Zakażenia mikrobiologiczne piwa

Transkrypt

1 Zakażenia mikrobiologiczne piwa Paweł Satora, Tadeusz Tuszyński Katedra Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Technicznej Akademii Rolniczej w Krakowie Laboratorium-przegląd ogólnopolski 2004, 4, Piwo znane jest od zarania dziejów i uznawane było za stosunkowo bezpieczny pod względem mikrobiologicznym niskoalkoholowy napój, który charakteryzuje się wysoką stabilnością biologiczną. Dobra trwałość piwa jest wynikiem obecności alkoholu etylowego (0,5-10 % wag.), składników goryczkowych chmielu (od 17 do 55 ppm izo-α-kwasów), wysokiego stężenia dwutlenku węgla (około 0,5%), niskiego ph (3,8-4,7), niskiego poziomu tlenu (<0,1 ppm) oraz małej ilości substancji odżywczych tj. glukoza, maltoza i maltotrioza. Te ostatnie wykorzystywane są jako źródło węgla przez drożdże przeprowadzające proces fermentacji. Powyższe czynniki stanowią skuteczną ochronę przed różnymi patogenami, np. Salmonella typhimurium i Staphylococcus aureus, które zwykle nie mogą rozwijać się w piwie. Pomimo niekorzystnych dla wzrostu drobnoustrojów warunków panujących w piwie, istnieje kilka ich rodzajów, zdolnych do egzystowania w takim środowisku. Duża część tych mikroorganizmów może wywoływać zakażenia piwa, powodując wzrost zmętnienia oraz/lub niekorzystne zmiany sensoryczne, obniżając jakość produktu i narażając konsumenta na ewentualne zatrucia pokarmowe. Mikroorganizmy biorące udział w produkcji piwa Do produkcji klasycznego piwa używa się głównie słodu jęczmiennego, dobrej jakości wody pitnej, chmielu lub ekstraktów chmielowych oraz różnych szczepów drożdży. Podczas fermentacji wykorzystywane są monokultury Saccharomyces cerevisiae, które rozwijają się głównie na powierzchni brzeczki w kadziach fermentacyjnych, stąd ich zwyczajowa nazwa drożdże fermentacji górnej. Proces prowadzony jest w temperaturze C, a uzyskane w jego wyniku piwo, charakteryzuje się stosunkowo małą trwałością i jest podatne na zakażenia. Mnichów z Bawarii, uważa się za pionierów nowego systemu fermentowania brzeczki piwnej tzw. fermentacji dolnej. Bawarskie klasztory, jako pierwsze przechowywały piwo przez długi okres czasu w chłodnych piwnicach. Metoda ta spowodowała zmianę charakteru 1

2 szczepów drożdży browarniczych, które przeprowadzały fermentację w niskiej temperaturze C, a po jej zakończeniu gromadziły się na dnie kadzi. Piwo otrzymywane w ten sposób, nazwano lager. Obecnie drożdże piwowarskie fermentacji dolnej sklasyfikowane są jako osobny gatunek Saccharomyces pastorianus (syn. S. carlsbergensis), a lager jest najszerzej występującym piwem na świecie. W Belgii ważną częścią tradycji, są piwa otrzymywane w wyniku fermentacji spontanicznej (Lambic, Gueuze, Kriek) o wyraźnie kwaśnym smaku. Surowcami do produkcji piwa typu Lambic są: namoczony słód jęczmienny, pszenica, chmiel starzony o obniżonej goryczy i krystalicznie czysta woda. Fermentacja brzeczki odbywa się w beczkach dębowych z udziałem naturalnej mikroflory. Podczas fermentacji, która trwa od 6 do 24 miesięcy, wzrasta i obumiera wiele różnych szczepów drobnoustrojów. W pierwszym etapie fermentacji dominują bakterie z rodziny Enterobacteriaceae i drożdże Kloeckera, które rozkładają glukozę do etanolu, dwutlenku węgla i różnych kwasów. Następnie