STABILNOŚĆ MIKROBIOLOGICZNA DOMOWYCH PIW NIEPASTERYZOWANYCH 1. Jan Jagodziński, Sylwia Dziągow, Małgorzata Krzywonos

Transkrypt

1 Acta Sci. Pol., Biotechnologia 15 (3) 2016, ISSN X (print) ISSN (on-line) STABILNOŚĆ MIKROBIOLOGICZNA DOMOWYCH PIW NIEPASTERYZOWANYCH 1 Jan Jagodziński, Sylwia Dziągow, Małgorzata Krzywonos Uniwersytet Ekonomiczny we Wrocławiu Streszczenie. Celem niniejszej pracy była ocena jakości mikrobiologicznej piwa domowego, tj. pod względem obecności i ewentualnego zanieczyszczenia bakteriami kwasu mlekowego z użyciem analizatora mikrobiologicznego BacTrac Stwierdzono, że piwo warzone w warunkach domowych jest wyrobem stabilnym mikrobiologicznie, a dłuższy czas przechowywania nie wpłynął na większą liczebność mikroorganizmów w produkcie. Uzyskany dobry poziom czystości mikrobiologicznej piwa domowego może gwarantować brak zmian sensorycznych w trakcie przechowywania, związanych z rozwojem szkodliwej mikroflory. Zaobserwowano jednak, że dłuższy czas przechowywania powodował występowanie zjawiska wypieniania piwa po otwarciu butelek na skutek autolizy drożdży. Wykazano, że w warunkach domowych możliwe jest wytwarzanie dobrego jakościowo piwa o unikalnych cechach organoleptycznych. Do wytwarzania produktu niezanieczyszczonego mikrobiologicznie konieczne jest zaznajomienie się z metodyką i etapami produkcji oraz przestrzeganie higieny pracy. Słowa kluczowe: piwo, domowe, niepasteryzowane, stabilność, mikrobiologiczna, BacTrac WSTĘP Jakość oraz unikatowe cechy smakowe i zapachowe są głównymi aspektami, przez które konsumenci coraz częściej rezygnują z piw komercyjnych z dużych koncernów, wybierając piwa rzemieślnicze lub domowe [Aquilani i in. 2015, Podeszwa 2015]. Aby zachować przewagę jakościową tego typu piw, nieodzowne jest utrzymanie czystości mikrobiologicznej oraz stosowanie wysokiej jakości surowców browarniczych. W przypadku produkcji piw rzemieślniczych w małych browarach możliwe jest stosowanie np. systemów Copyright by Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu Adres do korespondencji Corresponding author: Małgorzata Krzywonos, Uniwersytet Ekonomiczny we Wrocławiu, Katedra Inżynierii Bioprocesowej, ul. Komandorska 118/120, Wrocław, malgorzata.krzywonos@ue.wroc.pl

