Zarys biologii molekularnej genu. Replikacja i stabilność genomu

Transkrypt

1 Zarys biologii molekularnej genu Replikacja i stabilność genomu 1

2 Podstawowe strategie i narzędzia genetyki molekularnej

3 Czym jest inżynieria genetyczna? Ang. recombinant DNA manipulacje DNA in vitro } izolacja i amplifikacja DNA i cdna } mapowanie i sekwencjonowanie DNA } tworzenie nowych cząsteczek DNA } przez rekombinację cząsteczek naturalnych } przez syntezę de novo } wprowadzanie konstruktów DNA do komórek i organizmów } modyfikacje syntezy białek } ekspresja heterologiczna } bioinformatyka 3

4 A co nie jest inżynierią genetyczną? } Inżynieria embrionalna (np. klonowanie) } Tworzenie nowych form organizmów przez selekcję 4

5 Zastosowania } Badania podstawowe } Biotechnologia Granica między badaniami podstawowymi a stosowanymi jest płynna, stosowane techniki są podobne, różnice dotyczą głównie skali. 5

6 Podstawowe techniki } Izolacja DNA } cdna izolacja RNA i przepisanie na DNA } Chemiczna synteza DNA de novo } PCR } Klonowanie DNA } Mutageneza losowa i ukierunkowana } w tym wprowadzanie modyfikacji do genomu } Wykrywanie DNA, RNA i białek } Sekwencjonowanie 6

7 Sekwencjonowanie - postęp techniczny } Koszt sekwencjonowania między 1999 a 2009 obniżył sie razy } Prędkość odczytu sekwencji między 2000 a 2010 r. wzrosła razy } Cel: sekwencja genomu jednej osoby za 1000$ osiągalny w ciągu kilku lat } Im więcej znamy sekwencji, tym łatwiej poznajemy kolejne 7

8 Sekwencjonowanie wysokoprzepustowe } Tzw. deep sequencing } Generowanie w jednym przebiegu milionów niezależnych odczytów } Pojedyncze odczyty krótkie ( bp) } Zastosowania } sekwencjonowanie nowych genomów } resekwencjonowanie } np. analiza zmienności } badanie ekspresji przez sekwencjonowanie cdna 8

9 Solexa 350 = Solexa Ultrahigh-throughput DNA Sequencing Platform 9

10 Genomika } Genomika jest dziedziną zajmującą się badaniem całych genomów (kompletu informacji genetycznej) różnych organizmów } Techniki biologii molekularnej + robotyka + informatyka } Sekwencjonowanie i charakteryzowanie genomów } Badanie funkcji zawartych w nich genów 10

11 Metagenomika } Izolacja DNA ze środowiska i sekwencjonowanie } Jedyny sposób badania mikroorganizmów, które nie dają się hodować 11

