Zagrożenia mikrobiologiczne przy aseptycznym rozlewie piwa

mgr inż. Elżbieta Żyrek Grupa Żywiec S.A. Zagrożenia mikrobiologiczne przy aseptycznym rozlewie piwa mikrobiologia przyczyny infekcji na rynku, zapobieganie ostatnich latach problem zagrożeń mikrobiologicznych piwa gotowego nabiera coraz większego W znaczenia i spędza sen z powiek wielu szefom produkcji i dyrektorom browarów. Browary, z małych lokalnych zakładów, stają się ogromnymi, produkującymi na szeroką skalę fabrykami. Pojawiające się od czasu do czasu infekcje na rynku dotyczą coraz większych partii produkcyjnych. Coraz bardziej skomplikowana logistyka (głównie systemy dystrybucyjne) oraz szeroko zakrojone akcje marketingowe wymuszają na browarach przedłużanie okresów przydatności piwa do spożycia do 6, 9 a nawet 12 miesięcy. Piwo trafia do ogromnej rzeszy klientów, którzy na podstawie jakości produktu wyrabiają sobie opinię o jego producencie i, albo są usatysfakcjonowani, albo łatwo przenoszą swoje zainteresowanie na produkty firm konkurencyjnych. Agro Przemysł 6/2008 23

Tab. 1. Bakterie psujące piwo Dawniej 80-90% wyprodukowanego piwa wypijane była w pierwszym miesiącu od daty rozlewu, a obecnie czas ten wydłużył się do 2-3 miesięcy. Piwa eksportowe stanowią osobny problem zanim dotrą do miejsca przeznaczenia mijają często 3-4 tygodnie. Infekcje mikrobiologiczne piwa, choć nieszkodliwe dla zdrowia człowieka, powodują zniszczenie, zepsucie produktu objawiające się zmętnieniem, natychmiast zauważalnym dla klienta, zakwaszeniem, występowaniem obcych, często bardzo nieprzyjemnych zapachów czy posmaków. Co istotne, infekcje dość rzadko wykrywane są przez laboratoria browarniane, a w zainfekowanej partii produkcyjnej, wypuszczonej na rynek, infekcja rozwija się zazwyczaj w czasie 3-6 tygodni od rozlewu, dając wspomniane powyżej efekty. Zrozumiały jest zatem niepokój managerów i podejmowanie przez nich słusznych, choć często trudnych decyzji o działaniach, ograniczających wszelkie zagrożenia mikrobiologiczne, nawet jeśli dla firmy wiąże się to ze zwiększonym nakładem finansowym. Gram-positive bacteria Gram-negative bacteria Rod-shaped Cocci Pediococcus Lactobacillus spp. spp. Lb. brevis P. damnosus Lb. brevisimilis P. dextrinicus Lb. buchneri P. inopinatus Lb. casei Lb. coryneformis Micrococcus sp. Lb. curvatus M. kristinae Lb. lindneri Lb. malefermentans Lb. parabuchneri Lb. plantarum Rod-shaped Cocci Pectinatus spp. Megasphaera sp. P. cerevisiiphilus M.cerevisiae P. frisingensis P. sp. DSM20764 Selenomonas sp. Zymomonas sp. S. lacticifex Z. mobilis Zymophilus sp. Z. raffinosivorans Skala zagrożeń W literaturze trudno znaleźć wiarygodne informacje dotyczące skali występowania problemu infekcji mikrobiologicznych produktu gotowego na rynku. Jest to o tyle oczywiste, że informacje takie są poufne, stanowią zagrożenie utraty dobrego wizerunku przez producenta oraz marek, produkowanych przez niego piw. Przykładem konsekwencji poniesionych w wyniku infekcji mikrobiologicznej może być opublikowany w 2001 roku głośny przypadek znanej firmy piwowarskiej z Danii. W wyniku infekcji bakteryjnej, która wpłynęła na smak piwa, ściągnięto z rynku 3 miliony puszek piwa, dyrektor generalny złożył dymisję a koszt, według własnych kalkulacji, wyniósł około 1 miliona euro. Znane jest mi wiele innych podobnych przypadków. Oceniam, iż w świecie, w każdym roku, problem infekcji mikrobiologicznej