Autoreferat. Opis dorobku i osiągnięć naukowych. dr n. wet. Aleksandra Pawlak

Autoreferat Opis dorobku i osiągnięć naukowych dr n. wet. Aleksandra Pawlak Katedra Farmakologii i Toksykologii Wydział Medycyny Weterynaryjnej Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu ul. C.K. Norwida 31, 50-375 Wrocław 1

1. Imię i nazwisko Aleksandra Pawlak 2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe / artystyczne z podaniem nazwy, miejsca i roku ich uzyskania oraz tytułu rozprawy doktorskiej 2010 - lekarz weterynarii - tytuł zawodowy uzyskany na Wydziale Medycyny Weterynaryjnej Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu 2014 - doktor nauk weterynaryjnych w zakresie farmakologii weterynaryjnej. Wydział Medycyny Weterynaryjnej Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu. Tytuł rozprawy doktorskiej: Charakterystyka fenotypowa komórek chłoniaków i białaczek psów oraz ocena in vitro ich wrażliwości na leki cytostatyczne. Promotor: prof. dr hab. Bożena Obmińska- Mrukowicz. 3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych. 2010 2014 doktorantka w Zakładzie Farmakologii i Toksykologii, Katedry Biochemii, Farmakologii i Toksykologii, Wydziału Medycyny Weterynaryjnej, Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu od 02.02.2015 do chwili obecnej: adiunkt w Katedrze Farmakologii i Toksykologii, Wydziału Medycyny Weterynaryjnej, Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu 4. Wskazanie osiągnięcia wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. 2016 r. poz. 882 ze zm. w Dz. U. z 2016 r. poz. 1311.): 4.1 Tytuł osiągnięcia naukowego. Indukcja apoptozy w komórkach chłoniaka i białaczki psa - model do badań nad opracowywaniem nowych strategii terapeutycznych w onkologii weterynaryjnej 2

4.2 Lista publikacji stanowiących osiągnięcie naukowe. Rozprawę habilitacyjną stanowi monotematyczny cykl 5 prac oryginalnych. Łączny współczynnik wpływu (ang. impact factor) (w roku opublikowania) tych publikacji wynosi 11,928 a suma punktów MNiSW (zgodnie z wykazem czasopism MNiSW w roku publikacji) wynosi 155. 1) Pawlak A, Zioło E, Kutkowska J, Błażejczyk A, Wietrzyk J, Krupa A, Hildebrand W, Dzięgiel P, Dzimira S, Obmińska Mrukowicz B, Strządała L, Rapak A. A novel canine B-cell leukemia cell line. Establishment, characterization and sensitivity to chemotherapeutics. Veterinary and Comparative Oncology, 2017, 15(4):1218-1231 (IF: 2,270; MNiSW: 45) udział własny: koncepcja badań i plan pracy, opracowanie metodyki pozyskiwania komórek i przeprowadzenie hodowli komórkowej, analiza i interpretacja uzyskanych wyników, wiodąca rola w przygotowaniu manuskryptu oraz przygotowaniu pracy do druku 40%. Pozostali autorzy: EZ 5%, JK 5%, AB 5%, JW 5%, AK 5%, WH 5%, PD 5%, SD 5%, BOM 5%, LS 5%, AR 10%. 2) Pawlak A, Kutkowska J, Obmińska-Mrukowicz B, Rapak A. Methotrexate induces high level of apoptosis in canine lymphoma/leukemia cell lines. Research in Veterinary Science 2017, 114:518-523 (IF: 1,616; MNiSW: 35) udział własny: koncepcja badań i plan pracy, zaplanowanie i przeprowadzenie doświadczeń in vitro (oznaczenie cytotoksyczności i apoptozy na liniach komórkowych), analiza wyników, interpretacja wyników, wiodąca rola w przygotowaniu manuskryptu 60%. Pozostali autorzy: JK 20%, BOM 10%, AR 10%. 3) Pawlak A, De Miguel D, Kutkowska J, Obmińska-Mrukowicz B, Rapak A, Lostao LM. Flavopiridol strongly sensitizes canine lymphoma cells to TRAIL-induced apoptosis. Anticancer Research 2017, 37(12):6655-6665 (IF: 1,865; MNiSW: 20) 3

Udział własny: koncepcja badań i plan pracy, zaplanowanie i przeprowadzenie doświadczeń, analiza wyników, interpretacja wyników, wiodąca rola w przygotowaniu manuskryptu 80%. Pozostali autorzy: DDM 2,5%, JK 5%, BOM 2,5%, AR 5%, LML 5%. 4) Pawlak A, Gładkowski W, Mazur M, Henklewska M, Obmińska-Mrukowicz B, Rapak A. Optically active stereoisomers of 5-(1-iodoethyl)-4-(4'-isopropylphenyl)dihydrofuran-2-one: The effect of the configuration of stereocenters on apoptosis induction in canine cancer cell lines. Chemico-Biological Interactions 2017, 5;261:18-26 (IF: 3,296; MNiSW: 30, liczba cytowań: 1) Udział własny: koncepcja i plan badań, zaplanowanie i przeprowadzenie doświadczeń in vitro (oznaczenie cytotoksyczności i apoptozy na liniach komórkowych), analiza wyników, interpretacja wyników, wiodąca rola w przygotowaniu manuskryptu 80%. Pozostali autorzy: WG 5%, MM 2%, MH 8%, BOM 2,5%, AR 2,5%. 5) Pawlak A, Gładkowski W, Kutkowska J, Mazur M, Obmińska-Mrukowicz B, Rapak A. Enantiomeric trans β-aryl-δ-iodo-γ-lactones derived from 2,5-dimethylbenzaldehyde induce apoptosis in canine lymphoma cell lines by downregulation of anti-apoptotic Bcl-2 family members Bcl-xL and Bcl-2. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2018, 15;28(7):1171-1177 (IF: 2,881; MNiSW: 25) Udział własny: koncepcja i plan badań, zaplanowanie i przeprowadzenie doświadczeń in vitro (oznaczenie cytotoksyczności i apoptozy na liniach komórkowych), analiza wyników, interpretacja wyników, wiodąca rola w przygotowaniu manuskryptu 75%. Pozostali autorzy: WG 5%, JK 5%, MM 5%, BOM 5%, AR 5%. Onkologia weterynaryjna to stosunkowo młoda, ale bardzo dynamicznie rozwijająca się specjalność nauk weterynaryjnych, której postęp ściśle związany jest z częstością występowania i prawidłowego diagnozowania chorób nowotworowych u zwierząt. Pierwsze doniesienia na temat stosowania chemioterapii przeciwnowotworowej w weterynarii sięgają lat 70-tych XX wieku - tj. około 25 lat później niż pojawiła się onkologia w medycynie 4