12 Metagenomika } Analiza sekwencji całości DNA wyizolowanego ze zbiorowiska organizmów 12

13 RNA-seq

14 Co to znaczy? TCACAATTTAGACATCTAGTCTTCCACTTAAGCATATTTAGATTGTTTCCAGTTTTCAGCTTTTATGACTAAATCTTCTAAAATTGTTTTTCCCTAAATGTAT ATTTTAATTTGTCTCAGGAGTAGAATTTCTGAGTCATAAAGCGGTCATATGTATAAATTTTAGGTGCCTCATAGCTCTTCAAATAGTCATCCCATTTTATACA TCCAGGCAATATATGAGAGTTCTTGGTGCTCCACATCTTAGCTAGGATTTGATGTCAACCAGTCTCTTTAATTTAGATATTCTAGTACATACAAAATAATACC TCAGTGTAACCTCTGTTTGTATTTCCCTTGATTAACTGATGCTGAGCACATCTTCATGTGCTTATTGACCATTAATTAGTCTTATTTGTTAAATGTCTCAAAT ATTTTATACAGTTTTACATTGTGTTATTCATTTTTTAAAAAATTCATTTTAGGTTATATGTATGTGTGTGTCAAAGTGTGTGTACATCTATTTGATATATGTA TGTCTATATATTCTGGATACCATCTCTGTTTCATGCATTGCATATATATTTGCCTATTTAGTGGTTTATCTTTTCATTTTCTTTTGGTATCTTTTCATTAGAA ATGTTATTTATTTTGAGTAAGTAACATTTAATATATTCTGTAACATTTAATGAATCATTTTATGTTATGTTTAGTATTAAATTTCTGAAAACATTCTATGTAT TCTACTAGAATTGTCATAATTTTATCTTTTATATACATTGATATTTTTATGTCAAATATGTAGGTATGTGATATTATGCACATGGTTTTAATTCAGTTAATTG TTCTTCCAGATGTTTGTACCATTCCAACATCATTTAAATCATTAAATGAAAAGCCTTTCCTTACTAGCTAGCCAGCTTTGAAAATCCATTCATAGGGTTTGTG TTAATATATTTTTGTTCTTTTTTTTCCTTTCTACTGATCTCTTTATATTAATACCTACTGTGGCTTTATATGAAGTCATGGAATAATACGTAGTAAGCCCTCT AACACTGTTCTGTTACTGTTGTTATTGTTTTCTCAGGGTACTTTGAAATATTCGAGATTTTATTATTTTTTAGTAGCCTAGATTTCAAGATTGTTTTGACGAT CAATTTTTGAATCAATTGTCAATATTTTTAGTAATAAAATGATGATTTTTGATTGGAAATACATTAAATCTATAAGCCAAATTGGAGATTATTGATATATTAA CAAAAATGAGTTTTCCAGTCCATGAATGTATGCACATTATAAAATTCATTCTTAAGTATGTCATTTTTTAAGTTTTAGTTTCAGCAGTATATGTTTGTTACAT AGGTAAACTCCTGTCATGGGGGTTAGTTGTACAGGTTATTTTATCATCCAGGCATAAAGCCCAGTACCCAGTAGTTATCTTTTCTGCTCCTCTCCCTCCTGTC ACCCTCCACTCTCAAGTAGACCCCAGTTTCTGTTGTTCTCTTCTTTGCATTAATGACTTCTCATCATTTAGATTGCACTTGTAAGTGAGAACAGGACGTATGT GGTTTTCTACTCCTGTGTTAGTTTGCTAAGGATAACCACCTCCATCTCCATCCATGTTCCCACAAAAGACATGATCTCCTTTTTTATGGCTGCATATTATTCC ATGGTATATATGTACCACATTTTCTTTATCCAATCTGTCATTGATGGACATTTAGGTTGTTTCCACATCATTGCCGTTGTAAATACTGCTGCAGTGAATATTC GTGTGTATGTCTTTATGGTAGAATGATTTATATTCCTCTGGGTATATTTCCAAGTAATGGGATGGTTGGGTCAAATGGTAATTCTGCTTTTAGCTTTTTGAGG AATTGCCATATTGCCTTTCACAACGGTTGAACTAATTTATACTCCCAAGAGTGTATAAGTTGTTCCTTTTTCTCTGCAACCTCGACATCACCTGTTATTTATG ACTTTTATATAATAGCCATTCTGCTGGTCTGAGATGGTATCTCATTATGATTTTGATTTGCATTTCTCTAATGCTCAGTGATATTGAGCTTGGCTGCATATAT GTCTTCTTTTAAAAATATCTGTTCATGTCCTTTGCCTAATTTATAACGGGGTTGTTTGTTTTTCTCTTGTAAATTTGTTTAAGTTCCTTATAGATTCTAGGTA TTAAACCTTTTTTCAGAGGCGTGGCTTGCAAATATTTTCTCCCATTCTATAGGTTGTCTGTTTATTCTGTTGATAGTTTCCCTTGCTGTGCAGAAGCTCTTAA CTTTAATTAGATCCGACTTGTCAATTTTTGCTTTGGTCGCAATTGCTTTTGATGTTATTGTCGTGAAATCTTTGCTAGTTCTTAGGTCCAGGATGATATTGCC CAAGTTGTCTTCCAGGGCTTTTATAATTTTGGATTTTACATTTAAGTCTTAATATATTTATTAAATTTGTTAGGGTTTCAGGATACAAGGACAATATAGCAGC AAACAATGTAAAAGTAAAATCTGAAAAATAATAGAAAACAGTTTAATTGAACACTTTACCATTATGTAATGCCCTTCTTTGTCTTTCCTGATCTTTGTTGGTT TGAAGTTCAAAAAAGACAAACTTAATGGTACAATAGGTATTGTAGATTTCAGGACTTTCTGTATAAAATATTTTGTATATATGAATAGATCATTTTTTATTTC CAGTCTTTAAACATTTTCTTAACATTTTCTTCTATTGCTTCACTTCACTCGCTAGGACCATCAGGACAGTGTTGAACAGAAATTGTCAGACTGATCATCACAA CTTTTTCTAGATTTTAGAAGGAAATTTTTCTTTATTTCAACATAAAGCAGCATGTTAATGCCAAGTTTTAATATGTGTTATCAGATTGAAATTTTTTTGTATA TTTCTACATTACCAAGAATTTTTAGCAAGAGTTTTTGTTGAGTTTTAATTTAAAAATCATTTGTTAATTTCATCTGATTTTTTTATTTCTCTTTTTACCTTAA GAGATTAAACTGACTACAGATTGAATATAAACAAACAAACAAACAAACAAAAACTCTAAAATGCTGTGGATCAACACCACTTAGTAATTTGTATACTTGGATT CAATTTGCTGAAATTTTGTTAGACATTTTTGCGTCGATATTTATGAGGGATGTTGATCTGTAAAAGTATTAAAATGCCTTTGACAGATAGTGTCACCATATAA AAAACTTTGAACAAAATCAGATTATATCACTGTGGATATTTCTATTTTGAACTAACTTAGATGATAATTTTAATCTATATCCTAGATGAACT 14 Mały fragment chromosomu 21