w piwie gotowym dotyka kilkanaście, a nawet kilkadziesiąt browarów, a całkowity koszt (ten łatwo policzalny i ten szacunkowy - utraty wiarygodności, udziału w rynku itp.) w każdym poszczególnym przypadku wynosi od kilkuset tysięcy do nawet kilku milionów euro. Drobnoustroje stanowiące główne zagrożenie dla piwa W 1995 roku prof. Back z Instytutu Weihenstephan w Niemczech opublikował zestawienie przedstawiające procentowy udział poszczególnych drobnoustrojów w reklamacjach z rynku, głównie niemieckiego. Z zestawienia tego wynika, iż w latach 1992-1993 większość infekcji w rynku, aż 85-90%, spowodowana była jedynie przez trzy drobnoustroje: Lactobacillus brevis, Lactobacillus lindneri i Pectinatus spp. W pozostałych przypadkach przyczynę reklamacji stanowiły takie drobnoustroje, jak: Pediococcus damnosus, Megasphera spp., Lactobacillus spp, drożdże dzikie z rodzaju Saccharomyces oraz inne, nieokreślone drobnoustroje. Wydaje się, że grupa groźnych dla piwa drobnoustrojów jest niewielka. Jednak lista drobnoustrojów psujących piwo jest znacznie dłuższa (tabela 1). Zachowanie się drobnoustrojów w piwie wynika z wyjątkowo trudnych, dla większości mikroorganizmów, warunków, jakie panują w piwie: niskie ph, obecność alkoholu, związki goryczy, często brak substancji odżywczych. Można wydzielić 4 typy zachowań drobnoustrojów w piwie (A, B, C, D), jak na wykresie 1. Wykres powstał na bazie moich doświadczeń, informacji z wielu browarów, obserwacji a także własnych badań. Typ A drobnoustroje po dostaniu się do piwa giną, Typ B drobnoustroje są w stanie przetrwać w piwie nawet przez kilka dni, ale nie mogą się w nim rozwijać i po pewnym czasie obumierają, Typ C drobnoustroje mogą rozmnażać się w piwie, ale tylko do pewnego momentu w wyniku niekorzystnych warunków czy braku pożywienia zaczynają obumierać. Brak widocznego zmętnienia, Typ D typowe drobnoustroje psujące piwo po dostaniu się do piwa zaczynają się rozmnażać, powodując po pewnym czasie widoczne zmętnienie. Czy wszystkie drobnoustroje psujące piwo zachowują się podobnie? Można powiedzieć, że tak wszystkie rosną w piwie i produkują metabolity swojej przemiany. Jak szybko nastąpi zepsucie/zmętnienie jest kwestią głównie dwóch parametrów: czasu i temperatury. Z praktycznego punktu widzenia, chcielibyśmy wiedzieć, jak szybko wyprodukowana przez nas partia piwa może dać objawy infekcji na rynku, jeśli już nie uda nam się zapobiec tej infekcji i dostanie się ona do określonej partii naszego piwa. Przeprowadzone przeze mnie w 2005 r. badania dają pogląd na kilka aspektów zachowania się tego samego drobnoustroju w tym samym piwie w różnych warunkach temperaturowych w zależności od stanu fizjologicznego komórek (młode a stare komórki), wcześniejszej adaptacji bądź braku adaptacji tych komórek do warunków piwa, początkowego poziomu infekcji oraz wpływu na nie stresu mechanicznego. Z badań tych wynika, iż wszystkie wymienione parametry wpływają na zachowanie się danego mikroorganizmu w piwie. W niniejszym opracowaniu przedstawiam zaledwie część wyników tych badań. Wykresy 2 i 3 oraz wykresy 4 i 5 przedstawiają szybkość wzrostu komórek Lactobacillus brevis w piwie (po wcześniejszej adaptacji do warunków piwa) w dwóch różnych temperaturach i przy różnym poziomie początkowym infekcji. W temperaturze optymalnej dla swojego wzrostu (30 o C) komórki L.brevis rosły w piwie niemal dwukrotnie 24 6/2008 Agro Przemysł