człowieka (Klahn 2014). Dziś, obok chorób zakaźnych to właśnie nowotwory stanowią główną przyczynę śmierci psów, co nie tylko wskazuje na konieczność opracowania skutecznych terapii, ale także skłania do porównań pomiędzy biologią nowotworów psa i człowieka. Zjawiskiem występowania podobieństw pomiędzy chorobą nowotworową u zwierząt i ludzi jak i możliwością traktowania psa jako modelu do badań porównawczych w onkologii zainteresowałam się w trakcie studiów doktoranckich (Pawlak et al. 2013). Już wtedy moją uwagę zwróciły chłoniaki i białaczki - jedne z trzech najczęściej występujących typów nowotworów u psów (Marconato et al. 2013). Wysoce interesujące jest to, że chłoniaki nieziarnicze u psów (ang. canine non-hodgkin s lymphoma - cnhl) charakteryzują się znacznym podobieństwem do nieziarniczego chłoniaka występującego spontanicznie u ludzi. Podobieństwo stwierdza się w zakresie morfologii, genetycznego podłoża zmian, przebiegu choroby jak i odpowiedzi na leczenie (Breen and Modiano 2008). W swoich badaniach będących kontynuacją badań prowadzonych w trakcie studiów doktoranckich postanowiłam skupić się na możliwości zastosowania komórek nowotworowych chłoniaka i białaczki psa w opracowywaniu nowych strategii terapeutycznych - potencjalnie przydatnych zarówno w weterynarii jak i medycynie człowieka. W tym celu, wraz z zespołem podjęłam próbę uzyskania nowej, ustalonej linii komórkowej białaczki psa jak i badałam możliwość indukcji apoptozy w transformowanych nowotworowo limfocytach psa z zastosowaniem nowych związków, które nie są rutynowo stosowane w leczeniu. W badaniach mechanizmu apoptozy starałam się uchwycić podobieństwa jak i różnice w przebiegu tego procesu w komórkach człowieka i psa. Publikacja 1. Pawlak i wsp. (2017). A novel canine B-cell leukemia cell line. Establishment, characterization and sensitivity to chemotherapeutics. Veterinary and Comparative Oncology, 15(4):1218-1231 Do niedawna badania in vitro na ustalonych liniach chłoniaków i białaczek psa były ograniczone z powodu braku dostępności prawidłowo scharakteryzowanych linii komórkowych psa. Znacznie utrudniało to nie tylko badania biologii tych typów nowotworów, ale przede wszystkim uniemożliwiało ocenę in vitro skuteczności nowych związków, które potencjalnie mogłyby mieć zastosowanie w terapii nowotworów u psów. Do badań nad nowymi, specyficznymi czy celowanymi molekularnie terapiami konieczne jest 5

posiadanie panelu ustalonych linii komórkowych o różnym fenotypie. U podstaw braku takiego panelu dla psa leży, nie tyle brak szerszego zainteresowania tematem, ale trudność w uzyskaniu takich linii. Tym samym wyprowadzenie nowotworowej linii psa, zwłaszcza dla rzadkiego typu choroby stanowi spore wyzwanie. Jednym z celów badań własnych stało się właśnie otrzymanie nowej linii komórkowej chłoniaka/białaczki psa i jej dokładna charakterystyka. Przedstawiona publikacja jest nie tylko opisem przeprowadzonego badania naukowego, ale dokładną charakterystyką nowo uzyskanego narzędzia - linii komórkowej, przydatnej w różnych badaniach dotyczących przewlekłej białaczki limfocytarnej psa. Materiał, z którego później uzyskano linię komórkową pochodził od psa rasy Shih Tzu, pacjenta Katedry Chorób Wewnętrznych z Kliniką Koni, Psów i Kotów, Wydziału Medycyny Weterynaryjnej Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu, u którego zdiagnozowano przewlekłą białaczkę limfocytarną. Hodowli w warunkach in vitro poddano krew, szpik kostny jak i materiał z węzła chłonnego uzyskany drogą biopsji aspiracyjnej cienkoigłowej. Wykonano analizę cytometryczną każdego rodzaju otrzymanego materiału badawczego celem określenia immunofenotypu komórek. Badanie to wykazało obecność komórek ekspresjonujących antygeny CD45, CD79a i MHC klasy II zarówno na komórkach izolowanych z krwi, szpiku kostnego jak i węzła chłonnego. Dodatkowo, na limfocytach wyizolowanych z węzła chłonnego stwierdzono także ekspresję antygenu CD21 - prawdopodobnie wynikającą z powodu obecności prawidłowych, dojrzałych limfocytów B. Dzięki otrzymanym wynikom, zdiagnozowana u w/w pacjenta na podstawie obrazu klinicznego i badania histopatologicznego przewlekła białaczka, została opisana jako B- komórkowa. Wyizolowane limfocyty z krwi, szpiku kostnego i węzła chłonnego poddano hodowli, we wzbogaconym medium komórkowym (Advanced RPMI) zawierającym 2mM L-glutaminy, 1% penicyliny i streptomycyny oraz 20% płodowej surowicy bydlęcej. Hodowlę prowadzono w standardowych warunkach w butelkach hodowlanych o powierzchni 25 cm 2. Komórki uzyskane ze szpiku kostnego i krwi szybko obumarły - zaledwie po kilku dniach hodowli, podczas gdy komórki z węzła chłonnego wykazywały w tym czasie zadowalającą żywotność. Początkowo komórki rosnące w zawiesinie były pasażowane razem z komórkami rosnącymi na dnie naczynia, po około 2 tygodniach komórki limfoidalne zostały wyselekcjonowane i subklonowane celem otrzymania jednorodnej populacji. 5 10 5 komórek zawieszano w 5 ml medium i pasażowano co 4-5 dni do otrzymania liczby 2 3 10 6 komórek. Hodowlę linii 6

CLB70 prowadzono w ten sposób przez 6 miesięcy, po czym dokładnie scharakteryzowano. Otrzymaną linię tworzy jednorodna populacja drobnych, okrągłych i owalnych komórek z dużym kulistym jądrem i cienkim rąbkiem cytoplazmy. W hodowli komórki łączą się tworząc niewielkie agregaty. Immunofenotyp otrzymanej linii określono jako CD20, CD45, CD79a, MHC II, IgG i IgM pozytywny, słabo pozytywny dla CD21 oraz CD3, CD4, CD5, CD8, CD14, CD34 i CD117 negatywny. Tym samym stwierdzono, że linię komórkową tworzą dojrzale limfocyty B. Badaniem PCR potwierdzono obecność rearanżacji genów dla receptora BCR (B-cell receptor). W badaniu techniką western blot oceniono ekspresję wybranych białek biorących udział w procesie apoptozy. Stwierdzono, że komórki uzyskanej linii CLB70 wykazują silniejszą niż prawidłowe limfocyty psa ekspresję białek Bcl-2, Mcl-1, NF-kB i Ras oraz słabszą ekspresję białka BID i p53. Nie wykryto ekspresji białek RAR, COX2 ani PPAR gamma. Profil ekspresji wspomnianych białek jest podobny do tego, jaki stwierdzono w innych liniach komórkowych chłoniaka/białaczki psa. Wstępne badania chemiowrażliwości wykazały, że linia CLB70 charakteryzuje się wysoką wrażliwością na doksorubicynę (IC 50 0,042 ± 0,01 μg/ml 1 ), istotnie słabszą na etopozyd (IC 50 14,31 ± 2,83 μg/ml 1 ) i imatinib (IC 50 3,13 ± 0,78 μg/ml 1 ) a także opornością na działanie piroksykamu (IC 50 28,61 ± 4,78 μg/ml 1 ), celekoksybu (IC 50 37,73 ± 7,37 μg/ml 1 ) i deksametazonu (IC 50 >50 μg/ml 1). W ostatnim etapie badań mających na celu opis właściwości linii CLB70 przeprowadzono doświadczenie na myszach bezgrasiczych pozwalające ocenić zdolność linii do tworzenia guzów. Po wstrzyknięciu komórek immunoniekompetentnym myszom dochodziło u nich do tworzenia się guzów, co dowodzi tumorogenności linii CLB70. Podsumowując, linia CLB70 jest pierwszą opisaną i scharakteryzowaną linią komórkową wyprowadzoną od psa z przewlekłą białaczką limfocytarną typu B. Stanowi więc unikalne narzędzie do badań nad wspomnianym typem białaczki u psów, ale także wzbogaca dostępny do badań panel nowotworowych linii komórkowych psa. Dzięki swoim specyficznym właściwościom może okazać się przydatna w różnych typach badań. Dzięki oporności na deksametazon może być ważnym modelem w opracowywaniu nowych strategii terapeutycznych przy obserwowanej oporności nowotworowo zmienionych limfocytów na limfolityczne działanie glikokortykosteroidów. Dzięki ekspresji antygenu CD20 - doskonale nadaje się do badań z zastosowaniem przeciwciał monoklonalnch, które na wzór stosowanego w medycynie człowieka rituksimabu (przeciwciało anty-cd20) zostały opracowane także dla psa. Ponadto, nadekspresja antyapoptotycznych białek z rodziny Bcl-2 pozwala na 7

