Podstawowe strategie i narzędzia genetyki molekularnej

Czym jest inżynieria genetyczna? Ang. recombinant DNA manipulacje DNA in vitro } izolacja i amplifikacja DNA i cdna } mapowanie i sekwencjonowanie DNA } tworzenie nowych cząsteczek DNA } przez rekombinację cząsteczek naturalnych } przez syntezę de novo } wprowadzanie konstruktów DNA do komórek i organizmów } modyfikacje syntezy białek } ekspresja heterologiczna } bioinformatyka 2

A co nie jest inżynierią genetyczną? } Inżynieria embrionalna (np. klonowanie) } Tworzenie nowych form organizmów przez selekcję 3

Zastosowania } Badania podstawowe } Biotechnologia Granica między badaniami podstawowymi a stosowanymi jest płynna, stosowane techniki są podobne, różnice dotyczą głównie skali. 4

Podstawowe techniki } Izolacja DNA ze źródeł naturalnych } komórki i tkanki } mikroorganizmy hodowane w laboratorium i występujące naturalnie } antyczny DNA } obecnie do ok. 100 tys. lat } cdna izolacja RNA i przepisanie na DNA } Chemiczna synteza DNA de novo 5

PCR 6 2005 Prentice Hall Inc. / A Pearson Education Company / Upper Saddle River, New Jersey 07458

Elektroforeza DNA i RNA 2005 Prentice Hall Inc. / A Pearson Education Company / Upper Saddle River, New Jersey 07458 7

Hybrydyzacja } Wykorzystanie komplementarności kwasów nukleinowych do wykrywania określonej sekwencji DNA (Southern) lub RNA (northern) 8 2005 Prentice Hall Inc. / A Pearson Education Company / Upper Saddle River, New Jersey 07458

Hybrydyzacja northern } Podstawowa metoda badania poziomu ekspresji genu 9

Podstawowe techniki } Enzymy restrykcyjne } analiza fragmentów DNA (mapowanie) } klonowanie 10

Wektory } Umożliwiają utrzymanie DNA wprowadzonego do komórek (transformacja, transfekcja) } wektory autonomiczne zdolne do replikacji (np. plazmidy, wirusy) } wektory integracyjne } wektory ekspresyjne umożliwiają ekspresję wprowadzonego genu (autonomiczne lub integracyjne) } wektory kierujące rekombinacją (ang. targeting) integracyjne } wektory bifunkcjonalne 11

Typowy wektor } } } } Sekwencje zapewniające replikację (w. autonomiczne) Sekwencje umożliwiające odróżnienie komórek z wprowadzonym wektorem markery selekcyjne Miejsce do wstawienia klonowanego DNA linker Opcjonalnie sekwencje umożliwiające odróżnienie wektora ze wstawką od wektora pustego marker rekombinacji 12

Klonowanie molekularne } Włączenie danego fragmentu DNA (wstawki) do wektora autonomicznego 13

Przykłady zastosowań } Poznawanie sekwencji DNA (genów, genomów, mutantów) } Diagnostyka molekularna } Ekologia i filogenetyka molekularna } Heterologiczna ekspresja białek (dla celów poznawczych i biotechnologicznych) } Odwrotna genetyka inaktywacja wybranych genów u organizmów modelowych } Terapia genowa 14

Postęp techniczny } 1953 struktura DNA } 1977 sekwencjonowanie DNA (Nobel 1980) } 1987 pierwszy automatyczny sekwenator na rynku } 1995 pierwszy genom wolnożyjącego organizmu bakterii } Od 2004 sekwencjonowanie wysokoprzepustowe 15

Postęp techniczny } Koszt sekwencjonowania między 1999 a 2009 obniżył sie 14 000 razy } Prędkość odczytu sekwencji między 2000 a 2010 r. wzrosła 50 000 razy } Cel: sekwencja genomu jednej osoby za 1000$ osiągalny w ciągu kilku lat } Im więcej znamy sekwencji, tym łatwiej poznajemy kolejne 16

Sekwencjonowanie } Dideoksynukleotydy zatrzymują syntezę na określonych nukleotydach! Matryca 3 ATCGGTGCATAGCTTGT 5!! Produkty reakcji A 5 TAGCCACGTATCGAACA* 3! 5 TAGCCACGTATCGAA* 3! 5 TAGCCACGTATCGA* 3! 5 TAGCCACGTA* 3! 5 TAGCCA* 3! 5 TA* 3! 17

Tradycyjny odczyt sekwencji } Znakowanie radioaktywne, osobne reakcje A T C G 18 +

Sekwencjonowanie CGTAA CGTAAC CGTAACC CGTAACCC CGTAACCCT CGTAACCCTT CGTAACCCTTG CGTAACCCTTGG Obecnie stosuje się dideoksynukleotydy wyznakowane fluorescencyjnie każdy innym kolorem 19