szybciej niż w temperaturze tylko o kilka stopni niższej (22 o C). Nawet jedna komórka L.brevis może spowodować zmętnienie w całej objętości piwa jest to tylko kwestią czasu i temperatury. Im wyższy początkowy poziom infekcji, tym szybciej, w danej temperaturze, nastąpi wzrost i w efekcie zmętnienie. Ocena ryzyka Ryzyko infekcji mikrobiologicznej zależne jest od układu linii rozlewniczej, a przede wszystkim od sposobu pasteryzacji piwa. Z badań wynika, iż do unieszkodliwienia większości drobnoustrojów szkodliwych dla piwa wystarcza nawet niewielka liczba jednostek pasteryzacji. Już pięć jednostek pasteryzacji eliminuje takie drobnoustroje, jak drożdże kulturowe, Lactobacillus brevis, L.coryniformis, L.casei, Pectinatus spp. Przy 14-15 jednostkach pasteryzacji nie przeżyje większość pozostałych drobnoustrojów psujących piwo, jedynie Lactobacillus lindneri wymaga do zniszczenia ok. 18 jednostek, a do 40 jednostek mogą przetrwać askospory niektórych dzikich drożdży oraz Micrococcus kristinae. W przypadku linii z pasteryzatorem tunelowym (rys.1) ryzyko wystąpienia infekcji w produkcie gotowym jest niewielkie pod warunkiem, że zapewnione zostanie sprawne funkcjonowanie pasteryzatora tunelowego. Nawet, jeżeli infekcja dostanie się do piwa, czy ostatecznie do butelki, na którymkolwiek z etapów poprzedzających pasteryzację jednostki pasteryzacji ją zniszczą. W przypadku linii z pasteryzacją przepływową (rys.2) ryzyko wystąpienia infekcji w produkcie gotowym jest wysokie, nawet jeżeli zapewnione zostanie sprawne funkcjonowanie pasteryzatora przepływowego. Odpowiednio spasteryzowane piwo, poprzez przewody piwne i układ napełniarki dostaje się do opakowania, a stąd kierowane jest do zamykarki. Jeżeli na którymkolwiek z tych etapów nastąpi infekcja (uszkodzone zawory, uszczelki, brudna instalacja, Wykres 1. Cztery typy zachowań drobnoustrojów w piwie Wykres 2 i 3. L.brevis, adaptacja w piwie, faza stacjonarna, wzrost w piwie, dwie różne temperatury, poziom początkowy ~200 komórek w 50 ml piwa Agro Przemysł 6/2008 25

Wykres 4 i 5. L.brevis, adaptacja w piwie, faza stacjonarna, wzrost w piwie, dwie różne temperatury poziom początkowy ~5 komórek w 50 ml piwa nie sterylne opakowanie, media, takie jak woda, CO 2, powietrze) nie ma żadnej możliwości, aby ją potem wyeliminować. W ten sposób zainfekowany produkt trafia na rynek. Jedyna nadzieja w laboratorium, które, być może, wykryje infekcję i odpowiednio szybko da sygnał do wstrzymania danej partii produkcyjnej Przyczyny infekcji na rynku Wyżej wspomniano o kilku źródłach infekcji mikrobiologicznych piwa gotowego. Jednak, nie samo źródło stanowi przyczynę wystąpienia infekcji na rynku musi zawieść jeszcze kilka innych czynników Przyczyny infekcji piwa gotowego na rynku można podzielić na dwie grupy: 1. Błędy browaru: techniczne defekty (zawory, uszczelki, płyty pasteryzatora, braki/błędy w automatyce, niehigieniczny projekt, martwe końce/punkty etc.), procesowe defekty (procedury mycia, procedury startu produkcji), media (woda, CO 2, powietrze), ogólna higiena, brak/niezbyt szybka reakcja na sygnały (np. przekroczone standardy). 