2 16 J. Jagodziński i in. CIP (ang. Clean In Place) oraz precyzyjne kontrolowanie warunków procesu produkcyjnego zgodnie z recepturą. Najczęstszymi źródłami zakażeń występujących w browarach są wady konstrukcji i montażu zbiorników, maszyn, urządzeń i rurociągów. Wspólnymi możliwymi zagrożeniami mikrobiologicznymi dla niepasteryzowanych piw rzemieślniczych i domowych są źle przeprowadzane procesy mycia i dezynfekcji. Ryzyko stanowią również zakażone uprzednio woda, powietrze lub inokulum, a także niewystarczająca higiena osób pracujących przy produkcie [Satora i Tuszyński 2004]. Większość zakażeń bywa wtórnych, czyli następujących po gotowaniu brzeczki z chmielem. Szczególną wagę należy więc przywiązywać do czystości wszelkich przedmiotów mających kontakt już od ochłodzenia brzeczki (np. przez stosowanie środków dezynfekujących, metalowe narzędzia przez opalenie nad płomieniem). W literaturze za główną niepożądaną mikroflorę występującą w piwie podaje się: bakterie kwasu mlekowego, paciorkowce, gronkowce, drożdże dzikie i grzyby [Esslinger i Narziss 2011, Lues i in. 2011, Kunze 1999, Satora i Tuszyński 2004]. Najbardziej niebezpieczne dla produkcji piwa są bakterie z rodzajów Lactobacillus i Pediococcus. Dwoma najważniejszymi gatunkami laseczek kwasu mlekowego są L. brevis oraz L. lindneri, natomiast z rodzaju ziarniaków najpowszechniej występujący był P. damnosus [Satora i Tuszyński 2004]. Kontrola jakości w browarach koncernowych może obejmować badania laboratoryjne i mikrobiologiczne. Piwowarzy domowi i rzemieślniczy mają mniejsze pole do weryfikacji najczęściej sprowadza się ona do oceny sensorycznej, która w znacznym stopniu zależy od wrażliwości smakowej piwowara. Ocena w tym przypadku obejmuje: zapach oraz smak, pienistość, barwę i klarowność. Zmiany danej cechy można więc przypisywać do różnych wad spowodowanych uchybieniami w procesie warzenia lub zakażeniami drobnoustrojów rozwijających się w warunkach brzeczki piwnej albo gotowego już piwa. W piwach niepasteryzowanych najgroźniejszymi, występującymi w około 20 30% przypadków, niepożądanymi drobnoustrojami są ścisłe beztlenowce z rodzaju Pectinatus spp. Objawami zakażenia tymi bakteriami są zmętnienie oraz zapach zepsutych jaj, którego trudno nie odnotować w razie wystąpienia infekcji [Satora i Tuszyński 2004]. Poza bakteriami silnie wpływającymi na obniżenie jakości piwa obecne mogą być też drożdże dzikie. Nie wszystkie z nich określane są jako szkodliwe, lecz obecność ich świadczy o występowaniu infekcji w procesie wytwarzania. Za najczęściej występujące Santora i Tuszyński [2004] wskazują rodzaje Saccharomyces, Candida, Torula, Hanseula, Klockera i Pichia. Jednym ze sposobów kontroli mikrobiologicznej wyrobów jest metoda impedymetryczna opierająca się na rejestracji zmian impedancji próbek, która przyjmuje inne wartości wraz ze wzrostem drobnoustrojów w czasie [Kroyer i Futschik 1997]. Wykorzystując selektywne podłoża mikrobiologiczne, możliwe jest określenie, czy po danym czasie detekcji i osiągniętej w nim wartości granicznej w badanym produkcie występuje liczba drobnoustrojów, przy której można mówić o produkcie zanieczyszczonym mikrobiologicznie. Sprawdzenia, czy warunki mogą sprzyjać rozwojowi mikroflory w piwie, można dokonać także w sposób pośredni przez pomiar kwasowości czynnej piw. Jako jeden z ważniejszych elementów środowiskowych Kunze [1999] wskazuje wartość ph w zakresie 4,7 4,8, która sprzyja rozwojowi szkodliwych drobnoustrojów. Za właściwą kwasowość czynną autor ten podaje poziom ph 4,3 4,6 [Kunze 1999]. Acta Sci. Pol.