Sekwencjonowanie automatyczne 20

Sekwencjonowanie wysokoprzepustowe } Tzw. deep sequencing } Generowanie w jednym przebiegu milionów niezależnych odczytów } Pojedyncze odczyty krótkie (25-400 bp) } Zastosowania } sekwencjonowanie nowych genomów } resekwencjonowanie } np. analiza zmienności } badanie ekspresji przez sekwencjonowanie cdna 21

Solexa 350 = Solexa Ultrahigh-throughput DNA Sequencing Platform 22

Pirosekwencjonowanie (454) Fragmenty DNA przyłączone do kulek (1 fragment na kulkę), następnie namnożone Kulki z DNA umieszczone w studzienkach Sekwencjonowanie przez syntezę: dodaje się kolejno 4 nukleotydy, gdy dodany nukleotyd komplementarny, to uwoniony pirofosforan daje reakcję z luminescencją Wynik: ~800,000 odczytów po 250-500 bp (~400 megabases) 23 The development and impact of 454 sequencing Jonathan M Rothberg & John H Leamon Nature Biotechnology 26, 1117-1124 (2008)

Solexa (Illumina) 24 Slides from http://www.illumina.com

Solexa (Illumina) 27 Slides from http://www.illumina.com Wynik: 80-100 milionów odczytów po ~50 bp (~4Gb)!

Genomika } Genomika jest dziedziną zajmującą się badaniem całych genomów (kompletu informacji genetycznej) różnych organizmów } Techniki biologii molekularnej + robotyka + informatyka } Sekwencjonowanie i charakteryzowanie genomów } Badanie funkcji zawartych w nich genów 28

Metagenomika } Izolacja DNA ze środowiska i sekwencjonowanie } Jedyny sposób badania mikroorganizmów, które nie dają się hodować 29

Metagenomika } Analiza sekwencji całości DNA wyizolowanego ze zbiorowiska organizmów 30

Odkrycia dzięki sekwencjonowaniu } Tajemnicza UCYN-A } } } } } Sinica (cyjanobakteria) Niewielki genom (1,4mln par zasad, 1200 genów) Brak zdolności fotosyntezy, cyklu Krebsa, syntezy niektórych aminokwasów Zdolność asymilacji azotu Symbioza? tajemnicza ekologia 31

Metagenom jelita człowieka } projekt MetaHIT (Metagenomics of the Human Intestinal Tract) konsorcjum laboratoriów europejskich } pierwsze wyniki w 2010 } 124 osoby } 319 812 typowe geny z 89 genomów referencyjnych } w sumie 3 299 822 unikatowych ORF } 18 gatunków u wszystkich osób, 57 u >90% osób } Znaczące różnice między zdrowymi a chorymi na IBD (zespół jelita drażliwego) 32

57 najczęstszych genomów zróżnicowanie osobnicze Relative abundance of 57 frequent microbial genomes among individuals of the cohort. 33 JJ Qin et al. Nature 464, 59-65 (2010) doi:10.1038/nature08821

Różnice między składem gatunkowym mikrobiomu zdrowych i chorych JJ Qin et al. Nature 464, 59-65 (2010) doi:10.1038/nature08821 34

Genom człowieka 35

36 Craig Venter Francis Collins (NIH)

Czym jest znajomość genomu } Nie jest odczytaniem księgi życia } Sama sekwencja nie daje jeszcze zrozumienia, jak funkcjonują komórki } Ale jest niezwykle cennym narzędziem w badaniach } Sekwencja nie jest lekarstwem } Ale bardzo pomaga w zrozumieniu mechanizmów chorób i wynajdywaniu nowych terapii 38