2. Błędy laboratorium: niedoświadczona załoga, niewłaściwe podłoża, metody, zbyt niskie standardy, wielkość próby, sporadyczna kontrola zamiast regularnej. Każdą z tych przyczyn należałoby rozpatrzyć szerzej, indywidualnie dla każdego browaru. Kontrola mikrobiologiczna Jedynie właściwie opracowana, przemyślana i regularna kontrola mikrobiologiczna może wspomóc w zapobieżeniu infekcji, bądź w odpowiednio wczesnym jej wykryciu. Istnieje wiele źródeł infekcji, często unikatowych dla danego browaru. W zależności od źródła infekcji, zainfekowana partia produkcyjna może dotyczyć kilku opakowań produktu, kilku do kilkunastu godzin produkcyjnych bądź całych dni czy nawet tygodni produkcyjnych. Może być związana z jednym lub kilkoma gatunkami piwa rozlewanego na jednej lub kilku liniach produkcyjnych. Poniżej zasygnalizuję jedynie kilka problemów, związanych z kontrolą mikrobiologiczną: Czas jest naszym największym wrogiem we wszystkich standardowych metodach mikrobiologicznych musimy czekać na wynik aż 5 do 15 dni, a na jego potwierdzenie Rys. 1. Schemat linii z pasteryzacją tunelową 26 6/2008 Agro Przemysł

Rys. 2. Schemat linii z pasteryzacją przepływową mikrobiologia Podłoża Bakterie Rekomendowane przez MRS (de Man, Rogosa and Sharpe) LAB 1 EBC, ASBC, BCOJ Raka-Ray LAB, G(-) 2 EBC, ASBC, BCOJ VLB S7-S (Versuchs- und Lehranstalt für LAB EBC, BCOJ Brauerei in Berlin) HLP (Hsu s Lactobacillus and Pediococcus LAB EBC, BCOJ medium) WLD (Wallerstein Differential) LAB EBC, BCOJ Nakagawa LAB EBC, BCOJ drugie tyle czasu! Tylko w przypadku nielicznych browarów istnieje możliwość kwarantanny partii produkcyjnych do czasu uzyskania wyników mikrobiologicznych Drugi aspekt to stosowane przez nas podłoża mikrobiologiczne. Nie istnieje takie podłoże, które byłoby uniwersalne, w pełni satysfakcjonujące pod każdym względem, wykrywające wszystkie drobnoustroje psujące piwo. Z całego szeregu dostępnych na rynku podłóż od całej gamy dostawców (tabela 2) wybieramy zaledwie kilka, najbardziej, według nas, optymalnych, również pod kątem cenowym. I tu okazuje się, że taki np. Pectinatus, bezwzględny beztlenowiec, właściwie nie rośnie na żadnym z powszechnie przez nas stosowanych podłoży agarowych. Podobnie zachowanie - brak wzrostu, występuje w przypadku kilku nowych, znanych od zaledwie roku czy dwóch, mikroorganizmów psujących piwo, takich jak Lactobacillus backii, L.collinoides, L.rossiae. Należy wspomnieć o jeszcze jednym problemie, jakim są limity detekcji poszczególnych metod mikrobiologicznych. Piwo gotowe analizujemy przeważnie na podłożach agarowych, po uprzednim przefiltrowaniu 100-500ml próby na zestawie do filtracji membranowej. Limitującymi czynnikami w tej metodzie są zarówno maksymalna możliwa do analizy wielkość próby (w praktyce do 500ml), jak i samo podłoże agarowe, na którym 1 kolonia (1cfu) powstanie z 3-10 komórek drobnoustroju. Jak w takim przypadku możemy wykryć 1 komórkę drobnoustroju psującego piwo w np. 30L czy 50L kedze? Działania ograniczające zagrożenia mikrobiologiczne w trakcie rozlewu piwa W celu minimalizacji zagrożeń mikrobiologicznych w trakcie rozlewu piwa należy, przede wszystkim, przeprowadzić ocenę ryzyka dla każdej linii rozlewniczej oraz podjąć działania zapobiegawcze, takie jak: poprawa ogólnego stanu higieny, regularne przeglądy/remonty instalacji, SDA (Schwarz Differential Agar) LAB EBC, BCOJ Concentrated MRS G(-) EBC, BCOJ PYF (Peptone, Yeast extract and Fructose) G(-) EBC, BCOJ Thioglycolate Medium G(-) EBC LL-Agar G(-) EBC, BCOJ UBA (Universal Beer Agar) LAB, G(-) EBC, ASBC, BCOJ NBB (Nachweismedium für LAB, G(-) EBC, BCOJ bierschädliche Bakteriën) Brewer