3 Stabilność mikrobiologiczna domowych piw Celem niniejszej pracy była ocena jakości mikrobiologicznej piwa domowego, tj. stwierdzenie obecności i ewentualnego zanieczyszczenia bakteriami kwasu mlekowego z użyciem analizatora mikrobiologicznego BacTrac MATERIAŁ I METODY Materiały do badań Do badań wykorzystano dwa piwa domowe niepasteryzowane, wytworzone z użyciem suchych drożdży górnej fermentacji Saacharomyces cerevisiae M10 firmy Mangrove Jacks. Pierwsze oznaczone jako piwo 1 zostało poddane badaniu po 263 dniach od butelkowania, wytworzone ze słodu pilzneńskiego (Viking Malt) o ekstrakcie początkowym 12 Blg. Drugie piwo przygotowane z wykorzystaniem 40% słodu pale ale (Viking Malt) i 60% słodu monachijskiego (Viking Malt), o ekstrakcie początkowym 13 o Blg, zbadano po 64 dniach od zabutelkowania. METODY BADAŃ Przygotowano podłoże selektywne dla bakterii kwasu mlekowego BiMedia 630A [SY-LAB, Austria], roztwór soli fizjologicznej (0,9% NaCl). Roztwory autoklawowano (15 min, 121 C). Dokonano stosownych rozcieńczeń w zakresie od 10-1 do 10-7 badanych próbek piwa w 0,9% NaCl, przenoszono do sterylnych probówek z elektrodami (wyposażenie BacTrac 4300), z każdego rozcieńczonego roztworu piwa pobierano 0,5 ml i dodawano do 16 ml podłoża selektywnego BiMedia360A zgodnie z procedurą [SY-LAB 2011]. Następnie zakręcono szczelnie nakrętkami i przeniesiono do inkubatora BacTrac Inkubację prowadzono przez 48 h w 30 C zgodnie z wytycznymi producenta Bac- Trac 4300 [SY-LAB 2011]. Próbą kontrolną było sterylne podłoże selektywne BiMedia 630A bez dodatku piwa. Każdy proces prowadzono w 5 powtórzeniach, prezentowane wyniki są wynikami uśrednionymi. Obecność i wzrost drobnoustrojów oceniano poprzez zmiany impedancji podłoża M wyrażone w %. Jako graniczną wartość impedymetrycznego czasu detekcji świadczącym o obecności drobnoustrojów w badanej próbie, zgodnie z wytycznymi producenta, przyjęto wartość M powyżej 5%. WYNIKI Jako pierwsza próba zostało użyte piwo nr 1, którego rozcieńczenia zostały wykonane po 263 dobach od zabutelkowania. Inkubacja była prowadzona przez 48 h. Krzywe wzrostu zestawiono z próbą kontrolną, którą było sterylne podłoże selektywne BiMedia 630A, używane do hodowli. Można było zaobserwować fazę równowagi rozwoju drobnoustrojów już po około 40 h dla wszystkich rozcieńczeń (rys. 1). Piwo nr 1 wykazało obecność bakterii kwasu mlekowego (wzrost wartości M), lecz liczba ich nie wskazywała na to, by można było określić wyrób jako zanieczyszczony mikrobiologicznie. Po czasie reakcji 8 h zmiana impedancji medium (M) nie przekroczyła 5%, tj. progu wykrycia wskazanego przez producenta [SY-LAB 2011]. Ponadto czas reakcji sterylnego podłoża był Biotechnologia 15 (3) 2016

4 18 J. Jagodziński i in. tylko nieco dłuższy niż któregokolwiek rozcieńczenia produktu, co świadczy o czystości mikrobiologicznej wyrobu. Można zatem wnioskować, że mimo długiego czasu, jaki upłynął od zamknięcia opakowania, zawartość nie została zasiedlona przez bakterie kwasu mlekowego. Drugim z piw domowych poddanych badaniu mikrobiologicznego było oznaczone jako piwo 2, badane po 64 dobach od zabutelkowania. Wstępnie zostało ono uznane za możliwie zanieczyszczone mikrobiologicznie ze względu na wypienianie się zawartości po otwarciu butelki. Krzywe wzrostu drobnoustrojów zaprezentowano na rysunku 2. Dla żadnego stosowanego rozcieńczenia nie zaobserwowano przekroczenia 5% zmiany impedancji M w ciągu założonego czasu dla hodowli. Pomiary zmian impedancji M w analizatorze BacTrac 4300 (rys. 1 i 2) obrazują charakterystyczne krzywe rozwoju drobnoustrojów. Próba kontrolna bez dodatku piwa dawała podobny obraz jak i te zawierające piwo, można zatem wnioskować, że zarówno w próbie kontrolnej, jak i w próbach analizowanych nie wykazano obecności bakterii kwasu mlekowego w liczbach wskazujących na jego zanieczyszczenie mikrobiologiczne. Dodatkowym pomiarem, który miał na celu sprawdzenie, czy warunki rozwoju mikroflory mogą sprzyjać ich rozwojowi, był pomiar kwasowości czynnej piw. W żadnym z piw nie zaobserwowano wartości ph, przy których rozwijałyby się niepożądane drobnoustroje (tab. 1). Tabela 1. Wartości ph badanych piw Table 1. The ph of beer trials Nazwa próbki Trial name ph przed odgazowaniem ph before degasing ph po odgazowaniu ph after degasing Piwo nr 1 Beer no. 1 4,24 4,40 Piwo nr 2 Beer no. 2 4,33 4,46 DYSKUSJA Wielu autorów podkreśla że piwo jest jednym z bezpieczniejszych i oporniejszych na zanieczyszczenia mikrobiologiczne napojów [Kunze 1999, Sakamoto i Konings 2003, Satora i Tuszyński 2004]. Elementami stabilizującymi je są: etanol, substancje goryczkowe chmielu, ditlenek węgla, niskie ph, mała obecność tlenu oraz niewystarczające zawartości substancji odżywczych [Satora i Tuszyński 2004, Kordialik-Bogacka 2004]. Jednak jak wskazują przeprowadzone badania na obecność bakterii kwasu mlekowego, stwierdza się ich obecność w testowanych domowych piwach niepasteryzowanych, ale w liczbach nie powodujących psucia czy zakażenia. Dodatkowo krzywe (rys. 1 i 2) powinny charakteryzować się coraz to dłuższym czasem reakcji przy rosnącym rozcieńczeniu, czego nie potwierdziły wszystkie przeprowadzone próby. Powodem mogła być też obecność drożdży w próbkach piwa domowego, które mimo stosowania selektywnego podłoża mogły dawać zmiany impedancji. Acta Sci. Pol.

