GENOMIKA PROTEOMIKA METABOLOMIKA

Transkrypt

1 GENOMIKA PROTEOMIKA METABOLOMIKA TRANSKRYPTOMIKA Metody sztucznej rekombinacji DNA nie tylko umożliwiły powstanie nowych niezwykle użytecznych narzędzi do badania podstawowych mechanizmów funkcjonowania żywych komórek, lecz także przyczyniły się do rozwoju całkowicie nowych działów technologii. W niektórych przypadkach białka, a także żywe komórki uzyskane w wyniku manipulacji genetycznych zaczynają odgrywać ważną rolę w naszym życiu. Najbardziej spektakularnych przykładów dostarcza farmakologia i medycyna. Jednym z pierwszych białek, które dzięki zastosowaniu metod inżynierii genetycznej mogło być wytwarzane jako produkt handlowy, była ludzka insulina produkowana w komórkach bakterii E.coli. Jednak aby manipulacje genami były możliwe, konieczne było zdobycie wiedzy na temat ich sekwencji, funkcji i zmienności itp. Na przełomie XX I XXI wieku powstała nowa dziedzina nauki: GENOMIKA.

2 GENOMIKA Jest to nauka zajmującą się badaniem pełnych genomów czyli kompletnej informacji genetycznej danego organizmu. Jest kontynuacją powstałej w XX wieku genetyki molekularnej. Poznanie pełnych sekwencji DNA różnych organizmów otworzyło drogę do poszukiwania praw rządzących całymi genomami, niewykrywalnych na poziomie pojedynczych genów. Mapa genomu bakterii Bacillus Anthracis

3 Ważnym krokiem w tej dziedzinie był: Projekt Poznania Ludzkiego Genomu (ang. Human Genom Project) rozpoczęty w 1990 roku przez: Departament Energii USA (ang. U.S. Department of Energy) i Narodowy Instytut Zdrowia (ang. U.S. National Institutes of Health) które przeznaczyły na ten cel: 3 mld $ Do projektu należały następujące państwa: Chiny Francja Niemcy Japonia Wielka Brytania USA

4 Efekt: W 2000 roku opublikowano wstępny opis genomu człowieka; 14 kwietnia roku 2003 opublikowano dokument stwierdzający zakończenie sekwencjonowania 99% genomu z trafnością 99,99%; zakończenie badań planuje się na rok 2005;

5 Firmy wnoszące największy wkład w senkwencjonowanie ludzkiego genomu: Celera Genomics Applied Biosystems Perkin Elmer Millipore Agilent

6 Do tak szybkiego zakończenia projektu przyczynił się udział prywatnej korporacji Celera Genomics. Firma ta opracowała technikę szybkiego sekwencjonowania (ang. shotgun sequencing). Sprowadzała się ona do szatkowania całego DNA na drobne fragmenty i analizowania ich zawartości. Program komputerowy zbierał uzyskane kombinacje par komplementarnych w swojej pamięci. Dzięki wyszukiwaniu podobieństw możliwe stało się ponowne uporządkowanie pociętych genów w całość. Jednak w odróżnieniu od organizacji rządowych Celera Genomics postanowiła zablokować dostęp do odkrytych przez siebie sekwencji korzystając z prawa patentowego. Konkurencja pomiędzy naukowcami z żyłką do interesów oraz tymi finansowanymi z budżetu doprowadziła do ciekawej sytuacji. Naukowcy umówili się, że opublikują dane w lutym 2001 roku, ale w różnych czasopismach naukowych. Badacze z instytucji rządowych umieścili swój artykuł w Nature, a konkurencja z Celera Genomics w Science. Okazało się, że naukowcy poznali 90% genomu. Co ciekawsze praca obu zespół raczej się uzupełniała niż dublowała. Wynikało to, z innych technik badawczych.