s Tomato Juice Medium LAB, G(-) ASBC LMDA (Lee s Multi-Differential Agar) LAB ASBC BMB (Barney-Miller Brewery Medium) LAB ASBC SMMP (Selective Medium for G(-) ASBC, BCOJ Megasphaera and Pectinatus) Tab. 2. Schemat linii z pasteryzacją przepływową 1 LAB, Lactic acid bacteria 2 G(-), Gram-negative bacteria 3 EBC, European Brewery Convention; ASBC, American Society of Brewing Chemists; BCOJ, Brewery Convention of Japan weryfikacja i kontrola efektywności procesów mycia i dezynfekcji, szkolenia operatorów w zakresie higieny i zagrożeń mikrobiologicznych, poprawa działań kontrolnych-laboratoryjnych: weryfikacja, standaryzacja planów kontroli, wprowadzenie nowych, łączenie obecnych metod, podłóż mikrobiologicznych, szkolenia mikrobiologów (mikroskopowanie, identyfikacja, interpretacja), wprowadzenie szybkich metod detekcji i testów identyfikacyjnych, np. Chemscan (AES-Chemunex), VIT-Beer (Vermicon), PCR, ATP. Agro Przemysł 6/2008 27

Literatura Back, W. (1981) Beer spoilage bacteria. Taxonomy of beer spoilage bacteria. Gram positive species. Monatsschr. Brau. 34:267-276. Back, W. (1987) Neubeschreibung einer bierschaedlichen Laktobazillen-Art. Lactobacillus brevisimilis spec. nov. Manatsshr. Brauwiss. 40:484-488. Back, W. (1994) Secondary contamination in the filling area. Brauwelt Int. 4:326-328. Back, W., Breu, S., and Weigand, C. (1988) Infektionsursachen im jahre 1987. Brauwelt. 178:1358-1362. Back, W., Leibhard, M., and Bohak, I. (1992) Flash pasteurizationmembrane filtration. Comparative biological safety. Brauwelt Int. 12:42-49. Chelack, B. J. and Ingledew, W. M. (1987) Anaerobic Gram-negative bacteria in brewing - a review. J. Am. Soc. Brew. Chem. 45:123-127. Chen, C., Chin, J. E., Kozumitsu, U. Clark, D. P., Pastan, I., Gottesman, M. M., and Fernandez, J. L. and Simpson, W. J. (1993) Aspects of the resistance of lactic acid bacteria to hop bitter acids. J. Appl. Bacteriol. 75:315-319. Fernandez, J. L. and Simpson, W. J. (1995a) Measurement and prediction of the susceptibility of lager beer to spoilage by lactic acid bacteria. J. Appl. Bacteriol.78:419-425. Funahashi, W., Suzuki, K., Ohtake, Y., and Yamashita, H. (1998) Two novel beer-spoilage Lactobacillus species isolated from breweries. J. Am. Soc. Brew. Chem. 56:64-69. Haikara, A. (1983) Immunological characterization of Pectinatus cerevisiiphilus strains. Appl. Environ. Microbiol. 46:1054-1058. Haikara, A. (1985a) Detection of anaerobic, gram-negative bacteria in beer. Monatsschr. Brauwiss. 38:239-243. Haikara, A. (1985b) Detection of Pectinatus contaminants in beer. J. Am. Soc. Brew. Chem. 43:43-46. Haikara, A. (1991) The genera Pectinatus and Megasphaera. In Balows, A., Truper, H. G., Haikara, A. and Lounatmaa, K. (1987) Characterization of Megasphaera sp. A new anaerobic beer spoilage coccus. Proc. Eur. Brew. Conv., Madrid. 473-480. Hammond, J. R. M. (1996) Brewing microbiology 100 years after Pasteur. Cerevisia Belg. J. Brew. Biotechnol. 