zastosowanie linii CLB70 w opracowywaniu nowych leków w terapii nowotworów charakteryzujących się "opornością" na indukcję procesu samobójczej śmierci komórki związaną z zaburzeniem wewntąrzpochodnej ścieżki apoptozy. Publikacja 2. Pawlak i wsp. (2017) Methotrexate induces high level of apoptosis in canine lymphoma/leukemia cell lines. Research in Veterinary Science, 114:518-523 Chemioterapię przeciwnowotworową u zwierząt towarzyszących wprowadzono bazując na doświadczeniach z medycyny człowieka. W praktyce klinicznej jest stosowanych wiele leków cytostatycznych, które podawane są na wzór wskazań do stosowania w medycynie człowieka pomimo, iż nie przeprowadzono dla tych leków dokładnych badań in vitro odnośnie skuteczności i mechanizmu działania na zmienione nowotworowo komórki docelowego gatunku zwierząt. Dlatego, wraz z dostępnością coraz większej liczby narzędzi do badań laboratoryjnych, takich jak linie komórkowe, czynniki wzrostu komórek, swoiste przeciwciała - możliwe staje się badanie in vitro odpowiedzi komórek danego gatunku na często stosowane w terapii leki. Dzięki takim badaniom możliwe jest wyjaśnienie obserwowanego efektu działania oraz, na jego podstawie, zaproponowanie bardziej efektywnego modelu terapii. Jednym z takich leków jest metotreksat (MTX) - lek cytostatyczny z grupy antymetabolitów stosowany w onkologii weterynaryjnej w leczeniu chłoniaka, kostniakomięsaka czy guzów gruczołu mlekowego u psów (Gauthier et al. 2005, Morrison 2010, Maiti et al. 2011). Celem prezentowanej pracy była ocena proapoptotycznego działania metotreksatu na komórki chłoniaka/białaczki psa oraz porównanie jego mechanizmu działania z tym, obserwowanym w transformowanych nowotworowo limfocytach człowieka. W badaniu wykorzystano trzy linie komórkowe psa: CLBL-1 (chłoniak B- komórkowy), GL-1 (białaczka T-komórkowa) i CL-1 (chłoniak T-komórkowy) oraz trzy linie komórkowe człowieka: Jurkat (białaczka T-komórkowa), Raji (chłoniak B-komórkowy) i Hut78 (chłoniak T-komórkowy). Do oceny działania MTX zastosowano test MTT badający aktywność metaboliczną komórek, barwienie aneksyną V do oceny wczesnych etapów apoptozy oraz technikę western blot do analizy poziomu ekspresji białek biorących udział w samobójczej śmierci komórek. 8

Pomimo, że zaplanowane badanie wydawało się proste i wtórne wobec faktu stosowania już tego leku w terapii, otrzymano interesujące wyniki. W badaniach wykazano, że MTX bardzo silnie hamuje aktywność metaboliczną i indukuje apoptozę komórek chłoniaka/białaczki psa. Działanie to wyraźnie przewyższa siłę, z jaką lek działa na badane komórki nowotworowe człowieka (IC 50 wobec linii komórkowych psa było około 10 razy niższe). Interesujące, że obserwowany efekt był szczególnie silny w odniesieniu do komórek białaczki T-komórkowej (IC 50 dla poszczególnych linii wynosiło: 0,018 µm dla CL-1, 0,022 µm dla GL-1 i 0,033 µm dla CLBL-1). Jest to o tyle zaskakujące, że linia CL-1 we wcześniejszych badaniach oceniających wrażliwość komórek na działanie różnych typów leków cytostatycznych charakteryzowała się znaczną opornością, a linia CLBL-1 na podstawie tych samych badań uznana została za szczególnie wrażliwą (Pawlak et al. 2014). Obserwowana oporność komórek typu T, w porównaniu do komórek B, na działanie większości leków cytostatycznych jest znanym zjawiskiem i ma swoje odzwierciedlenie w obserwacjach klinicznych. Chłoniaki T-komórkowe uważa się bowiem za gorzej rokujące i trudniej poddające się terapii niż chłoniaki typu B (Ito et al. 2014). Różnica w sile proapoptotycznego działania na komórki T i B uwidaczniała się także w szybkości działania leku, obserwowana jak odsetek komórek w danym stadium apoptozy. Po inkubacji komórek badanych linii z takimi samymi stężeniami MTX, po 24 godzinach obserwowano oznaki późnej apoptozy w liniach wywodzących się z komórek T, podczas gdy komórki B pozostawały żywe lub znajdowały się we wczesnym stadium apoptozy. Podczas gdy odsetek komórek linii CLBL-1 będących w apoptozie po 24 godzinach inkubacji z 0,1 μm MTX wynosił 42,34 ± 4,8%, linii CL-1 aż 65,72 ± 6,5% - to komórki ludzkich linii pozostawały żywotne (odpowiednio 11,2 ± 1,3% i 28,8 ± 2,40% apoptotycznych komórek linii Jurkat i HUT-78). Badanie techniką western blot wykazało, że MTX wykazywał działanie proapoptotyczne poprzez obniżenie poziomu ekspresji białek Bcl-2 i NF-kB, zarówno w przypadku linii B- jak i T-komórkowej. Obecność aktywnej formy kaspazy 3 i fragmentacji białka PARP stwierdzano w obu liniach już po 24 godzinach inkubacji. Poziom ekspresji w komórce białek Bcl-xL i Mcl-1 nie ulegał natomiast zmianie. Uważa się, że nadekspresja białka Bcl-2 może być konsekwencją nadmiernej aktywacji jądrowego czynnika transkrypcyjnego NF-kB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) (Turco et al. 2004). Tym samym, MTX obniżając ekspresję NF-kB i Bcl-2 powodował 9