dofermentowują piwo różne szczepy z rodzaju Saccharomyces m.in. S. cerevisiae, S. bayanus, S. uvarum i inne. W końcowym etapie fermentacji przeważają bakterie mlekowe i octowe (dokwaszenie) oraz drożdże z rodzaju Brettanomyces, tworząc duże ilości estrów, nadają produktowi gotowemu niepowtarzalny aromat. Dojrzewanie piwa w butelkach jest wyjątkowo długie i trwa około 3 lata. Bakterie powodujące zakażenia piwa Piwo jest dość ubogim w składniki odżywcze i bardzo nietypowym środowiskiem dla większości mikroorganizmów. Zawiera między innymi związki goryczkowe chmielu, które są toksyczne, zwłaszcza dla bakterii Gram-dodatnich. Stężenie substancji odżywczych, takich jak sacharydy i aminokwasy, jest bardzo niskie, ponieważ większość tych związków została zużyta jest przez drożdże piwowarskie w czasie fermentacji. Jedynie kilka szczepów bakterii jest w stanie wzrastać w takich warunkach, powodując zakażenie piwa (tab.1). Wśród tej grupy mikroorganizmów występują gatunki zarówno Gram-dodatnie jak i Gram-ujemne. 2

3 Tabela 1. Bakterie odpowiedzialne za psucie się piwa Bakterie Pałeczki Ziarniaki Gram-dodatnie Lactobacillus spp. Lb. brevis Lb. brevisimilis Lb. buchneri Lb. casei Lb. coryneformis Lb. curvatus Lb. lindneri Lb. malefermentans Pediococcus spp. P. damnosus P. dextrinicus P. inopinatus Micrococcus sp. M. kristinae Lb. parabuchneri Lb. plantarum Pectinatus spp. P.cerevisiiphilus P. frisingensis Megasphaera sp. P. sp. DSM20764 M. cerevisiae Gram-ujemne Selenomonas sp. Zymomonas sp. S. lacticifex Z. mobilis Zymophilus sp. Z. raffinosivorans Niemal wszystkie Gram-dodatnie bakterie powodujące psucie się piwa należą do grupy bakterii kwasu mlekowego. Najbardziej niebezpieczne dla przemysłu browarniczego są rodzaje Lactobacillus i Pediococcus. W okresie od 1980 do 1990, większość (58-88%) wszystkich mikrobiologicznych przypadków skażenia piwa w Niemczech, było spowodowanych tymi drobnoustrojami. Podobna sytuacja ma miejsce w innych państwach, jednakże istnieje na ten temat mniej danych statystycznych. Bakterie kwasu mlekowego powodują jedwabiste zmętnienia piwa lub jego ciągliwość oraz nieprzyjemne zmiany sensoryczne tj. kwaśny lub maślany posmak na skutek tworzenia kwasu mlekowego i diacetylu. Lactobacillus brevis wydaje się być najważniejszym gatunkiem z tego rodzaju, wykrywanym często w piwie i browarach. Ponad połowę wszystkich skażeń bakteryjnych 3

4 piwa, powodowanych jest przez ten heterofermentatywny szczep o optymlanej temperaturze wzrostu 30 0 C i ph 4-6, który jest zwykle odporny na związki chmielowe. Jako drobnoustrój charakteryzujący się dużą zmiennością fizjologiczną, może powodować nadmierne odfermentowanie piwa, spowodowane zdolnością do fermentowania dekstryn i skrobi. Drugą ważną bakterią kwasu mlekowego, wywołującą wady piwa jest Lb. lindneri (15-25% wszystkich bakteryjnych zakażeń). Fizjologicznie jest bardzo podobna do poprzedniego gatunku, od którego odróżniana jest jedynie na podstawie sekwencjonowania 16S rrna. Lactobacillus lindneri jest bardzo odporna na składniki chmielu, najlepiej rozwija się w temperaturze C, jednak może przeżywać znacznie wyższe temperatury, niż inne bakterie mlekowe. Problemem jest również stosunkowo wolny wzrost Lb. lindneri na pożywkach identyfikacyjnych, podczas