obraz prążków w elektroforezie żelowej można traktować jako genetyczny fingerprinting, stąd metoda znana jest też pod nazwą MLVF ang. Multiple Locus Variable Number Tandem Repeats Fingerprinting. 19

20 MLVA (ang. Multiple Locus Variable Number Tandem Repeats Analysis) dla Staphylococcus aureus 20

21 Typowanie spa Staphylococcus aureus Uzyskiwane sekwencje tandemowych powtórzeń ń są numerowane i poddawane analizie i porównawczej z wykorzystaniem oprogramowania Ridom StaphType (dostępny na stronie Powstały kod numeryczny ny oznacza a typ spa oraz zawiera informacje na temat wykrytych zmian w regionach powtarzalnych. 21

22 Techniki genotypowania oparte na analizie całego genomu, wykorzystujące reakcje PCR Metoda nie wymaga znajomości sekwencji genomowego DNA badanego drobnoustroju PCR-fingerprinting (RAPD, AP-PCR, DAF) LM-PCR techniki oparte na ligacji adaptorów 22

23 Techniki ikipcr PCR fingerprinting i Technika PCR fingerprinting jest uniwersalną metodą wykrywania polimorfizmu DNA polega na przypadkowym amplifikowaniu polimorficznego DNA poprzez dobór odpowiednich starterów wzór elektroforetyczny t = odcisk dikpalca 23

24 RAPD ang. Random Amplified Polymorphic DNA Przypadkowe amplifikowanie polimorficznego DNA Genom A Genom B A B Rozkład produktów reakcji RAPD w rozdziale elektroforetycznym 24

25 Techniki PCR fingerprinting RAPD, AP PCR, PCR, DAF Wymienione metody różnią się od siebie tylko długością stosowanych starterów RAPD (ang. Random Amplified Polymorphic DNA) 9 10 nt, temp. dołączania ą C, detekcja z BrEt; AP PCR (ang. Arbitrarily Primed PCR) nt, temp. dołączania poniżej 45 C,55 min; 40 cykli, detekcja przez autoradiografię; DAF ( ang. DNA Amplification Fingerprinting) g) 5 8 nt, temp. dołączania ą 30 C, 30 sekund; BrEt lub Ag. 25

26 Czynniki wpływające na wyniki reakcji RAPD Startery DNA Matrycowe DNA. Stężenie chlorku magnezu Stężenie deoksyrybonukletydów Polimeraza DNA i bufor reakcyjny Parametry amplifikacji. 26

27 Dokumentacja KM PG Różnicowanie metodą RAPD szczepów K. pneumoniae, w reakcji PCR użyto polimerazy Pwo M2 - marker wielkości DNA M2 (1008, 883, 615, 517, 466, 396 pz) K- - kontrola negatywna na reakcji PCR 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 produkty reakcji RAPD dla kolejnych izolatów. Rozdział prowadzono w 6% żelu poliakryloamidowym. Różnicowanie metodą RAPD szczepów K. pneumoniae, w reakcji PCR użyto polimerazy Taq rekombinantowej M2 - marker wielkości DNA M2 (1008, 883, 615, 517, 466, 396 pz); K- kontrola negatywna reakcji PCR 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 produkty reakcji RAPD dla kolejnych izolatów. Rozdział prowadzono w 6% żelu poliakryloamidowym. 27

28 Parametry amplifikacji Temperatura denaturacji może mieć wpływ na wzór produktu, inne parametry są niezmienialne, wzór produkowany w temperaturze denaturacji w 90 C jest podobny, ale nie identyczny co w 94 C. 28

29 Parametry amplifikacji Niska temperatura przyłączania startera DNA Przeważnie zakres stosowanych temperatur przyłączania wynosi od 25 C do 40 C ; Wraz ze wzrostem temperatury przyłączania w zakresie C następuje redukcja sygnału tła. Optymalna temperatura przyłączania starterów zależy od długości zastosowanego startera np. 10 nt 36 C; 18 nt i > C, przeważnie 40 C; rekomenduje się dłuższe startery, jeżeli będzie wytwarzana wystarczająca ilość produktów. 29

30 W niektórych reakcjach stosuje się dwie fazy: I. stosuje się 3 5 początkowych cykli, o relatywnie niskiej temperaturze przyłączania i często wydłużonym jego czasie, nawet C przez 5 minut; II. następnie stosuje się 30 cykli o wyższej temperaturze przyłączania, np C, trwającej 1 2 minuty Jednak tego typu reakcja nie zawsze jest konieczna, wystarczy zastosować niską temperaturę przyłączania, zwiększając tylko ilość cykli. 30

31 Z czego wynika polimorfizm RAPD Jest wynikiem mutacji w obrębie sekwencji komplementarnych do końca 3 startera oraz delecji lub insercji w pewnej odległości od miejsca wiązania startera Sekwencje repetytywne 31

32 Zastosowanie RAPD 1. Do analizy porównawczej izolatów RAPD dla szczepów Candida albicans Różnicowanie klinicznych szczepów wankomycyno opornych Enterococcus faecium metodą RAPD Dokumentacja KM PG 32