5 Stabilność mikrobiologiczna domowych piw Źródło: opracowanie własne Rys. 1. Krzywe zmian impedancji M piwa nr 1 dla różnych wartości rozcieńczenia. (PK próba kontrolna) Fig. 2. Impedance M changing in beer no. 1 for different dilutions. (PK control) Źródło: opracowanie własne Rys. 2. Krzywe zmian impedancji M piwa nr 2 dla różnych wartości rozcieńczenia. (PK próba kontrolna) Fig. 2. Impedance M changing in beer no. 2 for different dilutions. (PK control) Biotechnologia 15 (3) 2016

6 20 J. Jagodziński i in. W zadanym czasie odpowiedzi (48 h) nie przekroczono 5% granicznej wartości zmiany impedancji, nawet w produkcie o bardzo długim okresie przechowywania. Można więc stwierdzić, że liczba drobnoustrojów była na poziomie gwarantującym bezpieczeństwo mikrobiologiczne dla potencjalnych konsumentów. Objawem obniżającym jakość, zaobserwowanym w piwach domowych po dłuższym czasie przechowywania, jest jego wypienianie się po otwarciu butelek (tzw. gushing) (rys. 3). Jako dwie najważniejsze przyczyny takiego zachowania się produktu wymieniane są zakażenia mikrobiologiczne, w tym najczęściej zanieczyszczenie słodu grzybami z rodzaju Fusarium [Hippeli i Elstner 2002] oraz podwyższona zawartość niskocząsteczkowych polipeptydów [Blasco i in. 2011]. Obecność białka w piwie jest naturalna i określana na poziomie 500 mg/l [Blasco i in. 2011]. Jednak zawartość w piwie domowym żywych drożdży wpływa na zwiększenie tej zawartości w wyniku ich autolizy. Dochodzi do niej pod wpływem enzymów endogennych wewnątrz komórek po zakończeniu cyklu wzrostu, czego ostatnim etapem jest pęknięcie ściany komórkowej. Głównym związkiem uwalnianym przez rozpadające się komórki drożdżowe są właśnie białka o niskiej masie cząsteczkowej [Hernawan i Fleet 1995]. W trakcie przechowywania piw następuje stopniowy wzrost poziomu polipeptydów w piwie, co ostatecznie sprawia, że starsze wyroby ulegają zjawisku gushingu po odkapslowaniu butelki. Wynika to z własności hydrofobowych białek, przez co adsorbują one do powierzchni bąbelków ditlenku węgla [Blasco i in. 2011], wynoszone są ku górze po zmniejszeniu ciśnienia, tworząc pianę. Na podstawie danych literaturowych oraz obserwacji mikroskopowych (dane nieprezentowane) można stwierdzić, że prawdopodobną przyczyną wypieniania się starszego analizowanego piwa nr 1 była nadmierna zawartość białka, a nie zanieczyszczenie mikrobiologiczne. Potwierdziły to wartości zmian impedancji (rys. 1 i 2), pomiar odczynu piwa (tab. 1). W sposób amatorski rozlew przeprowadza się w warunkach, w których produkt ma kontakt z tlenem atmosferycznym. Jednakże jego wpływ na utlenianie się zawartości jest ograniczany przez zużywanie go przez rozmnażające się drożdże [Heitmann i in. 2015]. Dzięki otrzymanym po pewnym czasie beztlenowym warunkom eliminuje się kolejny z kryteriów, dzięki któremu mogłaby rozwijać się szkodliwa mikroflora. Piwo podlega zmianom chemicznym w trakcie