gdy w piwie rozwija się bardzo szybko. Inne gatunki Lactobacillus (buchneri, casei, coryneformis, curvatus i plantarum) są mniej rozpowszechnione w browarach, w stosunku do dwóch uprzednio omówionych. Lactobacillus buchneri bardzo przypomina Lb. brevis, różni się jednakże zdolnością do fermentowania melecytozy. Dodatkowo niektóre szczepy Lb. buchneri wymagają do swojego wzrostu ryboflawiny. Natomiast Lactobacillus casei może wytwarzać diacetyl, który nadaje piwu niekorzystny maślany posmak. Związek ten charakteryzuje się znacznie silniejszym aromatem, niż kwas mlekowy, najważniejszy produkt końcowy produkowany przez bakterie mlekowe. Spowodowane jest to niższym progiem wyczuwalności diacetylu (0,15 ppm), podczas gdy dla kwasu mlekowego kształtuje się on na poziomie 300 ppm. Diacetyl jest tworzony również podczas normalnej fermentacji przez drożdże, a jego zbyt duże ilości mogą powstawać w czasie procesu dojrzewania piwa z nadmierną ilością komórek drożdżowych. Przedstawiciele rodzaju Pediococcus, są bakteriami homofermentatywnymi rosnącymi w parach lub tetradach. Zakażone ziarniakami piwo, wyróżnia się wysoką kwasowością oraz maślanym aromatem, a zjawisko to określane jest mianem choroby sarcinowej. Mikroorganizmy te spotykane są w różnych etapach procesu produkcji piwa, począwszy od brzeczki po gotowy wyrób. Kilka gatunków z rodzaju Pediococcus spp. była izolowana w browarach, najpowszechniej występował wśród nich P. damnosus. Bakterie te odpowiedzialne były za ponad 20% wszystkich zakażeń piwa w okresie od 1980 do 1987 roku. W ostatnich latach ilość przypadków skażenia piwa tymi drobnoustrojami zmalała do 3-4%. Ograniczenie występowania P. damnosus, spowodowane jest doskonaleniem warunków sanitarnych w browarach. Do ciekawostek należy fakt, że P. damnosus jest często wykrywany podczas fermentacji oraz w gotowym piwie, natomiast bardzo rzadko w drożdżach nastawnych. Dla kontrastu, odwrotna sytuacja ma miejsce u innych przedstawicieli 4

5 omawianego rodzaju Pediococcus inopinatus oraz P. dextranicus, które mogą rozwijać się w piwie o ph powyżej 4,0, jak również niższych stężeniach etanolu i związków pochodzących z chmielu. Zawartość tworzonego przez pediococci diacetylu w piwie, różni się w zależności od gatunku. Największe ilości tego związku produkuje P. damnosus, a znacznie mniejsze P. inopinatus, natomiast P. pentasauces nie wytwarza diacetylu. Oprócz bakterii mlekowych, również inny Gram-dodatni rodzaj bakterii Microccocus, może być odpowiedzialny za wady piwa. Przy niskim stężeniu etanolu i składników goryczkowych chmielu oraz ph powyżej 4,5, rozwija się Micrococcus kristinae który odpowiedzialny jest za tworzenie owocowego, nietypowego aromatu piwa. Micrococci są zwykle ścisłymi tlenowcami, jednakże M. kristinae toleruje także warunki beztlenowe. Kilka rodzajów bakterii Gram-ujemnych, również może powodować różne wady w piwowarstwie. Obecność hydrofobowych błon komórkowych, czyni te mikroorganizmy wyjątkowo odpornymi na związki goryczkowe chmielu. Tlenowe bakterie kwasu octowego tj. Gluconobacter spp. i Acetobacter spp. są dobrze znanymi organizmami niepożądanymi w browarach. Ich wpływ na produkcję piwa, został jednakże znacząco ograniczony ze względu na minimalną dostępność tlenu w czasie produkcji