33 Analiza wzorów fingerprinting Interpretacja wzorów AP PCR, RAPD Jeżeli wzór AP PCR( RAPD) jest identyczny, bądź różnica dotyczy 3 i > prążków to interpretacja jest prosta, natomiast gdy różnica dotyczy 1 prążka, lub intensywność kilku prążków spada, konieczne staje się zmienienie warunków reakcji bądź sekwencji starterów. Tyler KD, Wang G, Tyler SD, Johnson WM. Factors affecting reliability and reproducibility of amplification based DNA fingerprinting i of representative ti bacterial pathogens. J Clin Microbiol 1997;35:

34 Kolekcja izolatów Izolacja DNA Amplifikacja PCR fragmentów genów Sekwencjonowanie (dideoxy) Kolekcja danych Określenie sekwencji nukleotydowej Nowe sekwencje alleli i weryfikacja ST Zgromadzenie danych sekwencji nukleotydowych Profile alleliczne i identyfikacja typu sekwencji (ST) Przydział ł ST do kompleksu k klonalnegol Analiza danych Badanie populacji Badania epidemiologiczne Analiza Sekwencji ML Diagram badawczy MLST Porównuje się profile alleliczne izolatów z centralną bazą danych 34

35 MLST Maiden M C J, Bygraves J A, Feil E, Morelli G, Russell J E, Urwin R, Zhang Q, Zhou J, Zurth K, Caugant D A, Feavers I M, Achtman M and Spratt B G (1998) Multilocus sequence typing: A portable approach to the identification of clones within populations of pathogenic microorganisms. Proc. Natl. Acad. SiUSA Sci. USA, 95: Urwin R, Maiden MC. (2003) Multi locus sequence typing: a tool for global epidemiology. Trends Microbiol. Oct;11(10): David M. Aanensen* and Brian G. Spratt (2005) The multilocus sequence typingnetwork: network: mlst.net netnucleicacidsresearch Research, Vol. 33, Maiden MC. Multilocus sequence typing of bacteria.annu Rev Microbiol. 2006;60:

36 Gatunki Metody referencyjne * Metody alternatywne Staphylococcus aureus typowanie fagowe, REA-PFGE AP-PCR, VNTR-PCR, PCR/RFLP, PPA, ADSRRS, PCR- MP Streptococcus pneumoniae REA-PFGE Serotypowanie Enterokoki REA-PFGE rybotypowanie, yp RAPD, ADSRRS, PCR-MP Escherichia coli # Citrobacter, Proteus, Providencia REA-PFGE AP-PCR, REP-PCR, ADSRRS, PCR-MP Klebsiella, Serratia REA-PFGE PPA, ADSRRS, PCR-MP Enterobacter REA-PFGE, rybotypowanie Pseudomonas aeruginosa REA-PFGE Rybotypowanie, ARDRA Acinetobacter REA-PFGE PCR/RFLP, REP-PCR, ADSRRS, PCR-MP Clostridium difficile AP-PCR REA, PFGE, PCR-MP Mycobacterium tuberculosis IS16110 RFLP, spoligotyping g REP-PCR, VNTR-PCR, Southern Blot Mycobacterium avium REA-PFGE rybotypowanie Borrelia burgdorferi sensu lato immunodiagnostyka, PFGE PPA, PCR/ RFLP, RAPD, VNTR- PCR, real-time PCR Objaśnienia: REA PFGE, ang. Analiza restrykcyjna chromosomalnego DNA połączona z elektroforezą pulsową; AP PCR, ang. Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction; PPA, ang. Plasmid Profile Analysis analiza profili plazmidowych (z lub bez analizy restrykcyjnej); REA, Restriction Endonuclease Analysis analiza restrykcyjna chromosomalnego DNA z użyciem konwencjonalnej elektroforezy; RFLP ang. Restriction Fragment Length Polimorphism ; RAPD, ang. Random Amplified Polymorphic DNA, VNTR, ang. Variable Number Tandem Repeat, AFLP, ang. Amplified Fragment Length Polymorphism; ADSRRS ang. Amplification of DNA Fragments Surrounding Rare Restriction Sites; PCR MP, ang. PCR Melting Profiles; real time PCR amplifikacja w czasie rzeczywistym; REP PCR, ang. Repetitive Element Polymerase Chain Reaction *Rekomendowane na podstawie danych publikowanych i stałych opini ekspertów # E.coli O157:H7 musi być identyfikowane przez serotypowanie Dla bakterii gram ujemnych, analiza profili całych plazmidów, bez trawienia restrykcyjnego Wiele szczepów Clostridium difficile jest nietypowalna metodą PFGE z powodu problemów z degradacją DNA 36

37 Konkluzja Należy pamiętać, ę że w miarę ę upływu czasu i rozprzestrzeniania się drobnoustrojów, różnice fenotypowe i genotypowe pomiędzy ę szczepami wzrastają. Powinniśmy uwzględnić pewną elastyczność w interpretacji danych eksperymentalnych: małe różnice nie zawsze oznaczają nowy typ genetyczny. Powinniśmy również uwzględnić błąd eksperymentalny (niedokładność), nawet w przypadku pracy z wysoce różnicującą techniką. 37