15 Odwrotna genetyka od genu do funkcji Genetyka tradycyjna Genetyka odwrotna Funkcja (mutacja, fenotyp) Gen (z sekwencji całego genomu) Klonowanie genu Inaktywacja genu Analiza sklonowanego genu Analiza uzyskanego fenotypu 15

16 Odwrotna genetyka inaktywacja przez rekombinację 16

17 Myszy transgeniczne } Wprowadzanie nowych sekwencji do genomu } np. geny reporterowe } Delecje genów (knock-out) } Wprowadzanie mutacji punktowych

18 Myszy knock-out } Izolacja komórek ES (zarodkowe macierzyste) z blastocysty } Dawcą jest mysz szczepu białego } Modyfikacja i selekcja komórek ES z knock-out } Wprowadzenie zmodyfikowanych komórek do blastocysty myszy szczepu szaregu

19 Myszy knock-out } Blastocysty zawierające zmodyfikowane komórki ES wszczepia się myszy matce zastępczej

20 Myszy knock-out } Selekcja chimer z transgenem w linii płciowej

21 Nagroda Nobla 2007 } Mario R. Capecchi, Martin J. Evans, Oliver Smithies } Za opracowanie zasad wprowadzania specyficznych modyfikacji genowych u myszy za pomocą zarodkowych komórek macierzystych

22 Odwrotna genetyka interferencja RNA Odkrycie roku 2002 regulacyjna rola małych RNA 22 Nagroda Nobla w dziedzinie medycyny 2006, za odkrycie mechanizmu interferencji RNA A. Fire i C. Mello

23 Ekspresja heterologiczna Wektor ekspresyjny 23 Oczyszczanie białka

24 Fuzje białkowe } Do sekwencji kodującej białko dołącza się inną domenę, np. ułatwiającą wykrycie i/lub oczyszczanie } } znaczniki epitopowe GFP (zielone białko fluorescencyjne) 24