oraz napełnianie opakowań jednostkowych (rozlew). Równocześnie, zwiększyła się rola ścisłych beztlenowców z rodzaju Pectinatus, Megasphaera, Selenomonas, Zymomonas i Zymophilus. Rodzaj Pectinatus spp. jest obecnie uważany za najgroźniejsze bakterie odpowiedzialne za 20-30% wszystkich wad piwa, głównie niepasteryzowanego. Przez długi czas przedstawicieli tego rodzaju, mylono z rodzajem Zymomonas spp., ze względu na duże podobieństwo fizjologiczne. Pierwsze szczepy wyizolowane zostały w browarach (1971 rok), obecnie zaklasyfikowane są do dwóch gatunków: P. cerevisiiphilus i P. frisingensis. Naturalne środowisko występowania tych bakterii jest nadal mało znane. Bakterie Pectiantus spp. są pałeczkami z ukośnie usytuowanymi wiciami, które nie wytwarzają spor. Mikroorganizmy omawianego rodzaju, rozwijają się w pożywkach zawierających do 4,5% etanolu, w zakresie temperatur od 15 do 40 0 C (optimum 32 0 C), przy ph 3.5 do 6. Podczas wzrostu tworzone są stosunkowo duże ilości kwasów propionowego i octowego, a także bursztynowego, mlekowego oraz acetoiny. Najbardziej charakterystycznymi objawami obecności bakterii Pectinatus w piwie, jest silne zmętnienie oraz odrażający zapach zepsutych jaj, spowodowany kombinacją różnych kwasów tłuszczowych, siarkowodoru oraz merkaptanu metylu. Inne bakterie z rodzaju Megasphaera stają się również coraz większym zagrożeniem w browarach i są odpowiedzialne za 3 do 7% wszystkich wad piwa spowodowanych tą grupą 5

6 drobnoustrojów. Należą do nieprzetrwalnikujących, nieruchliwych, mezofilnych ziarniaków, występujących pojedynczo, w parach lub czasami w krótkich łańcuszkach. Obecnie rodzaj ten obejmuje dwóch przedstawicieli M. cerevisiae oraz M. elsdeni, przy czym tylko pierwszy może stanowić realne zagrożenie w piwowarstwie. Megasphaera cerevisiae preferuje warunki beztlenowe, rośnie w temperaturze 15 do 37 0 C z optimum w 28 0 C i przy ph powyżej 4.1. Wzrost hamowany jest przez stężenie etanolu powyżej 2.8%. Zakażenia piwa w przypadku tego drobnoustroju, objawiają się podobnym zmętnieniem, jak miało to miejsce u rodzaju Pectinatus. Tworzą siarkowodór, nadający piwu fekalny odór, jak również stosunkowo wysokie ilości kwasu masłowego oraz inne kwasy (octowy, izowalerianowy, walerianowy, kapronowy) i acetoinę. Oprócz omawianych dwóch rodzajów, również kilka innych bakterii Gram-ujemnych może stwarzać problemy przy produkcji piwa. Beztlenowiec Zymomonas spp. wykryty został w młodym piwie, do którego dodawany był cukier oraz w piwie typu ale. Zymomonas mobilis jest tolerującym tlen beztlenowcem, egzystującym przy ph powyżej 3,4 i stężeniu etanolu poniżej 10%, który wytwarza stosunkowo wysokie stężenia acetaldehydu i siarkowodoru. Jak dotychczas nie ma doniesień o zakażeniu tym mikroorganizmem piwa lager, co prawdopodobnie spowodowane jest selektywnymi właściwościami fermentacyjnymi Zymomonas - nie fermentuje maltozy, maltotriozy, fermentuje natomiast glukozę, fruktozę i sacharozę. Drożdże dzikie oraz grzyby pleśniowe w przemyśle piwowarskim Wzrost drożdży i innych mikroorganizmów grzybowych jest uzależniony przede wszystkim od warunków środowiska. Graniczne wartości ph dla ich rozwoju mieszczą się w szerokim zakresie od 1,5 do 9,0; a produkty, których ph zawiera się w przedziale 4,6-5,3 są