Co to znaczy? TCACAATTTAGACATCTAGTCTTCCACTTAAGCATATTTAGATTGTTTCCAGTTTTCAGCTTTTATGACTAAATCTTCTAAAATTGTTTTTCCCTAAATGTAT ATTTTAATTTGTCTCAGGAGTAGAATTTCTGAGTCATAAAGCGGTCATATGTATAAATTTTAGGTGCCTCATAGCTCTTCAAATAGTCATCCCATTTTATACA TCCAGGCAATATATGAGAGTTCTTGGTGCTCCACATCTTAGCTAGGATTTGATGTCAACCAGTCTCTTTAATTTAGATATTCTAGTACATACAAAATAATACC TCAGTGTAACCTCTGTTTGTATTTCCCTTGATTAACTGATGCTGAGCACATCTTCATGTGCTTATTGACCATTAATTAGTCTTATTTGTTAAATGTCTCAAAT ATTTTATACAGTTTTACATTGTGTTATTCATTTTTTAAAAAATTCATTTTAGGTTATATGTATGTGTGTGTCAAAGTGTGTGTACATCTATTTGATATATGTA TGTCTATATATTCTGGATACCATCTCTGTTTCATGCATTGCATATATATTTGCCTATTTAGTGGTTTATCTTTTCATTTTCTTTTGGTATCTTTTCATTAGAA ATGTTATTTATTTTGAGTAAGTAACATTTAATATATTCTGTAACATTTAATGAATCATTTTATGTTATGTTTAGTATTAAATTTCTGAAAACATTCTATGTAT TCTACTAGAATTGTCATAATTTTATCTTTTATATACATTGATATTTTTATGTCAAATATGTAGGTATGTGATATTATGCACATGGTTTTAATTCAGTTAATTG TTCTTCCAGATGTTTGTACCATTCCAACATCATTTAAATCATTAAATGAAAAGCCTTTCCTTACTAGCTAGCCAGCTTTGAAAATCCATTCATAGGGTTTGTG TTAATATATTTTTGTTCTTTTTTTTCCTTTCTACTGATCTCTTTATATTAATACCTACTGTGGCTTTATATGAAGTCATGGAATAATACGTAGTAAGCCCTCT AACACTGTTCTGTTACTGTTGTTATTGTTTTCTCAGGGTACTTTGAAATATTCGAGATTTTATTATTTTTTAGTAGCCTAGATTTCAAGATTGTTTTGACGAT CAATTTTTGAATCAATTGTCAATATTTTTAGTAATAAAATGATGATTTTTGATTGGAAATACATTAAATCTATAAGCCAAATTGGAGATTATTGATATATTAA CAAAAATGAGTTTTCCAGTCCATGAATGTATGCACATTATAAAATTCATTCTTAAGTATGTCATTTTTTAAGTTTTAGTTTCAGCAGTATATGTTTGTTACAT AGGTAAACTCCTGTCATGGGGGTTAGTTGTACAGGTTATTTTATCATCCAGGCATAAAGCCCAGTACCCAGTAGTTATCTTTTCTGCTCCTCTCCCTCCTGTC ACCCTCCACTCTCAAGTAGACCCCAGTTTCTGTTGTTCTCTTCTTTGCATTAATGACTTCTCATCATTTAGATTGCACTTGTAAGTGAGAACAGGACGTATGT GGTTTTCTACTCCTGTGTTAGTTTGCTAAGGATAACCACCTCCATCTCCATCCATGTTCCCACAAAAGACATGATCTCCTTTTTTATGGCTGCATATTATTCC ATGGTATATATGTACCACATTTTCTTTATCCAATCTGTCATTGATGGACATTTAGGTTGTTTCCACATCATTGCCGTTGTAAATACTGCTGCAGTGAATATTC GTGTGTATGTCTTTATGGTAGAATGATTTATATTCCTCTGGGTATATTTCCAAGTAATGGGATGGTTGGGTCAAATGGTAATTCTGCTTTTAGCTTTTTGAGG AATTGCCATATTGCCTTTCACAACGGTTGAACTAATTTATACTCCCAAGAGTGTATAAGTTGTTCCTTTTTCTCTGCAACCTCGACATCACCTGTTATTTATG ACTTTTATATAATAGCCATTCTGCTGGTCTGAGATGGTATCTCATTATGATTTTGATTTGCATTTCTCTAATGCTCAGTGATATTGAGCTTGGCTGCATATAT GTCTTCTTTTAAAAATATCTGTTCATGTCCTTTGCCTAATTTATAACGGGGTTGTTTGTTTTTCTCTTGTAAATTTGTTTAAGTTCCTTATAGATTCTAGGTA TTAAACCTTTTTTCAGAGGCGTGGCTTGCAAATATTTTCTCCCATTCTATAGGTTGTCTGTTTATTCTGTTGATAGTTTCCCTTGCTGTGCAGAAGCTCTTAA CTTTAATTAGATCCGACTTGTCAATTTTTGCTTTGGTCGCAATTGCTTTTGATGTTATTGTCGTGAAATCTTTGCTAGTTCTTAGGTCCAGGATGATATTGCC CAAGTTGTCTTCCAGGGCTTTTATAATTTTGGATTTTACATTTAAGTCTTAATATATTTATTAAATTTGTTAGGGTTTCAGGATACAAGGACAATATAGCAGC AAACAATGTAAAAGTAAAATCTGAAAAATAATAGAAAACAGTTTAATTGAACACTTTACCATTATGTAATGCCCTTCTTTGTCTTTCCTGATCTTTGTTGGTT TGAAGTTCAAAAAAGACAAACTTAATGGTACAATAGGTATTGTAGATTTCAGGACTTTCTGTATAAAATATTTTGTATATATGAATAGATCATTTTTTATTTC CAGTCTTTAAACATTTTCTTAACATTTTCTTCTATTGCTTCACTTCACTCGCTAGGACCATCAGGACAGTGTTGAACAGAAATTGTCAGACTGATCATCACAA CTTTTTCTAGATTTTAGAAGGAAATTTTTCTTTATTTCAACATAAAGCAGCATGTTAATGCCAAGTTTTAATATGTGTTATCAGATTGAAATTTTTTTGTATA TTTCTACATTACCAAGAATTTTTAGCAAGAGTTTTTGTTGAGTTTTAATTTAAAAATCATTTGTTAATTTCATCTGATTTTTTTATTTCTCTTTTTACCTTAA GAGATTAAACTGACTACAGATTGAATATAAACAAACAAACAAACAAACAAAAACTCTAAAATGCTGTGGATCAACACCACTTAGTAATTTGTATACTTGGATT CAATTTGCTGAAATTTTGTTAGACATTTTTGCGTCGATATTTATGAGGGATGTTGATCTGTAAAAGTATTAAAATGCCTTTGACAGATAGTGTCACCATATAA AAAACTTTGAACAAAATCAGATTATATCACTGTGGATATTTCTATTTTGAACTAACTTAGATGATAATTTTAATCTATATCCTAGATGAACT 39 Mały fragment chromosomu 21