7 Po tym, jak naukowcom udało się poznać pełną sekwencję ludzkiego genomu (czyli wszystkich genów człowieka) niektórym wydawało się, że osiagnęliśmy niebywały sukces i posiedliśmy nie tylko wiedzę o istocie funkcjonowania naszego organizmu, ale i potężne narzędzie walce z licznymi chorobami (rakiem, chorobą Alzheimera, Parkinsona itp.). To był jednak dopiero początek. Sama znajomość naszych genów niewiele daje. Istotą rzeczy jest poznanie białek, które są kodowane przez geny. To białka są podstawą funkcjonowania naszego organizmu. Bez nich nie mogą obejść się żadne procesy fizjologiczne. Białkami są np. enzymy trawiące pokarm, hemoglobina przenosząca tlen we krwi, bez białek nie mogą funkcjonować również same geny. Nic więc dziwnego, że w 2000 roku, kiedy widać już było rezultaty Projektu Poznania Ludzkiego Genomu, rozpoczęto kolejny: Projekt Poznania Ludzkiego Proteomu. Rozwija się nowa gałąź biologii molekularnej: PROTEOMIKA PROTEOMIKA

8 Nauka zajmująca się badaniem organizacji, składu oraz budowy ogółu białek organizmu (tzw. proteomu) Zadania proteomiki: 1. Analiza wzajemnego oddziaływania białek w komórce. 2. Wyjaśnienie roli białek w powstawaniu nowotworów. 3. Przewidywanie wyników leczenia białaczek. 4. Wczesne wykrywaniem nowotworów.

9 PROTEOMIKA Nauka zajmująca się badaniem organizacji, składu oraz budowy ogółu białek organizmu (tzw. proteomu) Zadania proteomiki: 5. Analiza wzajemnego oddziaływania białek w komórce. 6. Wyjaśnienie roli białek w powstawaniu nowotworów. 7. Przewidywanie wyników leczenia białaczek. 8. Wczesne wykrywaniem nowotworów.

10 Wszystko jednak wskazuje na to, że będzie to orzech trudny do zgryzienia. Genom zawierający kompletną informację genetyczną organizmu jest tylko zbiorem przepisów na syntezę białek, a to one przede wszystkim tworzą komórki oraz realizują większość ich zadań. O ile genów ludzkich jest stosunkowo niewiele, ok. 40 tys., o tyle liczba białek jest o dwa do trzech rzędów wielkości wyższa. Dodatkowo, proteom, czyli wszystkie białka organizmu, zmienia się w zależności od tkanki, stanu fizjologicznego, choroby, warunków w jakich organizm się znajduje. Inny jest proteom człowieka zdrowego, inny chorego. Co więcej: inny jest proteom człowieka przed i po śniadaniu! Sytuację komplikuje fakt, że techniki stosowane w proteomice - wymagają skomplikowanego i kosztownego sprzętu. Dwie podstawowe techniki proteomiczne to elektroforeza dwuwymiarowa (w skrócie 2D) oraz spektrometria masowa (MS). Zautomatyzowane urządzenie do elektroforezy dwuwymiarowej.

11 Kiedy izoluje się białka z tkanki, w efekcie otrzymuje się mieszaninę bardzo wielu białek, różniących się wielkością i właściwościami fizykochemicznymi. 2D polega na rozdziale tej mieszaniny w specjalnym żelu. Najpierw białka rozdziela się pod względem wielkości, a potem pod względem ich ładunku elektrochemicznego. W wyniku tych manipulacji otrzymuje się obraz wielu plamek, z których każda odpowiada jednemu białku. Jeżeli porównamy w ten sposób obraz białkowy tkanki człowieka zdrowego i cierpiącego na jakąś chorobę, to możemy odkryć białko "x" nie występujące w zdrowej tkance, natomiast obecne u pacjenta. To białko może być odpowiedzialne za chorobowe zmiany w komórce. Jeżeli takie białko zidentyfikuje się i zbada, to można będzie potem skonstruować lek, który zwiąże białko "x" i zahamuje jego zły wpływ lub możemy zadziałać wcześniej dzięki genomice i deaktywować gen kodujący to białko.

12 Typowy 2D żel, białek bakterii Halobacterium salinarum. Białka rozdzielone są względem ładunku od lewej do prawej (ph 4.0 z lewej strony żelu, ph 5.0 z prawej strony żelu). Białka rozdzielane są również pod względem wielkości od góry do dołu żelu. Te u dołu mają rozmiary rzędu 20 kd. Zielone i niebieskie strzałki wskazują białka, które zostały z powodzeniem zidentyfikowane.