kwalifikowane do tzw. grupy średniokwaśnych. Drożdże mogą stanowić około 40% ogólnej ilości zakażeń występujących w browarnictwie. Najczęściej infekcje piwa wywołują rodzaje Saccharomyces, Candida, Torula, Hansenula, Kloeckera i Pichia (tab.2). Nie wszystkie dzikie drożdże są szkodliwe dla piwa, jednak ich obecność podczas procesu technologicznego świadczy o istnieniu infekcji. Mogą one konkurować ze szczepami piwowarskimi, szczególnie wtedy gdy aktywność fizjologiczna tych ostatnich jest obniżona. Stwierdzono na podstawie badań, że dzikie drożdże charakteryzują się 1,5-2-krotnie krótszym czasem generacji i z reguły nie wykazują zdolności do flokulacji, co utrudnia proces 6

7 klarowania piwa. Mogą także wytwarzać różnego typu metabolity wpływające niekorzystnie na właściwości organoleptyczne piwa, naruszają jego równowagę biologiczną, obniżają trwałość (zmętnienia, osady i błonki na powierzchni) i modyfikują skład chemiczny. Szczepy drożdży dzikich wykazują zazwyczaj większą aktywność pektynoesterazy, niż czyste kultury drożdży piwowarskich i w związku z tym zwiększa się ilość metanolu w piwie. Skutkiem działania obcych drożdży jest też zmiana właściwości smakowo-zapachowych piwa, między innymi poprzez zwiększenie zawartości diacetylu związku stanowiącego przyczynę tzw. młodego smaku piwa oraz estrów, związków siarkowych i innych. Kilka gatunków z rodzaju Brettanomyces, Candida i Saccharomyces wytwarza związki fenolowe oraz estry i kwasy oddziaływujące niekorzystnie na jakość organoleptyczną piwa, nadając mu nietypowy smak owocowy, drożdżowy lub fenolowy, silną nieprzyjemną goryczkę, przykry zapach octu, a także cierpko-gorzki posmak. Tabela 2. Najczęściej występujące w piwowarstwie gatunki drożdży dzikich 7

8 Brettanomyces anomalus B. clausseni B. custersianus B. custersii B. lambicus Candida beechii C. ernobii C. humilis C. intermedia C. krusei C. norvegica C. oleophila C. parapsilosus C. sake C. solani C. stellata C. tenuis C. tropicalis C. vartiovaarai C. versatilis Cryptococcus laurentii Debrayomyces hansenii D. marama Dekkera bruxellensis Dekkera intermedia Filobasidium capsuligenum Hanseniospora uvarum Hsp. valbyensis Hsp. vineae Hansenula anomala Han. fabianii Han. subpelliculosa Han. saturnus Kluyveromyces marxianus Pichia farinosa P. fermentans P. guilliermondii P. membranaefaciens P. ohmeri P. onychis P. orientalis Rhodotorula rubra Saccharomyces cerevisiae S. bayanus S. diastaticus S. ellipsoideus S. exiguus S. logos S. pastorianus S. unisporus S. validus Schizosaccharomyces pombe Torulaspora delbrueckii Zygosaccharomyces bailii Zygosaccharomyces rouxii Drożdże dzikie mogą ponadto charakteryzować się aktywnością reduktazy azotanowej enzymu katalizującego redukcję azotanów do azotynów, które są jednym z prekursorów powstawania nitrozoamin. Wykazano, że obecność w piwie drożdży Hansenula anomala, Candida versatilis oraz Brettanomyces anomalus i Rhodotorula glutinis zwiększa zawartość nitrozoamin. Ich działalność prowadzi w konsekwencji do powstawania w piwie azotynów, a z nich z kolei N- nitrozwiązków substancji bardzo szkodliwych dla zdrowia człowieka. Szczególnie niebezpieczna jest dimetylonitrozoamina (DMNA) oraz diazometan i formaldehyd ze względu na rakotwórcze, mutagenne i embriotoksyczne działanie. Ich prekursorami mogą być azotany i azotyny, mocznik, aminokwasy, aminy i amidy oraz pestycydy. Dopuszczalna zawartość nitrozoamin w piwie wynosi 0,5 μg/dm 3, a w słodzie 5 μg/kg. W celu ograniczenia zawartości tych związków w piwie należy eliminować z przerobu na słód ziarna zapleśniałe i 8