Co to znaczy? genomika funkcjonalna } Bez teorii ewolucji nie mielibyśmy możliwości poznania odpowiedzi na to pytanie } Odszukujemy geny podobne do genów już zbadanych } Możemy badać geny przez odwrotną genetykę tworzenie mutantów u organizmów modelowych } Porównując genomy możemy wnioskować o biologii organizmu 40

Odwrotna genetyka od genu do funkcji Genetyka tradycyjna Genetyka odwrotna Funkcja (mutacja, fenotyp) Gen (z sekwencji całego genomu) Klonowanie genu Inaktywacja genu Analiza sklonowanego genu Analiza uzyskanego fenotypu 41

Odwrotna genetyka inaktywacja przez rekombinację 42

Inaktywacja warunkowa 43

Odwrotna genetyka interferencja RNA Odkrycie roku 2002 regulacyjna rola małych RNA 44 Nagroda Nobla w dziedzinie medycyny 2006, za odkrycie mechanizmu interferencji RNA A. Fire i C. Mello

sirna - jak to działa? Efekt degradacja mrna 45 Hannon G.J.: RNA interference, Nature 418, July 11, 2002

Zastosowania sirna } Badanie funkcji genów ( odwrotna genetyka ) - szczególnie skuteczne u nicienia Caenorhabditis, ale działa też w komórkach owadów, ssaków i roślin } Hamowanie wybranych genów jako metoda leczenia (np. zwalczania wirusów czy nowotworów) przykład: obniżenie poziomu receptora LDL ( zły cholesterol ) u myszy 46

Ekspresja heterologiczna Wektor ekspresyjny 47 Oczyszczanie białka

Fuzje białkowe } Do sekwencji kodującej białko dołącza się inną domenę, np. ułatwiającą wykrycie i/lub oczyszczanie } } znaczniki epitopowe GFP (zielone białko fluorescencyjne) 48

Green Fluorescent Protein- Aequorea victoria 49

GFP 50

Lokalizacja mitochondrialna nadejsprymowanej hpnpazy-myc w komórkach HeLa. MitoTracker anti-c-myc Nałożenie wt hpnpaza -52 hpnpaza 51

Ekspresja heterologiczna w biotechnologii 52

Inżynieria przeciwciał leki przyszłości } W łańcuchach immunoglobulin obszary zmienne odpowiadają za rozpoznawanie różnych antygenów, obszary stałe nadają specyficzność gatunkową } Klonowanie i ekspresja genów kodujących przeciwciała jest alternatywnym sposobem ich uzyskiwania } Możliwe jest uzyskiwanie przeciwciał humanizowanych obszary zmienne z genu przeciwciała zwierzęcego wstawione między obszary stałe przeciwciała ludzkiego 53

Inżynieria przeciwciał Humanizowane i rekombinowane przeciwciała są stosowane w terapii np. nowotworów 54 http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/

Terapia genowa } Zastępująca wprowadzenie genu, którego defekt powoduje chorobę } } Trudności z opracowaniem wektorów i zapewnieniem ekspresji, zwłaszcza dla komórek nie dzielących się Stosowana dla chorób związanych z ekspresją genów w komórkach krwi (np. SCID gen ADA) i innych, które łatwo wprowadzić do organizmu (np. makrofagi choroba Gauchera) } Inaktywująca zmniejszenie ekspresji genu, którego ekspresja powoduje chorobę (np. nowotworową) } } 55 Technicznie łatwiejsze i bezpieczniejsze (sirna, modyfikowane oligonukleotydy) Ograniczone zastosowania, pacjent musi ciągle przyjmować kosztowne leki

Literatura } Allison rozdz. 8 i 9 } Brown rozdz. 2 6 56