25 Ekspresja heterologiczna w biotechnologii 25

26 Inżynieria przeciwciał Humanizowane i rekombinowane przeciwciała są stosowane w terapii np. nowotworów 26

27 Terapia genowa } Zastępująca wprowadzenie genu, którego defekt powoduje chorobę } } Trudności z opracowaniem wektorów i zapewnieniem ekspresji, zwłaszcza dla komórek nie dzielących się Stosowana dla chorób związanych z ekspresją genów w komórkach krwi (np. SCID gen ADA) i innych, które łatwo wprowadzić do organizmu (np. makrofagi choroba Gauchera) } Inaktywująca zmniejszenie ekspresji genu, którego ekspresja powoduje chorobę (np. nowotworową) } } 27 Technicznie łatwiejsze i bezpieczniejsze (sirna, modyfikowane oligonukleotydy) Ograniczone zastosowania, pacjent musi ciągle przyjmować kosztowne leki

28 Pionierskie doświadczenia Griffiths Bakterie zawerają czynnik transformujący, zdolny do przekazania informacji z żywych bakterii do martwych Avery, McLeod, McCarthy Czynnikiem transformującym jest DNA 28

29 Materiał genetyczny } Materiałem genetycznym są kwasy nukleinowe } Materiałem genetycznym organizmów komórkowych jest kwas deoksyrybonukleinowy (DNA) 29

30 Budowa DNA DNA zbudowany jest z nukleotydów podwójna helisa DNA 30

31 Zasada komplementarności pozwala na replikację DNA 31 Na podstawie sekwencji jednej nici można jednoznacznie odtworzyć sekwencję nici komplementarnej 5 GATGTACTGATGACATA3 3 CTACATGACTACTGTAT5 5 GATGTACTGATGACATA3 3 CTACATGACTACTGTAT5

32 Centralna hipoteza ( dogmat ) DNA RNA BIAŁKO 32

33 Model semikonserwatywny replikacji 33

34 Inne modele replikacji Rozproszony Semikonserwatywny Konserwatywny 34

35 Doświadczenie Meselsona i Stahla 35

36 Doświadczenie Meselsona i Stahla 36

37 Etapy replikacji } Inicjacja } Elongacja } Terminacja 37

38 Inicjacja } Rozplecenie (topnienie) podwójnej helisy DNA 38 Inicjacja replikacji u bakterii

39 Inicjacja u Eukaryota 39

40 Elongacja 40

41 Replikacja małego genomu kolistego pętla D 41

42 Replikacja małego genomu kolistego rolling circle 42

43 Problem topologiczny Replikacja DNA postępując będzie generować naprężenia (superskręty) W DNA liniowym praktycznie nierozwiązywalne ze względu na upakowanie w komórce W DNA kolistym absolutnie nierozwiązywalne ze względu na brak wolnych końców 43

44 Problem topologiczny - topoizomerazy Topoizomeraza typu I wprowadza nacięcie w jednej z nici, przesuwa drugą nić przez przerwę i łączy końce Topoizomerazy typu II nacinają obie nici 44

45 Synteza DNA - polimeraza Synteza DNA (i RNA też) zawsze zachodzi przez dołączanie nowych nukleotydów do grupy OH na końcu 3 syntetyzowanej cząsteczki Substratem są trójfosforany nukleotydów, enzymem polimeraza (zależna od DNA polimeraza DNA) Polimeraza DNA potrafi dobudowywać nukleotydy do istniejącego łańcucha, nie potrafi rozpocząć syntezy 45

46 Startery 46

47 Prymaza U Eukaryota: kompleks pol α: podjednostki prymazy i polimerazy DNA Prymaza (polimeraza RNA zależna od DNA) syntetyzuje starter (RNA) dla polimerazy DNA, która go wydłuża. 47

48 Aktywności polimeraz DNA Synteza DNA Egzonukleaza 3-5 korekcja błędów 48 Egzonukleaza 5-3 naprawa uszkodzeń, usuwanie starterów