9 zainfekowane, przestrzegać prawidłowych zasad suszenia słodu i czystości mikrobiologicznej całego procesu produkcji piwa. Tworzenie się nitrozoamin jest częściowo hamowane obecnością substancji redukujących w piwie, zwłaszcza polifenoli. Z kolei drożdże Saccharomyces diastaticus, które stanowią zakażenia w piwowarstwie, wytwarzają glukoamylazę enzym usuwający reszty glukozowe z amylodekstryn, przyczyniając się do nadmiernego odfermentowania piwa. Drobnoustroje te mogą rozwijać się zarówno w brzeczce jak i gotowym produkcie, gdzie najczęściej dostają się na skutek nieodpowiedniego odfermentowania ekstraktu resztkowego lub błędów popełnionych w czasie filtracji. Obecność drożdży dzikich podczas dojrzewania piwa, a także w napełnionych opakowaniach jednostkowych, powoduje zmętnienia i opalizację oraz wpływa niekorzystnie na jego skład chemiczny i stabilność. Należy jednak podkreślić, że np. siarczyny wytwarzane przez różne gatunki drożdży dzikich i szlachetnych mają określoną zdolność stabilizacji aromatu wskutek hamowania reakcji utleniania, co zapobiega tworzeniu się wolnych rodników. Tego typu związki mogą również wykazywać aktywność tzw. zmiatania wolnych rodników i zapobiegają ich łańcuchowym reakcjom, powodując lepszą trwałość piwa. Połączenie siarczynu z aldehydem mrówkowym i octowym hamuje powstawanie zmętnień i stęchłego zapachu w czasie przechowywania piwa. Duży problem stanowią drożdże o fenotypie killerowym, które mogą zabijać wrażliwe szczepy drożdży browarniczych i zastępować dobre odmiany produkcyjne. W następstwie brzeczka piwna jest niedostatecznie wykorzystana, a po fermentacji piwo charakteryzuje się niewłaściwym zapachem i smakiem. Omawiany problem jest szczególnie trudny do opanowania, ponieważ drożdże killerowe na ogół nie odróżniają się morfologicznie od kultur właściwych. Grzyby strzępkowe do procesu produkcji piwa mogą dostać się głównie ze źle przechowywanego słodu, wywołując nie tylko niekorzystny pleśniowy smak i zapach, który przechodzi do piwa, ale również wytwarzając niskocząsteczkowe metabolity, stwarzają zagrożenie dla zdrowia konsumentów. Do podstawowych rodzajów grzybów przechowalniczych należą Aspergillus spp. i Penicillium spp., które uważa się za producentów mykotoksyn. Związki te są potencjalnie szkodliwe i należy eliminować źródła ich powstawania. Zapleśniały jęczmień nie powinien być akceptowany przez słodownie. Należy jednak zwrócić uwagę, że niebezpieczna zawartość mykotoksyn mogłaby pojawić się dopiero przy silnym poroście pleśni. Równocześnie, tak wysoki poziom zakażenia pleśniami spowodowałby zahamowanie 9