obserwowaną aktywację kaspazy 3. Fakt obniżania ekspresji NF-kB przez MTX może mieć szerokie zastosowanie w terapii chłoniaków i białaczek u psów. Uważa się, że w związku z ciągłą aktywacją NF-kB linie GL-1 i CL-1 wykazują oporność na działanie glikokortykosteroidów (Pawlak et al. 2014), co wykazano przywracając wrażliwość wspomnianych linii na tę grupę leków po zahamowaniu aktywności tego czynnika transkrypcyjnego (Matsuda et al. 2010). Oporność na działanie glikokortykosteroidów jest częstą przyczyną niepowodzeń w terapii chłoniaków/białaczek u psów, zwłaszcza w sytuacji, gdy glikokortkosteroidy były stosowane przed rozpoczęciem właściwej chemioterapii przeciwnowotworowej (Price et al. 1991). Wyniki badań własnych wskazują, że MTX może być skuteczny w sytuacjach, w których protokoły lecznicze zawierające glikokortykosteroidy zawodzą. Podsumowując, w prezentowanej pracy wykazaliśmy, że MTX wykazuje silniejsze działanie przeciwnowotworowe in vitro w stosunku do komórek chłoniaka/białaczki psa niż człowieka. Wskazuje to na potencjalną możliwość zastosowania niższej dawki leku w leczeniu psów niż jest stosowana w medycynie człowieka. Jednocześnie wykazaliśmy silniejszą aktywność MTX w odniesieniu do linii T-komórkowych, czyli komórek charakteryzujących się wyższą opornością na większość, standardowo stosowanych leków w terapii nowotworów rozsianych układu białokrwinkowego. Pozwoliło to na wysunięcie hipotezy, o możliwych korzyściach z zastosowania MTX w pierwszej linii leczenia niektórych typów chłoniaków/białaczek T-komórkowych, zwłaszcza tych opornych na standardową chemioterapię. Jak dotąd MTX stosowany był głównie w kolejnych liniach leczenia, przy nawrocie choroby czy w leczeniu paliatywnym. Szczególnie obiecującym kierunkiem, bazując na otrzymanych wynikach badań własnych, wydaje się zastosowanie terapii kombinowanej obejmującej łączne podawanie MTX i blokerów białka Bcl-2. Publikacja 3. Pawlak i wsp. (2017). Flavopiridol strongly sensitizes canine lymphoma cells to TRAIL-induced Apoptosis. Anticancer Research, 37(12):6655-6665 Indukcja apoptozy w komórkach ssaków może się odbywać dwoma drogami - wewnątrzpochodną (mitochondrialną) i zewnątrzpochodną, związaną z pobudzeniem tzw. receptorów śmierci. Aktywacja każdego z tych szlaków może być celem terapii przeciwnowotworowej. Większość leków przeciwnowotworowych aktywuje 10

wewnątrzpochodny szlak apoptozy, w medycynie człowieka jednak, obiecującą strategią terapeutyczną jest także aktywacja szlaku zewnątrzpochodnego - poprzez zastosowanie swoistych ligandów czy przeciwciał pobudzających receptory śmierci. Jedną z takich możliwości jest zastosowanie białka TRAIL/Apo2L w leczeniu nowotworów u ludzi. TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand) to białko z rodziny TNF, fizjologicznie ekspresjonowane przez komórki układu immunologicznego, zdolne do indukcji apoptozy różnych typów komórek nowotworowych. Aktywacja szlaku związanego z pobudzeniem receptorów dla wspomnianego białka - w medycynie człowieka jest na etapie badań klinicznych. W badaniach obejmujących ocenę przydatności psich komórek nowotworowych jako modelu do badań nad opracowywaniem nowych strategii terapeutycznych - analiza możliwości indukcji apoptozy przez zewnątrzpochodny szlak wydaje się być bardzo istotnym elementem. Celem prezentowanej pracy było więc sprawdzenie możliwości zastosowania TRAIL w indukcji apoptozy komórek chłoniaka psa, jak i zbadanie mechanizmu jego działania na komórki tego gatunku. Istnieją pojedyncze doniesienia na temat zastosowania in vitro ludzkiego TRAIL w hodowlach psich komórek nowotworowych (Elders et al. 2009, Spee et al. 2006, Elders et al. 2014), ale nie dotyczą one komórek chłoniaka i, co zaskakujące, pomimo obiecujących wyników nie były kontynuowane. Tym bardziej skłoniło nas to do analizy przydatności nowotworowo transformowanych komórek psa i ligandu TRAIL jako modelu do badań nad indukcją zewnątrzpochodnego szlaku apoptozy. W prezentowanym badaniu zastosowano linię komórkową chłoniaka B-komórkowego psa (CLBL-1) oraz ludzki rekombinowany ligand TRAIL. Bazując na danych literaturowych dowodzących znacznej homologii pomiędzy ludzkim i psim ligandem (81,3% homologicznych sekwencji) (Rong et al. 2008) i wrażliwości psich komórek na jego działanie (Elders et al. 2009, Spee et al. 2006) szacowaliśmy, że stężenie około 250 ng/ml powinno wykazywać działanie proapaptotyczne na komórki chłoniaka psa. Wbrew założeniom okazało się, że linia B-komórkowego chłoniaka psa jest oporna na działanie TRAIL nawet przy zastosowaniu wysokich stężeń związku, aż do 3000 ng/ml. Dodatkowo, wspomnianą oporność obserwowano także dla innych linii komórkowych chłoniaków i białaczek psa (badania własne nieopublikowane). Ze względu na brak odpowiednich narzędzi (przeciwciał wykrywających receptory dla TRAIL w komórkach psa) pozwalających zweryfikować hipotezę o możliwości działania ludzkiego TRAIL na komórki psa zdecydowano się podjąć próbę uwrażliwienia komórek na działanie ligandu poprzez zastosowanie związku, który 11

wykazuje z nim działanie synergiczne. Jednym z takich związków jest flawopirydol - flawonoid, inhibitor kinaz zależnych od cyklu. Schemat badania obejmował ocenę proapoptotycznego działania ligandu TRAIL, flawopirydolu jak i kombinacji wymienionych związków (komórki preinkubowano 6 godz. z flawopirydolem przed dodaniem TRAIL). W badaniu oceniano żywotność komórek (barwienie jodkiem propidyny), wczesne etapy apoptozy (barwienie aneksyną V), aktywację kaspazy 3/7 oraz analizowano mechanizm proapoptotycznego działania poprzez analizę zmian w poziomie ekspresji białek biorących udział w procesie apoptozy. Wyniki przeprowadzonego badania wskazują na możliwość uwrażliwienia komórek chłoniaka psa poprzez zastosowanie flawopirydolu. Także sam flawopirydol wykazywał znaczące działanie cytotoksyczne w stosunku do nowotworowych limfocytów psa - stężenie 200 nm leku zabijało około 70% komórek. Nie mniej, kombinacja TRAIL (250 ng/ml) ze stężeniami 100 i 200 nm flawopirydolu zabijała większy odsetek komórek wskazując, że TRAIL może wykazywać działanie toksyczne na komórki chłoniaka psa, ale jego cytotoksyczne działanie jest w jakiś sposób blokowane. W kolejnym etapie badań wykazano, że kombinacja 250 ng/ml TRAIL z 100 nm flawopirydolu indukuje apoptozę, a jej poziom jest wyższy niż dla pojedynczo zastosowanych związków (różnica istotna statystycznie). Równocześnie, preinkubacja komórek z inhibitorem białek z rodziny kaspaz (Z-VAD-fmk) powodowa redukcję odsetka komórek w apoptozie do poziomu porównywalnego z kontrolą (17,45 ± 4,13%). Podobnie preinkubacja komórek z blokującym przeciwciałem przeciwko TRAIL (klon RIK2) hamowała obserwowany synergiczny efekt zastosowanej kombinacji, redukując poziom apoptozy do tego, jaki stwierdzono po zastosowaniu samego flawopirydolu. Dowodzi to, że dla indukcji wspomnianego poziomu apoptozy komórek konieczne jest działanie ligandu TRAIL. W kolejnym etapie badań wykazano, że obserwowana apoptoza komórek jest wynikiem aktywacji efektorowych kaspaz 3/7 (64,60 ± 1,41% komórek pozytywnych), co doskonale korelowało z wynikiem barwienia komórek aneksyną. Podobnie i w tym badaniu, zarówno preinkubacja z inhibitorem kaspaz jak i przeciwciałem przeciwko TRAIL redukowała obserwowany odsetek komórek w stadium apoptozy. Badanie zmian w poziomie ekspresji poszczególnych białek biorących udział w procesie apoptozy pozwoliło na analizę mechanizmu działania, w jaki flawopirydol uwrażliwia komórki chłoniaka psa na działanie TRAIL. Zaobserwowano, że kombinacja 12