21:59-62. Hammond, J., Brennan, M. and Price, A. (1999) The control of microbial spoilage of beer. J. Inst. Brew. 105:113-120. Hollerová, I. and Kubizniaková, P. (2001) Monitoring Gram positive bacterial contamination in Czech breweries. J. Inst. Brew. 107:355-358. Ingram, L. O. and Buttke, T. M. (1984) Effects of alcohols on microorganisms. Adv. Microb. Physiol., 25:253-300. Jespersen, L. and Jakobsen, M. (1996) Specific spoilage organisms in breweries and laboratory media for their detection. Int. J. Food Microbiology 33:139-155. Lawrence, D. R. (1988) Spoilage organisims in beer. In: R. K. Robinson (editor), Development in Food Microbiology. Elsvier, London, 1-48. Lee, S. Y. (1994) SMMP - A medium for selective isolation for Megasphaera and Pectinatus from the brewery. J. Am. Soc. Brew. Chem. 52:115-119. Lee, S. Y., Mabee, M. S., and Jangaard, N. O. (1978) Pectinatus, a new genus of the family bacteroidaceae. Int. J. Syst. Bacteriol. 28:582-594. Lee, S. Y., Mabee, M. S., Jangaard, N. O., and Horiuchi, E. K. (1980) Pectinatus, a new genus of bacteria capable of growth in hopped beer. J. Inst. Brew. 86:28-30. Nakakita, Y., Takahashi, T., Sugiyama, H., Shigyo, T. and Shinotsuka, K. (1998) Isolation of novel beer-spoilage bacteria from brewery environment. J. Am. Soc. Brew. Chem. 56:114-117. Nishikawa, N. and Kohgo, M. (1985) Microbial control in the brewery. MBAA T. Q. 22:61-66. Price, A. (1997) The occurrence and detection of Pectinatus and Megasphaera. BRFI Q. July:5-9. Priest, F. G. (1987) Gram-positive brewery bacteria. In Priest, F. G. and Cambell, I. (eds), Brewing Microbiology. Elsevier, London, 121-154. Priest, F. G. (1996) Gram-positive brewery bacteria. In Priest, F. G. and Cambell, I. (eds), Brewing Microbiology. 2nd eds. Chapman and Hall, London, 127-161. Sakamoto, K. (1997) Detection of the genus Pectinatus. Japanese Patent Application JP09-520359, World Patent Application WO97/20071, US Patent 5869642. Sakamoto, K. and Konings, W. N. Beer spoilage bacteria and hop resistance. Submitted to Int. J. Food Microbiology. Satokari R., Juvonen, R., von Wright, A., and Haikara, A. (1997) Detection of Pectinatus beer spoilage bacteria by using the polymerase chain reaction. J. Food Protect. 60:1571-1573. Schleifer, K. H., Leuteritz, M., Weiss, N., Ludwig, W., Kirchhof, G., and Seidel-Rüfer, H. (1990) Taxonomic study of anaerobic, Gram-negative, rod-shaped bacteria form breweries: Emended description of Pectinatus cerevisiiphilus and description of Pectinatus frisingensis sp. nov., Selenomonas lacticifex. sp. nov., Zymophilus raffinosivorans gen. nov., sp. nov., and Zymophilus paucivorans sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 40:19-27. Storgårds, E., Suihko, M. -L., Pot, B., Vanhonacker, K., Janssens, D., Broomfield, P. L. E., and Banks, J. G. (1998) Detection and identification of Lactobacillus lindneri from brewery environments. J. Inst. Brew. 104:47-54. Takahashi, N. (1983) Presumed Pectinatus strain isolated from Japanese beer. Bull. Brew. Sci. 28:11-14. The technical committee and the editorial committee of the American Society of Brewing Chemists. (1992) Microbiology. Microbiological Control. In Methods of Analysis of the American Society of Brewing Chemists, Eighth Revised Edition, with 1996 and 1999 supplements, American Society of Brewing Chemists, Minnesota,USA. Tholozan, J. L., Membré, J. M., and Grivet, J. P. (1997) Physiology and development of Pectinatus cerevisiiphilus and Pectinatus frisingensis, two strict anaerobic beer spoilage bacteria. Int. J. Food Microbiology 35:29-39. Tholozan, J. L., Membré, J. M., and Kubaczka, M. (1996) Effects of culture conditions on Pectinatus cerevisiiphilus and Pectinatus frisingensis metabolism: a physiological and statistical approach. J. Appl. Bacteriol. 80:418-424. 28 6/2008 Agro Przemysł