10 kiełkowania ziarna. Etapami w których dochodzi do częściowej eliminacji mykotoksyn są: gotowanie brzeczki z chmielem i jej fermentacja. Na podstawie przeprowadzonych badań uważa się, że tylko od 2 do 7% początkowej ilości toksyn przechodzi do wyrobu gotowego. Innym niekorzystnym zjawiskiem, występowania podwyższonych ilości grzybów strzępkowych podczas słodowania, jest ich wpływ na zarodek ziarna. Nawet niewielki porost pleśnią hamuje kiełkowanie zarodka i może spowodować wytworzenie nietypowego profilu enzymatycznego, który przyczynia się do zwiększenia intensywności barwy piwa. Metabolity wtórne tj. polipeptydy i peptydoglukany produkowane w czasie słodowania, m.in. przez pleśnie z rodzajów Fusarium, Rhizopus, Aspergillus czy Penicillium, inicjują także niekontrolowany proces wypieniania się piwa (ang. gushing). Próby ograniczenia rozwoju mikroflory w czasie słodowania jęczmienia, obejmują wiele różnych działań m.in. stosowanie dodatku bakterii mlekowych jako mikroflory współzawodniczącej z mikroflorą szkodliwą lub drożdży Geotrichum candidum. Metody wykrywania i identyfikacji zakażeń piwa W poprzednich rozdziałach stwierdzono, że jedynie niektóre mikroorganizmy mogą stanowić potencjalne zagrożenie w browarach i powodować zakażenia piwa. Dla zapewnienia stałej jakości produktu gotowego, na bieżąco powinna być prowadzona kontrola mikrobiologiczna surowców w poszczególnych etapach produkcji piwa. Większość oznaczeń ilościowej i jakościowej zawartości bakterii, drożdży i grzybów strzępkowych, w piwowarstwie opiera się na ich charakterystyce fizjologicznej. Bazując na badaniach taksonomicznych opracowano szereg selektywnych podłoży do analizowania poszczególnych grup drobnoustrojów mogących się pojawić w browarach. Tabela 3. Podłoża selektywne do wykrywania zakażeń bakteryjnych piwa Podłoże Grupa Rekomendowane bakterii przez 3 EBC, ASBC, MRS (de Man, Rogosa i Sharpe) LAB 1 BCOJ EBC, ASBC, Podłoże Raka-Ray LAB, G(-) 2 BCOJ VLB S7-S (Veruchs- und Lehranstalt fur Brauerei in Berlin) LAB EBC, BCOJ HLP (podłoże Hsu s Lactobacillus i Pediococcus) LAB EBC, BCOJ 10

11 WLD (Wallerstein Differential) LAB EBC, BCOJ Nakagawa LAB EBC, BCOJ SDA (Schwarz Differential Agar) LAB EBC, BCOJ Skoncentrowane podłoże MRS G(-) EBC, BCOJ PYF (pepton, ekstrakt drożdżowy, fruktoza) G(-) EBC, BCOJ Agar tioglikolanowy G(-) EBC LL-Agar G(-) EBC, BCOJ UBA (Universal Beer Agar) G(-) EBC, BCOJ NBB (Nachweismedium für bierschädliche Bakterien) LAB, G(-) EBC, BCOJ Brewer s Tomato Juice Medium LAB, G(-) ASBC LMDA (Lee s Multi-Differential Agar) LAB ASBC BMB (Barney-Miller Brewery Medium) LAB ASBC SMMP (Selective Medium for Megasphaera i Pectinatus) G(-) ASBC, BCOJ 1 LAB bakterie kwasu mlekowego 2 G(-) bakterie Gram-ujemne 3 EBC Europejska Konwencja Browarnicza; ASBC Amerykański Związek Chemików Browarników; BCOJ Japońska Konwencja Browarnicza Do izolacji, a także oznaczeń ilościowych mikroorganizmów, wykorzystywana jest najczęściej metoda płytkowa (Kocha). Stosowane są tutaj różne podłoża selektywne, propagujące wzrost jednej grupy mikroorganizmów, przy jednoczesnym hamowaniu innych. W tabeli 3 przedstawiono niektóre podłoża zalecane do wykrywania zakażeń bakteryjnych w piwowarstwie. Należy zwrócić uwagę, że żadne z podanych mediów, nie są odpowiednie do wykrycia wszystkich szczepów drobnoustrojów, stąd też zalecane są ich różne kombinacje. Niektóre podłoża zawierają cykloheksimid (aktidion) powstrzymujący rozwój tlenowców (drożdże, pleśnie) w oznaczeniach bakterii oraz drożdży browarniczych analiza drożdży dzikich i grzybów strzępkowych. Konwencjonalne metody wykrywania mikroorganizmów, oparte na ich