flawopirydolu z TRAIL powodowała masywną redukcję poziomu białka cflip (FLICE FAAD-like inerleukin-1beta-converting enzyme inhibitory protein), co korelowało z kolei z silniejszą aktywacją kaspazy 8 i silniejszą fragmentacją białka Bid. Równocześnie, aktywowana była mitochondrialna ścieżka apoptozy, co obserwowano poprzez wzrost ekspresji aktywnej formy kaspazy 9. Również wyraźniejsza fragmentacja białka PARP, głównego substratu kaspazy 3 dowodzi, że zastosowana kombinacja silniej aktywuje apoptozę w komórkach chłoniaka psa niż TRAIL czy flawopirydol zastosowane pojedynczo. Otrzymane wyniki pozwoliły nam na zaproponowanie modelu wyjaśniającego mechanizm działania zastosowanej kombinacji na komórki linii CLBL-1. W warunkach fizjologicznych aktywacja kaspazy 8 po zadziałaniu ligandu TRAIL jest blokowana przez białko cflip. Zahamowanie procesu transkrypcji powodowane przez flawopirydol powoduje obniżenie poziomu białka cflip w komórce, co z kolei umożliwia aktywację kaspazy 8. Kaspaza 8, z jednej strony, aktywuje kaspazę 3, z drugiej strony, powoduje fragmentację proapoptotycznego białka Bid, które aktywuje mitochondrialną ścieżkę apoptozy i jej efektor - kaspazę 9. Równoczesna aktywacja kaspazy 3 przez kaspazę 8 i 9 prowadzi do apoptozy komórek. Podsumowując, w prezentowanej pracy wykazano, że pomimo początkowo obserwowanej oporności komórek psa na działanie TRAIL - możliwe jest ich uwrażliwienie na proapoptotyczne działanie tego ligandu. W przeprowadzonych badaniach własnych wykazano mechanizm opisanej oporności i wskazano na możliwość zastosowania TRAIL jako leku przeciwnowotworowego u psów. Jednakże sposób, w jaki TRAIL działa na komórki psa, receptory jakie pobudza - wciąż wymaga wyjaśnień. Prezentowana praca stanowi więc przyczynek do dalszych badań nad zastosowaniem linii komórkowych psa w indukcji wewnątrzpochodnej ścieżki apoptozy. Publikacja 4. Pawlak i wsp. (2017). Optically active stereoisomers of 5-(1-iodoethyl)-4-(4'- isopropylphenyl)dihydrofuran-2-one: The effect of the configuration of stereocenters on apoptosis induction in canine cancer cell lines. Chemico-Biological Interactions, 5;261:18-26 Kolejne dwie prace (4 i 5) dokumentują możliwość zastosowania komórek nowotworowych psa w badaniach nad nowymi związkami o potencjalnym działaniu przeciwnowotworowym i są efektem współpracy z pracownikami Katedry Chemii Wydziału 13

Biotechnologii i Nauk o Żywności Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu. We wcześniejszych badaniach własnych wykazano aktywność przeciwnowotworową serii otrzymanych po raz pierwszy związków - δ-jodo-γ-laktonów zawierających w pozycji β fragment aromatyczny (Gładkowski et al. 2016) w stosunku do komórek chłoniaka i białaczki psa. Zachęceni obiecującymi wynikami postanowiliśmy wykonać dokładniejsze badania przeciwnowotworowej aktywności wybranych, czystych optycznie jodolaktonów poprzez analizę ich zdolności do indukcji procesu apoptozy w różnych, nowotworowych liniach komórkowych psa. Przeprowadzenie badań dla czterech otrzymanych stereoizomerów o określonych konfiguracjach centrów chiralności umożliwiło także analizę wpływu budowy przestrzennej związku na obserwowany efekt cytotoksyczny. Przedmiotem badań były cztery stereoizomery 5-(1-jodoetylo)-4-(4'- izopropylofenylo)dihydrofuran-2-onu: izomer cis-(4r,5r,6s) (1) (ee=99%) oraz jego enancjomer (4S,5S,6R) (2) (ee>99%), a także izomer trans-(4r,5s,6r) (3) (ee=99%) oraz jego enancjomer (4S,5R,6S) (4) (ee > 99%), otrzymane z (E)-4-(4'-izopropylofenylo)but-3-en-2- olu w czteroetapowej syntezie chemoenzymatycznej. W badaniu wykorzystano 7 nowotworowych linii komórkowych psa, reprezentujących nowotwory hematopoetyczne (chłoniaki: CLBL-1, CL-1 i białaczki: GL-1, CLB70) oraz guzy gruczołu sutkowego (CMT- U309, CMT-U27 i P114). Po inkubacji komórek z testowanymi stereoizomerami oceniano żywotność komórek (barwienie jodkiem propidyny), aktywność metaboliczną (test MTT), apoptozę (barwienie aneksyną V i test aktywacji kaspaz 3/7) oraz analizowano zmiany w przebiegu cyklu komórkowego (cytometryczna analiza odsetka komórek w danej fazie cyklu komórkowego z zastosowaniem barwienia utrwalonych komórek jodkiem propidyny). Wyniki badań potwierdziły wcześniejsze obserwacje o przeciwnowotworowym działaniu testowanych jodolaktonów w stosunku do linii komórek nowotworowych psa. Obserwowane działanie było silniejsze w stosunku do linii chłoniaków i białaczek psa niż linii guza gruczołu sutkowego. Wyjątkiem była jednak linia chłoniaka T-komórkowego (CL- 1), która charakteryzowała sie znaczną opornością i jej wrażliwość była porównywalna do tej, jaką wykazywały linie guza gruczołu sutkowego. IC 50 dla wszystkich związków, w przypadku linii CL-1, wahało się w granicach 60-70 µg/ml podczas gdy do zabicia 50% komórek pozostałych linii chłoniaków i białaczek psa wystarczyły stężenia w granicach 10-15 µg/ml. Wartości IC 50 w przypadku linii guza gruczołu sutkowego wynosiły od około 35 do 73 µg/ml. Otrzymane wyniki doskonale korelują z innymi badaniami pokazującymi znaczną oporność 14