przechowywania. Zależne są one od trzech czynników: rodzaju piwa, temperatury przechowywania oraz zawartości tlenu w opakowaniu [Vanderhaegen i in. 2006]. Dla konsumenta najważniejszymi zmianami, jakie zachodzą w trakcie starzenia piwa, są zmiany sensoryczne, które bezpośrednio wpływają na odbiór napoju. Z czasem maleje odczucie goryczki pochodzącej z chmielu, natomiast wzrasta odczucie aromatów i smaków słodkich oraz toffi pochodzących z użytego słodu. Następnie pojawia się smak określany jako kartonowy, pojawia się także specyficzny smak kojarzony z liśćmi czarnej porzeczki, lecz jest on przemijający [Vanderhaegen i in. 2006]. Ze względu na potrzeby, jakie spełniają piwa komercyjne i domowe, czas przechowywania jest ujęciem kluczowym. W wyrobach ze sklepowych półek, po które często sięgają osoby niewymagające i nieodczuwające większych różnic sensorycznych, występujące zmiany w czasie nie będą istotne. Analizując wyroby piwowarów domowych, najważniejsze okażą się właśnie te zmienne cechy. Dlatego zważając na ten aspekt i obecność żywych drożdży, okres od wytworzenia do konsumpcji takiego piwa nie powinien być nadmiernie długi. Acta Sci. Pol.

7 Stabilność mikrobiologiczna domowych piw Rys. 3. Wypienianie piwa domowego Fig. 3. Gushing of homemade beer Warto wspomnieć o korzyściach zdrowotnych z umiarkowanego spożycia piwa. W gronie prozdrowotnych elementów wchodzących w skład piwa wymieniane są najczęściej witaminy z grupy B oraz składniki mineralne (m.in. krzem, magnez i potas) [Kordialik-Bogacka 2004]. Stwierdzono także obecność związków polifenolowych [Kołota i in. 2014, Kordialik-Bogacka 2004]. Składnikami odżywczymi są głównie łatwo przyswajalne α i β-dekstryny, błonnik pokarmowy i niskocząsteczkowe peptydy [Kordialik-Bogacka 2004]. Konsumenci nie są często świadomi, że najważniejszymi cechami piwa są jego cechy organoleptyczne. Różnica występująca między piwami komercyjnymi a domowymi jest kluczowym aspektem jakościowym. Dzięki własnej produkcji można stworzyć własny wyrób o unikalnych cechach, których nie znajdzie się w tych oferowanych w produkcji koncernowej. WNIOSKI Na podstawie przeprowadzonych badań można sformułować następujące wnioski: Przeprowadzenie procesu wytwarzania piwa domowego w odpowiednich warunkach higienicznych skutkuje wyrobem stabilnym mikrobiologicznie, lecz z zawartością mikroflory bakteryjnej. Dłuższy czas przechowywania piwa domowego nie wpłynął na większą liczebność mikroorganizmów niepożądanych w produkcie. Uzyskanie dobrego poziomu czystości mikrobiologicznej może gwarantować brak zmian związanych z rozwojem szkodliwej mikroflory w opakowaniach jednostkowych. Warto jednak pamiętać o zjawisku autolizy i połączonego z nim wypieniania, które warunkuje czas, w którym napój po otwarciu zachowuje właściwe cechy konsumpcyjne. W warunkach domowych możliwe jest wytwarzanie dobrego jakościowo piwa. Biotechnologia 15 (3) 2016