hodowli, obarczone są jednak podstawową wadą wymagają długiego czasu hodowli. W konsekwencji, analizowany produkt, trafia do sprzedaży zanim uzyska się wyniki badań mikrobiologicznych. Innym problemem jest wspomniana już stosunkowo niska specyficzność w stosunku do poszczególnych gatunków. Przykładowo, na podłożach służących do wykrywania zakażających bakterii kwasu mlekowego, bardzo dobrze rozwijają się również szczepy nieszkodliwe dla piwa tj. Lactobacillus delbrueckii, czy też Pediococcus acidilactici. 11

12 W przypadku zwiększenia selektywności i dodatku specyficznych związków chemicznych, znacznie wydłuża się czas oznaczenia. W związku z powyższym, stosowane są dodatkowe metody identyfikacyjne. Poza podstawowymi testami tj. morfologia kolonii, morfologia komórek, barwienie metodą Grama, oznaczanie katalazy, zdolność zarodnikowania, wykonywane powinny być również testy biochemiczne, np. badanie zdolności fermentacyjnej, chromatograficzna analiza kwasów organicznych. Obecnie do wykrywania i klasyfikacji drobnoustrojów, wykorzystuje się również nowoczesne metody oparte na biologii molekularnej: oznaczenia immunologiczne z zastosowaniem przeciwciał poli- i monoklonalnych, hybrydyzacja DNA-DNA, sekwencjonowanie DNA, PCR (Polymerase Chain Reaction) oraz profil białkowy tzw. odcisk palca (ang. fingerprints). W ostatnich latach metody te są modyfikowane i stosowane na coraz szerszą skalę. Aby skutecznie eliminować zakażenia należy dokładnie rozpoznać ich źródła. Najczęstszymi przyczynami powodującymi trudności w utrzymaniu wysokiej higieny, na wszystkich etapach linii produkcyjnej są wady konstrukcji zbiorników, maszyn, urządzeń i rurociągów, ich montażu, a także źle przeprowadzane procesy mycia i dezynfekcji oraz woda, powietrze i pracownicy. Urządzenia browaru powinny być myte i wyjaławiane w sposób tak skuteczny (np. w systemie CIP clean in place), aby wszelkie zanieczyszczenia fizyczne i zakażenia mikrobiologiczne, były usuwane zgodnie z dobrymi zasadami higieny produkcji (GHP Good Hygenic Practice) lub szczegółowymi procedurami krytycznych punktów kontroli (HACCP Hazard Analysis and Critical Control Points). Tylko przy zachowaniu takich warunków, uzyskiwany produkt gotowy, charakteryzował się będzie wysoką jakością i spełniał coraz wyższe wymagania normatywne. LITERATURA 1. Campbell I Zakażenia grzybami w słodownictwie i piwowarstwie. Materiały III Szkoły Technologii Fermentacji, Wydawnictwo Akapit, Czajkowska D Szkodliwe mikroorganizmy w przemyśle piwowarskim. Przem. Ferment. Owoc.-Warzyw. 10, De Keersmaecker J The mystery of Lambic beer. Scientific American 8, Glover B The world encyclopedia of beer. Anness Publishing Limited, London. 12

13 5. Oberman H., Kręgiel D., Drewicz E Wpływ zakażeń mikrobiologicznych na cechy sensoryczne piwa szybkie metody identyfikacji zakażeń. Materiały VI Szkoły Technologii Fermentacji, Szczyrk, Wydawnictwo Akapit, Sakamoto K., Konings W.N Beer spoilage bacteria and hop resistance. Int. J. Food Microbiol. 89 (2-3), Tuszyński T., Makarewicz M Drożdże dzikie w przemyśle piwowarskim zagrożenia i wybrane metody wykrywania. Żywność nauka, technologia, jakość 3 (16), Tuszyński T., Poreda A Narodowe i regionalne napoje alkoholowe. Żywność nauka, technologia, jakość Supl. 3 (36),