13 Inne techniki wykorzystywane w badaniach genów i białek Dwuwymiarowa elektroforeza żelowa (2D GE) Chromarografia cieczowa (LC, HPLC) Spektrometria mas (MS) Techniki bioinformatyczne (białkowe bazy danych, zastosowanie programów do identyfikacji białek) Użycie radionuklidów (N15, O18), do identyfikacji proteomu Użycie znaczników chemicznych (ICAT i inne) Metody immunologiczne Sekwentatory DNA Krystalografia rentgenowska

14 Ważne jest również poznanie struktury przestrzennej białek. Klasyczną techniką używaną do tego celu jest krystalografia rentgenowska. Oczyszczone białka przekształcają się w kryształy, a następnie bombardowane są promieniami X. Analiza ugięcia tych promieni na poszczególnych atomach wchodzących w skład białka umożliwia ustalenie jego trójwymiarowej struktury. DO PROWADZENIA BADAŃ METODĄ KRYSTALOGRAFII RENTGENOWSKIEJ niezbędne są czyste kryształy wybranych białek. Na zdjęciu ukazany jest kryształ CD4 (białka służącego HIV jako brama wejściowa do limfocytów T), zamknięty w maleńkiej rureczce wewnątrz woskowej kulki. Kryształ naświetlany jest promieniami X w celu określenia trójwymiarowej struktury tworzących go cząsteczek białka.

15 Kolejne dziedziny, pochodne genetyki molekularnej, umożliwiające jeszcze głębsze i bardziej szczegółowe poznanie organizmów to METABOLOMIKA i TRANSKTYPTOMIKA METABOLOMIKA Nauka o całkowitej zawartości metabolitów w komórkach; o zamierzonych i niezamierzonych produktach organizmów genetycznie zmodyfikowanych. Opisanie ludzkiego metabolonu (zestawu wszystkich metabolitów) będzie jeszcze trudniejszym zadaniem niż opisanie genomu i proteomu, gdyż jest to zestaw milionów związków z różnych klas, m.in.: peptydów, lipidów, aminokwasów, węglowodanów. Zestaw wszystkich metabolitów METABOLON

16 Techniki analityczne wykorzystywane w metabolomice Spektrometria Mas (MS) Chromatografia Gazowa ze Spektrometria Mas (GC-MS) Spektrometria Mas z Transformacją Fouriera (FT-MS) Chromatografia Gazowa z detekcją Płomieniowo Jonizacyjną (GC-FID) Spektrometria Jądrowego Rezonansu Magnetycznego (NMR) Elektroforeza Kapilarna (CE) Dwuwymiarowa Chromatografia Cienkowarstwowa (2-D TLC) Spektrometria Ramana Wysokosprawna Chromatografia Cieczowa (HPLC)

17 TRANSKRYPTOMIKA Jest to dziedzina za pomocą, której określane jest miejsce i czas aktywności genów. Ideałem jest określenie naszego transkryptonu - ogółu cząsteczek mrna wyprodukowanych przez ludzkie komórki. Do rozpoznawania sekwencji mrna wykorzystuje się najczęściej jego zdolność do hybrydyzacji cdna. W ten sam sposób można określić np. aktywność określonych genów w komórkach nowotworowych.

18 Transkrypton byłoby to dynamiczne przejście między genomem, proteomem i fenotypem komórki. Regulacja ekspresji genów jest kluczowym procesem w adaptacji do zmian środowiskowych, a tym samym przetrwania organizmu. Wyjątkowo ważną techniką używaną w transkryptomice są mikroczujniki DNA, które umożliwiają oznaczanie ekspresji mrna praktycznie w każdym genie organizmu. Wciąż będziemy się dowiadywać o nowych niezwykłościach bioinżynierii: genetycznej, embrionalnej, wreszcie neuroinżynierii. Nowe dane przyniesie badanie pamięci, uczenia się, snu, emocji, języka (mowy). Być może pojawią się nowe możliwości sterowania tymi procesami, wspomagania ich. Medycyna, rolnictwo, hodowla zwierząt zaczną się zdecydowanie przenikać, uzupełniać, stopią się w jedną potężną biotechnologię.