49 Problem nici nieciągłej Na nici nieciągłej trzeba co pewien odcinek ponawiać syntezę startera fragmenty Okazaki 49

50 Maszyneria replikacyjna 50

51 Maszyneria replikacyjna Topoizomeraza - usuwa naprężenia Helikaza (DnaB) - rozdziela nici SSB stabilizuje jednoniciowy DNA Prymaza syntetyzuje startery Polimeraza (-y) Ligaza skleja fragmenty 51

52 Widełki replikacyjne - topologia 52

53 PCNA } Proliferating Cell Nuclear Antigen } Kompleks białkowy w formie pierścienia przesuwającego się po nici DNA w czasie replikacji } Koordynuje różne etapy replikacji i syntezy DNA 53

54 Inne kompleksy białkowe } MCM Mini Chromosome Maintenance pierścień przesuwający się razem z widełkami replikacyjnymi } GINS (Go, Ichi, Ni, San; 5,1,2,3) pierścień współdziałający z MCM, przejście z fazy inicjacji do elongacji i utrzymanie elongacji GINS 54

55 Polimerazy bakteryjne PolIII (PolC) główny enzym replikacyjny, ma aktywność Exo 3-5 (korekta błędów), synteza do 1000 nt/s PolIII nie ma aktywności Exo5-3 PolI (PolA) ma dodatkowo aktywność Exo 5-3, usuwa startery i dokańcza syntezę, do 20 nt/s Ligaza łączy zsyntetyzowane fragmenty (nie jest polimerazą) 55

56 Polimerazy bakteryjne c.d. PolII (PolB) naprawa uszkodzonego DNA w fazie stacjonarnej PolIV i polv synteza DNA w fazie stacjonarnej (poliv) i przy znacznych uszkodzeniach genomu (polv) 56

57 Mutacje w polimerazach E. coli } PolI i polii mutacje nie są letalne, zwiększona wrażliwość na czynniki mutagenne (np. UV) } PolIII (i niektóre poli) mutacje letalne, badana przez mutanty warunkowe (np. termowrażliwe) 57

58 Polimerazy Eukaryota Pol α prymaza, wydłuża startery Pol β naprawa DNA Pol δ główny enzym replikacyjny Pol ε replikacja, kontrola cyklu kom., naprawa DNA Pol γ replikacja DNA w mitochondriach Polimerazy eukariotyczne nie mają aktywności Exo 5-3, startery RNA usuwają nukleazy FEN1, RnazaH i inne białka 58

59 Mutacje polimeraz eukariotycznych } U drożdży (przykłady) } } } } } POL1 (pol α) letalny, ts POL2 (pol ε) letalny, ts CDC2 (pol δ) letalny POL4 (pol β) zwiększona częstość rekombinacji i wrażliwość na mutageny MIP1 (pol γ) utrata funkcji mitochondrialnej, utrata mtdna } U człowieka } POLG (pol γ) mutacje powodują dziedziczoną autosomalnie chorobę mitochondrialną PEO -postępująca zewnętrzna oftalmoplegia (porażenie mięśni gałki ocznej) związana z uszkodzeniami mtdna opadanie powiek (ptosis), niezdolność do poruszania gałkami oczu, ogólne osłabienie mięśni, zaburzenia neurologiczne, 59

60 Dwie klasy polimeraz } O dużej wierności mało błędów, ale wrażliwe na uszkodzenia w matrycy } zatrzymują się w miejscu uszkodzenia } standardowe enzymy replikacyjne } O niskiej wierności więcej błędów, ale mniej wrażliwe na uszkodzenia matrycy } są w stanie kontynuować syntezę mimo uszkodzeń matrycy TLS (trans-lesion synthesis) } mechanizm umożliwiający dokończenie replikacji uszkodzonego DNA (zapobiega rearanżacjom genomu) 60

61 Rola PCNA } Ubikwitynacja i deubikwitynacja PCNA przełącza między replikacją TLS i wierną 61