linii CL-1 na większość testowanych związków przeciwnowotworowych (Pawlak et al. 2014) jak i faktem wysokiej wrażliwości komórek układu hematopoetycznego na chemioterapię. Badanie wykazało, że obserwowany efekt cytotoksyczny jaki wywierają testowane jodolaktony jest związany z indukcją apoptozy. Pod wpływem badanych związków w komórkach wszystkich linii (choć w różnym stopniu, w zależności od wrażliwości komórek) dochodziło do eksternalizacji fosfatydyloseryny i aktywacji kaspazy 3/7. Wskazuje to na aktywację przez testowane jodolaktony klasycznej, kaspazo-zależnej ścieżki apoptozy. Również analiza zmian w przebiegu cyklu komórkowego wykazała, że badane jodolaktony mają silniejsze działanie proapoptotyczne niż cytostatyczne, ponieważ nie powodują typowego dla cytostatyków bloku komórek w fazie G2/M cyklu komórkowego. Podobnych wniosków dostarczyły też wyniki innych badaczy, którzy stwierdzili działanie proapoptotyczne różnych związków posiadających w swej cząsteczce pierścień laktonowy (Albrecht et al. 2010, Janecki et al. 2005, Wzorek et al. 2013). Najciekawszych wniosków dostarczyła jednak analiza zależności pomiędzy strukturą przestrzenną testowanych związków a ich aktywnością przeciwnowotworową. Analiza różnic w sile działania pomiędzy poszczególnymi parami enancjomerów wykazała, że w stosunku do linii guzów gruczołu sutkowego wyraźnie aktywniejszy był izomer (4S,5S,6R)-2 w porównaniu z jego enancjomerem (4R,5R,6S)-1 (IC 50 39,07 ± 5,4 µg/ml vs. 69,98 ± 1,8 µg/ml dla CMT-U27, 35,64 ± 1,6 µg/ml vs. 73,93 ± 0,8 µg/ml dla CMT-U309 i 38,08 ± 3,2 µg/ml vs. 73,07 ± 5,4 µg/ml dla P-114). Podobnie było w odniesieniu do wszystkich linii chłoniaków czy białaczek psa, ale obserwowana różnica nie była istotna statystycznie. W przypadku stereoizomerów trans silniejszą aktywnością charakteryzował sie izomer (4S,5R,6S)-4 z wartościami IC 50 : 67,95 ± 3,0 µg/ml dla CL-1, 10,25 ± 2,4 µg/ml dla CLBL-1, 13,77 ± 4,7 µg/ml dla CLB70, 8,98 ± 1,9 µg/ml dla GL-1, 70,62 ± 0,5 µg/ml dla CMT-U27, 41,80 ± 4,2 µg/ml dla CMT-U309 i 53,84 ± 3,3 µg/ml dla P114 podczas gdy IC 50 dla enancjomerycznego laktonu (4R,5S,6R)-3 wynosiło odpowiednio: 73,36 ± 2,5, 15,95 ± 3,5, 17,25 ± 1,8, 13,36 ± 5,7, 58,91 ± 1,6, 52,84 ± 4,4 i 64,12 ± 3,1 µg/ml. Generalnie, związkami o większej aktywności okazały się stereoizomery o konfiguracji S przy atomie C-4 pierścienia laktonowego (związki 2 i 4). Różnica była szczególnie widoczna w odniesieniu do linii guzów gruczołu sutkowego CMT-U309 i P114. Spośród wszystkich testowanych enancjomerów związkiem o najsilniejszej aktywności przeciwnowotworowej okazał się enancjomer cis-(4s,5s,6r)-2. 15

Podsumowując, w prezentowanej pracy wykazano przeciwnowotworowe działanie czterech nowych δ-jodo-γ-laktonów z podstawnikiem p-izopropylofenylowym na modelu chłoniaka, białaczki i guza gruczołu sutkowego psa, dokumentując jednocześnie przydatność ustalonych linii komórek nowotworowych psa w tego typu badaniach. W badaniach udokumentowano, zdolność związków posiadających w swej cząsteczce pierścień laktonowy do indukcji apoptozy komórek nowotworowych psa na drodze mitochondrialnej, kaspazozależnej ścieżki apoptozy oraz zaobserwowano różnice w sile przeciwnowotworowego działania w zależności od konformacji optycznej badanych związków. Publikacja 5. Pawlak i wsp. (2018). Enantiomeric trans β-aryl-δ-iodo-γ-lactones derived from 2,5-dimethylbenzaldehyde induce apoptosis in canine lymphoma cell lines by downregulation of anti-apoptotic Bcl-2 family members Bcl-xL and Bcl-2. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 15;28(7):1171-1177 Prezentowana praca jest efektem dalszych badań nad zastosowaniem ustalonych linii komórek nowotworowych psa w badaniach aktywności przeciwnowotworowej nowych związków - jodolaktonów z pierścieniem aromatycznym. Tym razem skupiono się na wychwyceniu różnic w działaniu pomiędzy enancjomerami trans-δ-iodo-γ-laktonu z pierścieniem 2,5-dimetylofenylowym oraz dodatkowo oznaczenia wykonano także dla ludzkiej linii komórkowej. W przeprowadzonym badaniu zastosowano linie chłoniaka i białaczki psa: CLBL-1, GL-1 i CLB70, które we wcześniejszych badaniach okazały się wrażliwe na cytotoksyczne działanie testowanych jodolaktonów. Ponadto, dla porównania w badaniu wykorzystano także ludzką linię Jurkat (ostra białaczka limfoblastyczna). Przedmiotem badań były enancjomeryczne trans-5-(1-jodoetylo)-4-(2,5 -dimetylofenylo)dihydrofuran-2-ony o konfiguracjach: (4R,5S,6R) (1) (ee=99%) (4S,5R,6S) (2) (ee=98%) i potwierdzonej aktywności cytotoksycznej w stosunku do komórek chłoniaków i białaczek psa. W badaniu oznaczono żywotność komórek (barwienie jodkiem propidyny), zdolność do indukcji apoptozy (barwienie aneksyną V i test aktywacji kaspazy 3/7) oraz zbadano zmiany w poziomie ekspresji najważniejszych białek biorących udział w procesie apoptozy. W pierwszym etapie badań oceniono wpływ badanych enancjomerów na żywotność komórek zaledwie po 24 godzinach inkubacji. Już tak krótki czas ekspozycji komórek na 16

badane związki powodował znaczną śmiertelność w komórkach wszystkich linii. Oba izomery z podobną siłą działały tylko na komórki linii CLBL-1 (około 80% martwych komórek po inkubacji ze stężeniem 50 µg/ml). W pozostałych liniach, silniej śmierć indukował enancjomer (4R,5S,6R)-1, w stężeniu 50 µg/ml powodując śmierć około 60% komórek, podczas gdy enancjomer (4S,5R,6S)-2 zabijał zaledwie około 25%. Różnica w sile działania pomiędzy badanymi izomerami była istotnie statystyczna dla wszystkich linii z wyjątkiem linii CLBL-1. Badania odsetka komórek we wczesnym stadium apoptozy potwierdziły wcześniejsze obserwacje. Enancjomer (4R,5S,6R)-1 wywoływał znacznie silniejszy efekt niż jego lustrzane odbicie w stosunku do wszystkich linii komórkowych poza linią CLBL-1, w której podobny poziom apoptozy wywoływały obydwa enancjomery. Konsekwentnie, enancjomer (4R,5S,6R)-1 powodował silniejszą aktywację kaspazy 3/7. Odsetek komórek z aktywną formą kaspazy 3/7 po inkubacji ze stężeniem związku 50 µg/ml dla większości linii był wyższy w przypadku enancjomeru (4R,5S,6R)-1 niż enancjomeru (4S,5R,6S)-2 (55,8 ± 0,1 vs. 30,04 ± 8,5% dla linii CLB70, 58,47 ± 2,1% vs. 20,35 ± 1,8% dla linii GL-1 i 66,93 ± 11,1% vs. 32,35 ± 3,1% dla linii Jurkat). W przypadku linii CLBL-1 wartości te były zbliżone dla obydwu enancjomerów: 78,89 ± 3,77% vs. 73,53 ± 2,04%. Śmierć na drodze kaspazo-zależnej apoptozy potwierdziło także badanie z zastosowaniem inhibitora białek z rodziny kaspaz - Z-VAD-fmk. Wcześniejsza inkubacja komórek z tym inhibitorem uniemożliwiała inicjację procesu apoptozy ograniczając odsetek apoptotycznych komórek do tego obserwowanego w komórkach kontroli - nie traktowanych badanymi związkami. Oznacza to, że niezależnie od różnic w budowie przestrzennej obydwa enancjomery wymagają aktywacji kaspaz do wywołania apoptozy komórek. Badania techniką Western blot pozwoliły na wyjaśnienie mechanizmu obserwowanego proapototycznego działania obu enancjomerów. Pomimo istotnych różnic w sile obserwowanego działania - mechanizm wydaje się być taki sam, niezależnie od konfiguracji przestrzennej badanych laktonów. Zaobserwowano jednak różnice w aktywacji poszczególnych białek biorących udział w procesie apoptozy pomiędzy komórkami linii psa a linią człowieka Jurkat. Najważniejszą obserwacją było wyraźne obniżenie ekspresji antyapoptotycznych białek Bcl-2 i Bcl-xL po inkubacji z każdym z enancjomerów. Jednakże, enancjomer (4S,5R,6S)-2 wywoływał ten efekt w mniejszym stopniu niż jego lustrzane odbicie w komórkach wszystkich linii z wyjątkiem linii CLBL-1, która charakteryzowała się podobną wrażliwością na działanie obydwu enancjomerów. Szczególnie interesujący okazał 17