8 22 J. Jagodziński i in. PIŚMIENNICTWO Aquilani B., Laureti T., Poponi S., Secondi L., Beer choice and consumption determinants when craft beers are tasted: An exploratory study of consumer preferences. Food Qual. Prefer., 41, Blasco L., Viñas M., Villa T.G., Proteins influencing foam formation in wine and beer: The role of yeast. Int. Microbiol., 14, Eßlinger H.M., Narziß L., Beer. IARC Monogr. Eval. Carcinog. Risks to Humans 100 C, Heitmann M., Zannini E., Arendt E.K., Impact of different beer yeasts on wheat dough and bread quality parameters. J. Cereal Sci., 63, Hernawan T., Fleet G., Chemical and cytological changes during the autolysis of yeasts. J. Ind. Microbiol., 14, Hippeli S., Elstner E.F., Are hydrophobins and/or non-specific lipid transfer proteins responsible for gushing in beer? New hypotheses on the chemical nature of gushing inducing factors. Z. Naturforsch. C. 57, 1 8. Lues J.F.R., Ikalafeng B.K., Maharasoa M., Shale K., Malebo N.J., Pool E., Staphylococci and other selected microbiota associated with indigenous traditional beer. African J. Microbiol. Res., 5, Kołota A., Oczkowski M., Gromadzka-Ostrowska J., Wpływ występujących w piwie związków polifenolowych na organizm przegląd literatury. Alcohol. Drug Addict., 27, Kordialik-Bogacka E., Fizjologiczne i żywieniowe znaczenie piwa. Zesz. Nauk. Chem. Spożywcza i Biotechnol. Politechnika Łódzka 69. Kroyer G.T., Futschik K., The Impedance-Splitting Method for Microbiologic Analysis of Food Preservatives. Biotech Lab Int. 2. Kunze W., Technologia piwa i słodu, 8. ed. PIWOCHMIEL Spółka z o.o., Warszawa. Podeszwa T., Browarnictwo rzemieślnicze (craft-brewing) oddolna aktywność mikrowytwórców stymulantem rozwoju rynku i samokształcenia w zakresie browarnictwa. Acta Innov. 15. Sakamoto K., Konings W.N., Beer spoilage bacteria and hop resistance. Int. J. Food Microbiol., 89, Satora P., Tuszyński T., Zakażenia mikrobiologiczne piwa. Lab. Ogólnopolski, 4, SY-LAB, Information on BiMedia 630A for detection of Beer Spoilling Bacteria. Vanderhaegen B., Neven H., Verachtert H., Derdelinckx G., The chemistry of beer aging a critical review. Food Chem., 95, Acta Sci. Pol.

9 Stabilność mikrobiologiczna domowych piw MICROBIOLOGICAL STABILITY OF HOMEMADE UNPASTEURIZED BEER Abstract. The aim of this text, was validation of microbiological quality of homemade beer presence and infected of lactic acid bacteria with using microbiological analyzer BacTrac Verified that, product brewed at home are stabile from the viewpoint of microbiology and long store time had no impact of microorganism strength. Good level of microbiological quality in homemade beer, influence to no organoleptic changes during storage. Though observed that long storing lead gushing phenomenon short time after open the bottle effect of yeast autolysis. Concluded that in home, are possibly preparing well quality beer with unique organoleptic properties, but necessary is basic knowledge of brewing, know how and microbiology rules. Key words: beer, homemade, unpasteurized, stability, microbiological, BacTrac Zaakceptowano do druku Accepted for print: Do cytowania For citation: Jagodziński J., Dziągow S., Krzywonos M., Stabilność mikrobiologiczna domowych piw niepasteryzowanych. Acta Sci. Pol. Biotechnol., 15 (3), Biotechnologia 15 (3) 2016

10