się wpływ badanych enancjomerów na poziom ekspresji proapoptotycznego białka z rodziny Bcl-2 - białka Bid. Silna fragmentacja tego białka była efektem działania enancjomeru (4R,5S,6R)-1 na linie GL-1 i CLB70 oraz obydwu enancjomerów na linię CLBL-1. Podobnego efektu nie zaobserwowano w komórkach ludzkiej linii Jurkat - pomimo, iż w komórkach tych poziom apoptozy stwierdzony za pomocą wcześniej omówionych testów był podobny do tego w komórkach psich białaczek. Również wyraźna fragmentacja białka PARP - substratu kaspazy 3 potwierdzała silną aktywację apoptozy w komórkach tej linii. Na podstawie otrzymanych wyników stwierdzono, że badane enancjomery powodują apoptozę wrażliwych komórek poprzez obniżenie poziomu ekspresji dwóch ważnych białek anty-apoptotycznych: Bcl-2 i Bcl-xL. Biorąc pod uwagę fakt, że tylko podwyższona ekspresja białka Bcl-2 jest charakterystyczną cechą wszystkich trzech zastosowanych w badaniu linii komórkowych psa (w linii GL-1 nie stwierdza się podwyższonej ekspresji białka Bcl-xL) - to właśnie obniżenie ekspresji białka Bcl-2 wydaje się mieć największe znaczenie. Jest to szczególnie istotne, ponieważ nadekspresja tego białka jest wiązana z obserwowaną klinicznie opornością niektórych chłoniaków i białaczek psa na stosowaną chemioterapię (Pawlak et al. 2016a, Ola et al. 2011, Meichner et al. 2016). Druga ważna obserwacja dotyczyła zdolności obydwu enancjomerów do fragmentacji białka Bid. Podstawowy poziom ekspresji tego białka także jest inny w zależności od linii komórkowej (w komórkach linii CLB70 nie obserwuje się nadekspresji Bid). Ponadto, fragmentacji Bid nie stwierdzono w komórkach ludzkiej linii Jurkat, pomimo iż badane enancjomery powodują apoptozę tych komórek. Oznacza to, że w zastosowanych w badaniu liniach nowotworowych psa testowane enancjomery angażują także receptorową (zewnątrzpochodną) ścieżkę apoptozy poprzez wywoływanie fragmentacji białka Bid, co dodatkowo wzmacnia proapoptotyczne działanie tych związków. Jednakże wspomniane wzmocnienie proapoptotycznego sygnału nie jest niezbędne do indukcji apoptozy, czego przykładem jest apoptoza komórek linii Jurkat. Bazując na obserwowanym efekcie działania podjęta została także próba wyjaśnienia, w jaki sposób badane enancjomery mogą działać na komórki nowotworowe. Przeciwnowotworowe działanie różnych związków z grupy laktonów jest wiązane z ich zdolnością do alkilowania białek. Ten mechanizm został najlepiej poznany dla α-metyleno-γlaktonów, które reagują z grupą tiolową cysteiny w reakcji addycji Michaela (Konaklieva and Plotkin 2005). W przypadku badanych laktonów można przypuszczać, że alkilowanie białka jest wynikiem substytucji nukleofilowej S N 2. W toku tej reakcji nukleofil, jakim jest powstały 18

z cysteiny anion tiolowy (RS ) przyłącza się do atomu węgla z jednoczesnym odszczepieniem jodu, który opuszcza cząsteczkę w postaci anionu. Podobny mechanizm alkilowania reaktywnych grup tiolowych zaobserwowano podczas oznaczania białek zawierających reszty cysteiny. Na istotną rolę, jaką odgrywa atom jodu w mechanizmie działania związków przeciwnowotworowych może wskazywać indukcja apoptozy w wielu liniach komórek nowotworowych o różnym pochodzeniu przez 6-iodo-δ-lakton powstały z kwasu arachidonowego (Rosner et al. 2010, Thomasz et al. 2013, Nava-Villalba and Aceves 2014). Podsumowanie: Przedstawione powyżej badania pozwoliły na sformułowanie następujących ogólnych wniosków dotyczących zastosowania ustalonych linii komórkowych chłoniaka i białaczki psa w badaniach zdolności różnych związków przeciwnowotworowych do indukcji apoptozy: linia CLB70 jako pierwsza ustalona linia komórkowa przewlekłej B-komórkowej białaczki psa może być cennym narzędziem do badania biologii i opracowywania nowych terapii w tym typie nowotworu stosowane w prezentowanym badaniu ustalone linie komórkowe chłoniaka (CLBL-1, CL-1) i białaczki (GL-1, CLB70) psa doskonale nadają się do badań apoptozy powodowanej przez nowe jak i standardowo stosowane związki o działaniu przeciwnowotworowym stosowane w prezentowanym badaniu ustalone linie komórkowe chłoniaka (CLBL-1, CL-1) i białaczki (GL-1, CLB70) psa mogą służyć jako narzędzie do badania wpływu i mechanizmu działania różnych związków o potencjalnym działaniu przeciwnowotworowym na komórki psa, pozwalając na ocenę możliwości i sposobu zastosowania tych związków u wspomnianego gatunku zwierząt linia CLBL-1 może stanowić narzędzie do badań nad indukcją zewnątrzpochodnej ścieżki apoptozy stosowane w prezentowanym badaniu ustalone linie komórkowe chłoniaka i białaczki psa mogą służyć jako narzędzie do opracowywania nowych strategii terapeutycznych w przypadku oporności komórek nowotworowych na stosowane leczenie w związku z 19

a) konstytutywną aktywacją czynnika jądrowego NFkB, b) nadekspresją antyapoptotycznych białek z rodziny Bcl-2 Ponadto, wyciągnięto następujące szczegółowe wnioski: metotreksat wykazuje silne proapoptotyczne działanie w stosunku do komórek linii chłoniaka i białaczki psa, ze szczególnie silnym działaniem wobec komórek typu T inhibitor CDK, flawopirydol uwrażliwia komórki ustalonej linii chłoniaka psa CLBL- 1 na indukcję zewnątrzpochodnej ścieżki apoptozy pod wpływem działania ludzkiego ligandu TRAIL aromatyczne jodolaktony, stereoizomery 5-(1-jodoetylo)-4-(4'- izopropylofenylo)dihydrofuran-2-onu indukują proces apoptozy w ustalonych liniach komórkowych chłoniaka, białaczki i guza sutka psa, na drodze mitochondrialnej, kaspazo-zależnej ścieżki apoptozy, a siła przeciwnowotworowego działania zależna jest od konformacji optycznej badanych związków enancjomeryczne trans-5-(1-jodoetylo)-4-(2,5 -dimetylofenylo)dihydrofuran-2-ony o konfiguracjach: (4R,5S,6R)-1 i (4S,5R,6S)-2 powodują apoptozę komórek ustalonych linii chłoniaka i białaczki psa poprzez obniżenie poziomu ekspresji dwóch ważnych białek anty-apoptotycznych: Bcl-2 i Bcl-xL prawdopodobny mechanizm działania enancjomerów (4R,5S,6R)-1 i (4S,5R,6S)-2 związany jest z ich zdolnością do alkilowania białek w komórce Piśmiennictwo: Klahn, S. (2014) Chemotherapy safety in clinical veterinary oncology. Vet Clin North Am Small Anim Pract 44(5), 941-963. Pawlak, A., Obminska-Mrukowicz, B. and Rapak, A. (2013) The dog as a model for comparative studies of lymphoma and leukemia in humans. Postepy Hig Med Dosw 67, 471-480. Marconato, L., Gelain, M.E. and Comazzi, S. (2013) The dog as a possible animal model for human non-hodgkin lymphoma: a review. Hematol Oncol 31(1), 1-9. 20

Breen, M. and Modiano, J.F. (2008) Evolutionarily conserved cytogenetic changes in hematological malignancies of dogs and humans--man and his best friend share more than companionship. Chromosome Res 16(1), 145-154. Gauthier, M.J., Aubert, I., Abrams-Ogg, A., Woods, J.P. and Bienzle, D. (2005) The immunophenotype of peripheral blood lymphocytes in clinically healthy dogs and dogs with lymphoma in remission. J Vet Intern Med 19(2), 193-199. Morrison, W. (2010) Cancer chemotherapy: an annotated history. J Vet Intern Med 24(6), 1249-1262. Maiti, S., Manikandan, N., Shivakumar, M., Kumar, N., Saikumar, G. and Gupta, O. (2011) Therapeutic evaluation of methotrexate with or without cox-2 inhibitor in the management of canine mammary tumours. Indian Journal of Canine Practice Volume 3(2), 117. Pawlak, A., Rapak, A., Zbyryt, I. and Obminska-Mrukowicz, B. (2014) The effect of common antineoplastic agents on induction of apoptosis in canine lymphoma and leukemia cell lines. In Vivo 28(5), 843-850. Ito, D., Frantz, A.M. and Modiano, J.F. (2014) Canine lymphoma as a comparative model for human non-hodgkin lymphoma: recent progress and applications. Vet Immunol Immunopathol 159(3-4), 192-201. Turco, M.C., Romano, M.F., Petrella, A., Bisogni, R., Tassone, P. and Venuta, S. (2004) NFkappaB/Rel-mediated regulation of apoptosis in hematologic malignancies and normal hematopoietic progenitors. Leukemia 18(1), 11-17. Matsuda, A., Tanaka, A., Muto, S., Ohmori, K., Furusaka, T., Jung, K., Karasawa, K., Okamoto, N., Oida, K., Itai, A. and Matsuda, H. (2010) A novel NF-kappaB inhibitor improves glucocorticoid sensitivity of canine neoplastic lymphoid cells by up-regulating expression of glucocorticoid receptors. Res Vet Sci 89(3), 378-382. Price, G.S., Page, R.L., Fischer, B.M., Levine, J.F. and Gerig, T.M. (1991) Efficacy and toxicity of doxorubicin/cyclophosphamide maintenance therapy in dogs with multicentric lymphosarcoma. J Vet Intern Med 5(5), 259-262. Elders, R.C., Baines, S.J. and Catchpole, B. (2009) Susceptibility of the C2 canine mastocytoma cell line to the effects of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL). Vet Immunol Immunopathol 130(1-2), 11-16. Spee, B., Jonkers, M.D., Arends, B., Rutteman, G.R., Rothuizen, J. and Penning, L.C. (2006) Specific down-regulation of XIAP with RNA interference enhances the sensitivity of canine tumor cell-lines to TRAIL and doxorubicin. Mol Cancer 5, 34. Elders, R.C., Holder, A., Smith, K.C., Baines, S.J. and Catchpole, B. (2014) Recombinant canine IgE Fc and an IgE Fc-TRAIL fusion protein bind to neoplastic canine mast cells. Vet Immunol Immunopathol 159(1-2), 29-40. 21

Rong, S., Cai, J.H. and Andrews, J. (2008) Cloning and apoptosis-inducing activities of canine and feline TRAIL. Mol Cancer Ther 7(7), 2181-2191. Gładkowski, W., Skrobiszewski, A., Mazur, M., Gliszczyńska, A., Czarnecka, M., Pawlak, A., Obmińska-Mrukowicz, B., Maciejewska, G. and Białońska, A. (2016) Chiral δ-iodo-γlactones derived from cuminaldehyde, 2, 5-dimethylbenzaldehyde and piperonal: chemoenzymatic synthesis and antiproliferative activity. Tetrahedron: Asymmetry 27(6), 227-237. Albrecht, L., Wojciechowski, J., Albrecht, A., Wolf, W., Janecka, A., Studzian, K., Krajewska, U., Rozalski, M., Janecki, T. and Krawczyk, H. (2010) Synthesis and cytotoxic evaluation of b-alkyl or b-aryl-d-methyl-a-methylene-d-lactones. Comparison with the corresponding g-lactones. Eur J Med Chem 45(2), 710-718. Janecki, T., Albrecht, A., Warzycha, E., Studzian, K., Janecka, A., Krajewska, U. and Rozalski, M. (2005) Enantioselective synthesis and cytotoxic evaluation of 4,5-dihydro-5- [aryl(hydroxy)methyl]-3-methylidenefuran-2(3h)-ones. Chem Biodivers 2(9), 1256-1265. Wzorek, A., Gawdzik, B., Gładkowski, W., Urbaniak, M., Barańska, A., Malińska, M., Woźniak, K., Kempińska, K. and Wietrzyk, J. (2013) Synthesis, characterization and antiproliferative activity of β-aryl-δ-iodo-γ-lactones. J Mol Struct 1047, 160-168. Pawlak, A., Ziolo, E., Kutkowska, J., Blazejczyk, A., Wietrzyk, J., Krupa, A., Hildebrand, W., Dziegiel, P., Dzimira, S., Obminska-Mrukowicz, B., Strzadala, L. and Rapak, A. (2016) A novel canine B-cell leukaemia cell line. Establishment, characterisation and sensitivity to chemotherapeutics. Vet Comp Oncol 9(10), 1218-1231. Ola, M.S., Nawaz, M. and Ahsan, H. (2011) Role of Bcl-2 family proteins and caspases in the regulation of apoptosis. Mol Cell Biochem 351(1-2), 41-58. Meichner, K., Fogle, J.E., English, L. and Suter, S.E. (2016) Expression of apoptosisregulating proteins Bcl-2 and Bax in lymph node aspirates from dogs with lymphoma. J Vet Intern Med 30(3), 819-826. Konaklieva, M.I. and Plotkin, B.J. (2005) Lactones: generic inhibitors of enzymes? Mini Rev Med Chem 5(1), 73-95. Rosner, H., Torremante, P., Moller, W. and Gartner, R. (2010) Antiproliferative/cytotoxic activity of molecular iodine and iodolactones in various human carcinoma cell lines. No interfering with EGF-signaling, but evidence for apoptosis. Exp Clin Endocrinol Diabetes 118(7), 410-419. Thomasz, L., Oglio, R., Rossich, L., Villamar, S., Perona, M., Salvarredi, L., Dagrosa, A., Pisarev, M.A. and Juvenal, G.J. (2013) 6 Iodo-delta-lactone: a derivative of arachidonic acid with antitumor effects in HT-29 colon cancer cells. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids 88(4), 273-280. 22